雙著絲粒染色體半自動化分析估算輻射生物劑量專家共識

摘 要：雙著絲粒染色體（ dicentric chromosome， dic） 半自動化分析估算生物劑量已在國際上推廣應用10 余年，技術成熟度高，且國際原子能機構（ IAEA） 出版的技術報告和國際標準化組織發布的技術標準已推薦該方法估算劑量。但國內尚未有相關技術規范和標準。專家組結合國內30 余年基于dic 人工和半自動化分析估算生物劑量的實踐經驗，從dic 半自動化分析原理、主要技術內容、影響因素分析和實用舉例等方面給出dic 半自動化分析估算生物劑量的技術共識，其主要技術內容與現有GB/ T 28236 國家標準相比，具有明顯提升生物劑量估算效率，降低對專業人員技術熟練程度要求，更有利于推廣應用等優勢。而且dic 半自動化分析與人工分析一樣，可用于急性均勻、局部、遷延性照射和延遲采樣等不同輻射暴露場景下的受照劑量估算與重建。dic 半自動化分析估算生物劑量的推廣應用，可解決目前國內生物劑量估算很難滿足發生大規模核與輻射事故受照人員眾多時的醫學應急響應臨床分類診斷需要的“ 瓶頸” ，為進一步制定相關國家及行業標準提供技術支撐。

關鍵詞：電離輻射;雙著絲粒染色體;半自動化分析;生物劑量估算;專家共識

中圖分類號：R144. 1;TL73 文獻標識碼：A

在發生核與輻射事故時快速、高通量開展分類診斷和及時治療對減輕患者放射損傷甚至挽救患者生命至關重要，而生物劑量估算在及時發現并確認外照射急性放射損傷和臨床早期分類診斷過程中起著不可或缺的重要作用[1] 。外周血淋巴細胞染色體畸變特別是雙著絲粒染色體（dicentricchromosome，dic）指標作為國際學界公認的輻射生物劑量估算的“金標準”，已廣泛應用于包括1986年前蘇聯切爾諾貝利核電站事故、2011 年日本福島核電站事故以及國內外一系列輻射事故受照人員的生物劑量估算，為這些受照者的診斷和治療提供了準確的生物劑量資料[2] 。

國際上國際原子能機構（IAEA）于2011 年出版的技術報告[3] 和國際標準化組織（ISO） 發布的技術標準[4] 已推薦利用dic 半自動化分析估算劑量。目前國內生物劑量的估算仍然主要采用國家標準GB / T 28236—2011《染色體畸變估算生物劑量方法》[5] 推薦的方法估算劑量，需要進行全人工分析。該方法需要人工在顯微鏡下分析計數dic和著絲粒環（ring， r），并以每細胞dic+r 數估算生物劑量，不但費時費力、效率低，而且還需要經驗豐富的染色體畸變分析專業技術人員。一名有經驗的技術人員人工分析150 個細胞的染色體畸變至少需要3 h，而利用高通量染色體自動化掃描系統自動化檢測dic 只需要20 min，再進行人工復核便可很容易識別出真陽性dic 并剔除假陽性dic（平均2 min），從而較為快速準確地估算劑量[6] 。在此背景下，dic 半自動化分析不但可以大大提高生物劑量估算的效率，還更有利于推廣應用，凸顯優勢。

目前自動化檢測dic 的關鍵設備高通量染色體自動掃描系統已在全國職業病防治和核工業系統普遍配置，為開展快速、高通量估算生物劑量提供了基本條件。但國內尚未有相關技術規范和標準，結合國內和主要執筆者單位30 余年基于dic人工和半自動化分析估算生物劑量的實踐經驗，提出一項明確的雙著絲粒染色體半自動化分析估算生物劑量的專家共識，解決目前國內生物劑量估算的“瓶頸”問題，滿足發生大規模核與輻射事故受照人員眾多時的醫學應急響應臨床分類診斷需要，為進一步制定相關標準提供技術支撐，意義重大。

1 dic 半自動化分析估算生物劑量的原理和適用范圍

早在20 世紀80 年代，國際上就開始嘗試開發染色體畸變自動化分析系統。隨后，一些商業化的中期相掃描與核型分析軟件系統面市，并已經在許多細胞遺傳學實驗室中得到很好的應用。其工作原理和主要流程：首先中期細胞掃描儀對染色體標本進行自動化掃描;第二步將掃描檢測到的中期分裂相以數字化高分辨率中期相圖像格式自動捕獲;然后，對中期分裂相圖像進行詳細分析，以確定正常的染色體和候選的dic。所謂半自動化分析，就是自動化檢測到的候選dic 必須由有一定經驗的技術人員確認，但這比人工在顯微鏡下分析dic 簡便、高效得多[2-3] 。系統檢測到并標注的候選dic 很容易被區分確認，如圖1a 顯示的是真陽性dic，對于大多數假陽性的dic（如人為因素、重疊染色體）也很容易被排除，見圖1b[7] 。最后以每細胞dic 數為指標建立劑量-效應曲線，實現了基于dic 自動化分析的生物劑量估算半自動化，可用于發生大規模核與輻射事故時的生物劑量估算和臨床分類診斷。

本共識給出了電離輻射誘發人外周血淋巴細胞染色體畸變分析中的微量全血培養、標本制備、dic 半自動化分析，以及用其建立劑量-效應曲線和估算生物劑量的方法等，適用于一次比較均勻的全身外照射核與輻射事故受照人員的生物劑量估算，也適用于一次比較均勻的全身外照射復合燒傷受照人員的生物劑量估算。不適用于長期低劑量累積照射和內照射的生物劑量估算。

2 dic 半自動化分析估算生物劑量的主要技術共識

2. 1 主要儀器設備和試劑配制

2. 1. 1 常規儀器

包括用于接種細胞的超凈工作臺，用于培養細胞的恒溫培養箱，用于分離細胞的大容量普通水平式離心機，用于分析染色體畸變的光學顯微鏡（帶坐標刻度），用于低滲細胞的水浴箱，用于儲存實驗試劑具備-20 ℃ 和4 ℃ 條件的冰箱，用于靜脈血保存（18～24 ℃ ）的定制保存運輸箱等。

2. 1. 2 自動化儀器

可實現自動化中期相尋找、高倍圖像采集和dic 自動化分析的高通量染色體自動化掃描系統;用于收獲中期相細胞的自動化細胞收獲儀;用于染色體標本制備的自動化制片/ 滴片機;用于染色體標本染色的自動化染片機。

2. 1. 3 試劑配制

RPMI-1640 培養基、低滲液、固定液、磷酸鹽緩沖液和吉姆薩（Giemsa）染液的配制參照GBZ/ T248 標準[8] 推薦的方法，其中培養基可購買有產品注冊號的市售產品。

2. 2 外周靜脈血的采集、保存和運輸

擬合劑量-效應曲線時，采血樣前須獲取志愿者的知情同意。2 ～ 4 名健康成年人，非放射工作者，男女各半，年齡在18～60 歲，無煙酒嗜好，半年內無急慢性疾病史、無射線和化學毒物接觸史，近一個月內無病毒感染史。用真空肝素鈉或肝素鋰采血管，每人抽取靜脈血20 mL，顛倒混勻，用于離體照射和劑量-效應曲線的擬合。

估算生物劑量時，采集靜脈血約4 ～ 5 mL，肝素抗凝，顛倒混勻，靜脈血保存和運輸最佳溫度是18～24 ℃ ，24 h 內送達實驗室為宜。

2. 3 照射條件和微量全血培養

2. 3. 1 離體照射條件

必須提供可靠、明確的照射樣品的物理劑量，在室溫下進行照射。受照樣品應與照射源保持一定的距離以達到均勻照射的目的。有條件的實驗室應建立包括不同射線類型（如X 射線、γ 射線、中子）、不同劑量率的劑量-效應標準曲線;對于低傳能線密度（linear energy transfer， LET） 輻射，劑量范圍選擇0. 1 ～ 5. 0 Gy，劑量率介于0. 2 ～ 1. 0Gy/ min 之間，選擇不少于8 個劑量點;對于高LET輻射，劑量范圍選擇0. 01 ～ 3. 0 Gy，以不少于7 個劑量點為宜;照射后在（37±0. 5）℃ 恒溫水浴箱中孵育修復2 h。

2. 3. 2 微量全血培養

取照射后的靜脈血0. 3～0. 5 mL 加入到5 mL含植物血凝素和20%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，培養開始加入終濃度為0. 015 ～ 0. 03 μg/mL 秋水酰胺或秋水仙素，在培養容器上編號并注明培養開始時間和日期，輕輕搖勻，（37±0. 5）℃ 恒溫培養48～52 h 收獲細胞。當初估劑量大于5 Gy時，可分批次培養，將培養時間延長至56～72 h，以克服因大劑量照射而誘發的細胞分裂周期阻滯、可供分析細胞數比較少的問題[9-10] 。

2. 4 染色體標本的制備

2. 4. 1 人工制備

人工制備染色體標本的質量受專業人員技術熟練程度和實驗室溫、濕度等的影響較大，有條件的實驗室配備自動化制片設備為宜，以確保制備出的染色體標本的穩定性和質量。

2. 4. 1. 1 低滲

終止培養后用吸管輕輕抽去培養瓶中的上清液，每瓶加入8 mL 37 ℃ 預溫的0. 075 mol/ L KCl，將細胞團塊充分吹打后移至10 mL 的尖底玻璃離心管中，放入37 ℃ 恒溫水浴箱（鍋） 中低滲20 ～30 min。

2. 4. 1. 2 預固定和固定

取出低滲完畢的離心管，每管加入5～10 滴新配制的固定液（甲醇∶ 冰醋酸= 3 ∶ 1），用吸管吹打混勻，水平離心機中200～250 g 離心8～10 min。取出離心管，用吸管吸去上清液，沿管壁每離心管中加入8 mL 固定液，用吸管快速吹打細胞團塊，常溫下固定20 ～ 30 min，在水平離心機中200 ～250 g 離心8～10 min，再重復固定1～2 次。

2. 4. 1. 3 制片

取出離心管，吸去上清液，根據細胞團塊的大小每離心管中加入3 ～ 5 滴固定液以調節細胞濃度。然后以一定高度（10 ～ 30 cm） 將細胞懸液滴在經37 ℃ 水浴預熱或在4 ℃ 冰箱預冷的潔凈載玻片上，每張玻片滴2～3 滴，自然空氣干燥。

2. 4. 1. 4 編號和染色

對每一張染色體標本片進行編號，并按照編號做好記錄。將用pH 6. 8 的磷酸緩沖液配制的10% Giemsa 染液均勻涂于染色體標本片上或置于染缸中，室溫下染色8 ～ 10 min，以一定傾角（ 約45°）用自來水輕輕沖洗，洗掉染液后置于玻片架上室溫自然晾干。

2. 4. 2 自動化制備

配備有自動化細胞收獲儀、自動化制片/ 滴片機和自動化染片機的實驗室，可按照生產商提供的操作指南自動化制備染色體標本。自動化制備出的染色體標本相比人工有一定優勢，如自動化細胞收獲儀制備的細胞懸液細胞丟失少、質量穩定，且不需要經驗積累;自動化制片機滴片較為均勻、不受溫濕度影響，制備的標本質量穩定，亦不需要經驗積累等。

2. 5 dic 的半自動化分析

2. 5. 1 分析方法

按照生產商提供的高通量染色體自動化掃描系統操作指南對制備出的染色體標本片進行全玻片自動化中期相尋找及高倍圖像采集，對采集到的高倍圖像使用相應的DCScore 軟件進行dic 自動化分析，對軟件檢測到的所有dic 由人工根據經驗確認，剔除假陽性dic 后，再導出軟件給出經過人工確認的dic 數和分析細胞數。

2. 5. 2 分析計數的細胞數要求

每例樣本應分析計數的細胞數n = （1-p） ×96. 04/ p，其中p 為每細胞dic 數，p 可在計數分析一定數量的細胞后求得。

2. 6 劑量-效應曲線的擬合

2. 6. 1 人工擬合

對X 或γ 射線誘導的dic 與受照射劑量之間的劑量-效應關系以擬合二次多項式為宜，Y = C +αD +βD2 ，其中Y 為每細胞dic 數，D 為照射劑量（Gy），C 為本底畸變率，α 為線性系數，β 為線性平方系數。利用已知的Y 和D 值計算出公式中的各項回歸系數，擬合出相應的回歸方程式（劑量-效應曲線），同時計算出回歸系數顯著性檢驗的P 值和檢驗擬合度的相關性系數 R2 值。

2. 6. 2 軟件擬合

按照得到國際學界公認的免費專業劑量-曲線刻度與劑量估算軟件CABAS 指南[11] ，將半自動化分析得到的每細胞dic 數和對應的照射劑量，分別輸入至該軟件，擬合出相應的劑量-效應曲線，其公式亦為Y = C +αD +βD2 ，同時軟件還給出了回歸系數顯著性檢驗的P 值和檢驗擬合度的相關性系數R2 值。

2. 7 劑量估算

2. 7. 1 每細胞dic 數和95%置信限的計算

dic 符合泊松分布，計算出每細胞dic 數p、每細胞dic 數的標準誤Sp 和每細胞dic 數的95%置信限95%CI：

2. 7. 2 估算受照劑量

將所要估算劑量的標本中得到的每細胞dic及95%置信限的上、下限分別代入已建立的劑量-效應標準曲線，估算出受照劑量，并出具劑量估算報告。事故受照人員生物劑量估算示例參見下文2. 10 節。

2. 8 質量控制要求

2. 8. 1 進行染色體畸變分析的實驗室應有2 名（含）以上專業技術人員，掌握電離輻射生物效應和細胞遺傳學基礎知識，能識別包括dic 在內的各類型染色體畸變。

2. 8. 2 染色體標本應有唯一性編號，標本分析完畢后，應置于玻片盒內長期保存，并做好記錄。

2. 8. 3 實驗室應定期參加國家或省市組織的實驗室間比對。

2. 8. 4 實驗室化學和生物安全符合國家法律法規和標準的要求。

2. 9 dic 半自動化分析估算劑量的注意事項

2. 9. 1 dic 半自動化分析比較準確估算劑量的范圍是0. 25～5. 0 Gy 之間。

2. 9. 2 事故后應盡早取血，不宜超過8 周。

2. 9. 3 培養條件、制片方法和染色體畸變的判斷標準應與建立劑量-效應曲線時相同。

2. 9. 4 對估算劑量的個體，至少應自動化分析500 個中期相細胞或自動化檢測到100 個dic。

以應急為目的進行分類診斷時，自動化分析150 個細胞或計數30 個dic 估算的劑量可以滿足早期分類診斷的需要，而且估算劑量的誤差在1 Gy 內[12] 。

2. 9. 5 應選擇與事故條件接近，通過本實驗室dic 自動化分析系統或軟件擬合的刻度曲線進行劑量估算， 在曲線劑量范圍內應用， 一般不得外推。

2. 9. 6 估算劑量時，除給出平均值以外，同時給出劑量范圍的95% 置信限。在計算95% 置信限時，可以忽略回歸方程式中由于不確定性的dic 率的標準誤，只計算dic 率的標準誤即可。

2. 10 dic 半自動化分析估算生物劑量技術共識的應用示例

某人受60 Co γ 射線一次全身照射，照后48 h內取血，采用微量全血培養法制備染色體標本，自動化分析500 個中期相細胞，半自動化檢測出dic184 個，估算其生物劑量。

將分析細胞數（500） 和檢測得到的dic 數（184）分別代入2. 7. 1 節公式（1）、（2） 和（3），計算出的每細胞dic 數為0. 368 0， 標準誤Sp 為0. 027 1，每細胞dic 數的95%置信限為0. 314 9 ～0. 421 1。

選擇河南省輻射生物與流行病學醫學重點實驗室（以下簡稱“省重點實驗室”）所建立的60 Co γ射線照射離體人外周血建立的dic 半自動化分析的劑量-效應曲線（該曲線的劑量范圍為0. 5～5. 0Gy，劑量率為0. 27 Gy/ min）：

Y = 0. 0001954+0. 044228D+0. 024628D2 （4）式中，Y 為每細胞dic 數，D 為劑量（Gy）。

將0. 368 0、0. 314 9 和0. 421 1 分別代入公式（4）中的Y 項，解方程后求出平均劑量為3. 07 Gy，95%置信限下限為2. 79 Gy、上限為3. 33 Gy。

亦可以將分析細胞數（500）、檢測得到的dic數（184）和公式（4） 的各項回歸系數輸入到劑量估算軟件CABAS 中，估算的平均劑量為3. 07 Gy，95%置信限下限為2. 80 Gy、上限為3. 35 Gy。

3 影響dic 半自動化分析估算生物劑量的主要因素

自從2009 年法國學者Vaurijoux 等[13] 首次報道借助圖像分析系統半自動化檢測dic 估算達喀爾輻射事故受照者的生物劑量以來，國內外的學者利用高通量染色體自動化掃描分析系統分析dic，并刻度基于每細胞dic 數的劑量-效應曲線，系統研究了dic 半自動化分析估算生物劑量的影響因素和將其應用于發生大規模核與輻射事故時快速、高通量劑量估算的可行性。

3. 1 不同實驗條件設置對dic 半自動化分析構建劑量曲線的影響

在MULTIBIODOSE EU FP7 [ The EuropeanUnion’s Seventh Framework Program （FP7/ 2007—2013）]計劃項目支持下，Romm 等[6] 報道了6 家歐盟生物劑量實驗室建立了基于半自動化dic 分析的劑量-效應曲線，并分析了不同實驗條件對劑量曲線的影響。在這6 家實驗室中有2 家實驗室用收獲前2 ～ 3 h 加秋水酰胺的淋巴細胞培養方法，用熒光加Giemsa 染色制備染色體標本;另4 家實驗室是在收獲前24 h 加秋水酰胺，用Giemsa 染色制備標本。dic 自動化分析軟件（ DCScore V.3. 6. 7）分類器的參數分別按照法國輻射防護與核設施研究院（ Institut de Radioprotection et deSurete′ Nucle′aire， IRSN） 和德國聯邦輻射防護局（Bundesamt fuer Strahlenschutz， Bfs）推薦的方法設置。這6 家實驗室采用3 種不同的分類器參數（IRSN-Class、Bsf-Class 和Bsf-First-Class）檢測dic，構建了9 條γ 射線離體照射的劑量-效應曲線。統計分析顯示，建立的這些劑量-效應曲線間沒有統計學差異，所以可以將9 條曲線合并為一條總的曲線（Pooled;圖2）。表明不同實驗室間、加秋水酰胺的時間以及采用不同的分類器參數對構建劑量-效應曲線沒有明顯影響。總之，這種半自動化的dic 計數方法是應對大規模核事故時快速和高通量的分類潛在受照者的有用工具，而且參加該項研究的6 家實驗室所得實驗結果具有可比性，說明可通過建立實驗室間的網絡進行快速劑量估算，以提高核與輻射醫學應急響應能力。

3. 2 自動化分析檢測到的dic 假陽性率與照射劑量的關系分析

上述跨實驗室的研究還對dic 假陽性率與照射劑量進行了分析[6] ，發現隨著照射劑量的升高，每細胞dic 數升高，真陽性dic 的比率亦升高，也就是說劑量越低，dic 的假陽性率越高，如在照射劑量低于0. 5 Gy 時dic 假陽性率在90%以上，而大于2 Gy 條件下dic 假陽性率不超過20%。采用不同的DCScore 軟件分類器參數設置對檢測到dic真陽性率沒有影響，無論是采用德國的Bsf-Class還是法國的IRSN-Class 分類器參數，檢測到的真陽性率無明顯統計學差異。

“省重點實驗室”在對dic 假陽性率與照射劑量的關系分析中得到類似結果，DCScore 軟件自動化檢測到的dic 假陽性率有隨照射劑量的增加而降低的趨勢（99. 67% ～ 4. 18%），且照射劑量大于2 Gy 和3 Gy 時，假陽性率分別小于30% 與20%（圖3）。這些研究結果再次說明，當受照劑量大于2 Gy 時，基于dic 自動化分析估算的劑量用于臨床分類診斷是可行的[14] 。

3. 3 dic 半自動化和人工分析用時比較

國外有報道顯示，半自動化分析可明顯提高人工分析的工作效率。如人工分析50 個核型和自動化分析計數150 個核型可以對受照者或懷疑受照者進行初步分類診斷，但熟練和有經驗的專業技術人員計數50 個核型至少需要60 min，自動化分析計數150 個核型僅需20 min，且人工確認dic 平均只需2 min，自動化分析可將人工分析的工作效率提高30 倍[6] 。

“省重點實驗室”用Metafer 4 系統采集200 個高倍圖像，分別用DCScore 和Ikaros 軟件進行dic半自動化和人工分析，比較兩種計數方法所用時間（見表1）[14] 。由于兩種分析均需要借助染色體掃描系統進行全玻片自動化中期相捕獲及高倍圖像采集，所需時間同為25 min。對系統采集的200個高倍圖像平均按150 個圖像可供人工分析，依據每個圖像包含dic 數（0～ n 個）不同，“省重點實驗室”分析1 個圖像所用時間一般在0. 5～1. 5 min之間，每個圖像平均按1 min 計算，人工分析平均需要用時150 min，而自動化分析和候選dic 的人工確認只需要用時3 min，人工分析所用時間是半自動化分析的6. 25 倍。同時，根據自動化分析所得候選dic 的多少，對其人工確認用時在1 ～ 3 min之間，平均為2 min，所以半自動化分析可將人工工作效率提高75 倍。因此，相較于人工分析，dic半自動化分析使劑量估算效率和人工工作效率兩方面均得到明顯提高。

3. 4 自動化分析需計數的細胞數

為了解dic 半自動化分析在核與輻射應急響應分類診斷中應計數的細胞數，法國學者Gruel等[15] 在一次應急演練中模擬了不同輻射場景的50 例受害者，模擬的全身照射外周血樣品的照射劑量為0 ～ 4. 7 Gy，模擬的局部照射是將照射與未照射血液樣品按照不同的比例混合，然后進行dic自動化檢測和估算劑量。結果顯示，在34 個模擬全身照射的血液樣品中，有32 個樣品從第一張染色體標本上自動化檢測300～400 個細胞估算的劑量與照射劑量基本一致，可以給出較為可靠的分類診斷，但對于局部照射，只在較高的照射劑量點（3. 7 Gy）才能做出較為正確的分類。此外，無論是模擬的全身或是局部照射，每增加一張分析的標本，均可對分類做出校正。所以，以自動化檢測300～400 個細胞估算劑量進行初步分類診斷是可行的。對于最終的劑量估算需要自動化分析的細胞數則主要取決于初始估計劑量以及物理劑量和受照者臨床癥狀等的信息。該文作者建議，劑量大于1 Gy 時應自動化分析1 500 個細胞，劑量較低或懷疑受到局部照射時分析細胞數應增加到3 000 個。

美國學者Ryan 等[16] 關于dic 自動化分析估算劑量在輻射應急響應分類診斷中應計數的細胞數研究中，通過調整Metafer 系統中期相捕獲算法和提高DCScore 軟件自動化檢測dic 的靈敏度，在不需要人工干預去除假陽性dic 的情況下，自動化檢測150 個左右的細胞估算的劑量就能較好的區分出照射劑量為0. 5 ～ 3. 0 Gy 的模擬X 或γ 射線照射，認為dic 自動化分析可有效的應用于發生大規模核與輻射事故時快速的臨床分類診斷。筆者的研究得到類似結果，當照射劑量大于2 Gy 時，自動化檢測100～200 個細胞估算的劑量可用于臨床分類診斷。據文獻報道，以分類診斷為目的人工計數50 個細胞與自動化分析150 個細胞的分類效率是類似的[12] 。因此，當大規模人群受到照射且以分類診斷為目的時，自動化分析150 個細胞可用于事故受照者早期快速的臨床分類診斷。

4 dic 半自動化分析估算生物劑量的應用實踐

4. 1 非洲達喀爾輻射事故受照者的生物劑量估算

法國學者Vaurijoux 等[13] 首次在國際上將基于dic 半自動化分析構建的劑量曲線，應用于達喀爾（Dakar）192 Ir 源輻射事故受照者的生物劑量估算。他們利用實驗室留存的46 例受照者的染色體標本片進行了dic 半自動化分析，將dic 半自動化分析和早先dic 人工分析得到的46 例事故受照者的每細胞dic 數， 分別代入人工分析方程式YMS =（0. 001 3±0. 001 0） +（0. 049 1± 0. 010 0）D +（0. 045 2 ± 0. 007 7） D2 和半自動化分析方程式YADS =（0. 000 8±0. 000 4）+（0. 007 0± 0. 002 6）D+（0. 021 7±0. 001 6）D2 估算劑量。結果顯示，人工計數50 個細胞與計數500 個細胞估算的劑量兩者分類受照者造成的誤差達到50%，而人工計數500 個細胞與半自動化分析500 個以上細胞估算的劑量兩者分類受照者造成的誤差僅為4. 35%。而且半自動化分析比人工分析要快20 倍，如每位分析者半自動化分析1 000 個細胞與用人工分析50 個細胞所用時間一樣。所以，用dic 自動化分析軟件半自動化檢測dic 估算劑量可以代替常規的人工分析估算劑量，而且與人工分析相比，自動化分析速度更快、估算劑量更準確，是發生大規模核與輻射事故時較為理想的生物劑量估算方法。

4. 2 dic 半自動化分析用于不同輻射場景估算劑量的可行性

電離輻射誘發的dic 率為泊松分布，可以準確估算急性均勻照射場景下的受照劑量，但也可以根據dic 的分布情況和一些數學模型如Dolphin’s模型估算局部和遷延性照射輻射暴露場景下的受照劑量。由于半自動化分析檢出的dic 率屬于泊松分布，是否也可以用于不同輻射場景條件下的劑量估算？ 為此，來自歐盟的學者Romm 等[17] 利用6 家網絡實驗室已建立的基于dic 半自動化分析構建的劑量曲線，采集33 例健康人的血液樣品用60 Co γ 射線離體照射，分別模擬急性全身、局部和遷延性照射3 種輻射暴露場景，每個暴露場景分別選用3 個不同的照射劑量。照射后的血液樣品雙盲編號后運送到參加該項研究的不同實驗室。每個實驗室按照各自實驗室的標準方法培養與制片，標本片用半自動化分析系統計數dic，每例樣品計數300 個中期細胞，將半自動化分析得到的每細胞dic 數代入前期基于dic 半自動化分析構建的劑量-效應曲線估算劑量。結果顯示在模擬的均勻照射條件下，所有實驗室均能將0、0. 5、2. 0 和4. 0 Gy 劑量點區分開，而且在大多數樣品中估算的劑量與實際照射劑量的誤差在±0. 5Gy 范圍內;在模擬的遷延性照射條件下，所有實驗室均能將1. 0、2. 0 和4. 0 Gy 劑量點區分開，大多數樣品中估算的劑量與實際照射劑量的誤差亦在±0. 5 Gy 范圍內;在模擬的局部照射條件下，所有實驗室均能將2. 0、4. 0 和6. 0 Gy 劑量點區分開，僅在幾個樣品中估算的劑量與實際照射劑量的誤差在±0. 5 Gy 范圍內，這可通過增加自動化檢測細胞數來降低誤差率。

該項由6 家國際實驗室參加的研究結果提示，dic 半自動化檢測方法與人工分析一樣，亦有用于受不同輻射場景照射后較為準確地對受照者進行分類的潛能。在發生大規模核與輻射事故時，該方法是對受照人群進行高通量篩查分類的有用工具。

4. 3 dic 半自動化分析估算劑量用于臨床分類診斷的可行性

鑒于dic 自動化分析檢出的dic 真陽性率與照射劑量呈正相關，“省重點實驗室” 探討了利用自動化或半自動分析檢出的dic 率估算劑量用于臨床分類診斷可行性[14] 。利用DCScore 軟件（德國CARL ZEISS 公司）半自動化分析dic，擬合基于每細胞dic 的劑量-效應曲線，并用“省重點實驗室”參加全國生物劑量估算比對的12 份考核樣品（0. 7～4. 5 Gy）估算劑量進行驗證。將自動化分析檢測到的12 份考核樣品人工確認前后的每細胞dic 數，代入基于γ 射線照射的dic 半自動化分析構建的回歸方程Y = 0. 024 628 D2 +0. 044 228 D +0. 000 195 4 估算劑量。結果顯示dic 人工確認前，照射劑量大于2 Gy 時估算的劑量與實際照射劑量的相對偏差均≤20. 48%，大于3 Gy 時估算劑量的相對偏差均≤11. 11%;dic 人工確認后估算的劑量與實際照射劑量的相對偏差均≤10%，接近于真實照射劑量。而且除0. 7 Gy 外，照射劑量為1. 4、1. 7、1. 9 Gy 用dic 自動化分析估算的劑量分別為1. 97、2. 33 和2. 44 Gy，分別可分類為輕度、中度偏輕骨髓型放射病。因此，dic 自動化分析用于輕度、中度和重度骨髓型急性放射病的初步分類是可行的。這表明dic 半自動化分析可以用于核與輻射事故受照者的劑量估算和臨床分類診斷，特別是在發生大規模核與輻射事故，受照人員較多時，可用人工確認前檢測的dic 數估算劑量，對受照者區分出不同的受照劑量區間，做出更快速的初步分類診斷。

4. 4 延遲采樣和局部照射受照者的生物劑量估算

在生物劑量估算實踐中，大多數是照后短時間內因及時發現事故而進行生物劑量估算，但也有一些事故在照后幾個月或更長時間，患者因健康出現問題就醫時通過染色體畸變分析估算劑量才被發現，此類案例因采血延遲、非穩定性染色體畸變丟失而造成估算劑量偏低。因此，IAEA 推薦可用不同數學模型對受照者進行回顧性生物劑量的重建， 修正因延遲采血而造成的估算劑量誤差[3] 。

“省重點實驗室”利用dic 人工和半自動化分析估算劑量確診了一例介入術后7 個月疑似因X射線介入手術致背部皮膚大面積放射性皮膚損傷的患者，并依據dic 的分布重建了該患者的生物劑量[18] 。術后203 d 采集患者肝素抗凝靜脈血進行微量全血培養，采用國際學界公認的免費生物劑量估算軟件CABAS，利用“省重點實驗室”基于dic半自動化與人工分析、dic+r 人工分析構建60 Co γ射線離體照射人外周血的劑量-效應曲線及GB / T28236—2011 標準[5] 推薦曲線，估算患者的受照劑量、泊松分布u 檢驗值和身體受照份額等。結果顯示患者術后7 個月，基于每細胞dic 或dic+r 估算的一次全身等效吸收劑量在0. 68 ～ 0. 95 Gy 之間，dic 半自動化分析估算的劑量低于dic 或dic+r人工分析估算劑量，包括國家標準推薦曲線在內的3 條不同劑量率的人工分析曲線估算的劑量非常接近，半自動化與人工分析估算劑量的相對偏差為27% ～28%，均表明該患者受到過量照射或為輕度骨髓型急性放射病。泊松分布u 檢驗和身體受照份額的估算結果顯示的u 值均大于| 1. 96 |，σ2 / y 均大于1. 00，dic 或dic+r 不符合泊松分布，為過離散分布，患者受到局部不均勻照射，身體受照份額為37. 02%。可見dic 半自動化分析對于局部照射估算劑量以及對于事故受照者臨床分類診斷都是可行的， 有推廣應用價值。此外， 利用IAEA 推薦的Dolphin’s 模型來修正因延遲采血而造成的估算劑量誤差方面，dic 半自動化和人工分析估算的該患者劑量分別為2. 15 Gy（CI，1. 98 ～2. 32 Gy）和2. 48 Gy（CI，2. 33 ～ 2. 64 Gy），估算的劑量相當于照后短時間內的全身平均吸收劑量，2種分析方法重建的劑量基本一致，說明dic 半自動化分析亦可重建和修正因延遲采血而造成的估算劑量誤差。

5 結論和展望

dic 半自動化分析估算生物劑量已在國際上推廣應用10 余年，技術成熟度高，不但能明顯提升生物劑量估算的效率，還降低了對專業人員技術熟練程度的門檻要求，更有利于推廣應用。相比而言，我國dic 半自動化分析估算生物劑量起步較晚，但進展迅速。本專家共識從dic 半自動化分析原理、主要技術內容、影響因素分析和應用實踐等方面給出了dic 半自動化分析估算生物劑量的技術共識，其主要技術內容與現有GB / T 28236 國家標準[5] 相比有一定特色和優勢。一是引入了染色體標本的自動化制備技術，不需要專業人員制備標本的經驗積累，能確保制備出的標本質量穩定可靠，提高生物劑量估算的成功率;二是dic 半自動化分析不但能明顯提高檢測效率，還由于降低了專業人員識別畸變的技術要求，可更好推廣應用;三是引入了軟件擬合曲線和估算劑量，省去了復雜的計算過程。通過對影響因素的分析和實用舉例可見，dic 半自動化分析與人工分析一樣，除可用于急性均勻照射估算劑量外，同樣可用于局部、遷延性照射和延遲采樣等輻射暴露場景下的受照劑量估算與重建，而且在一定照射劑量范圍內，自動化而非人工干預檢測dic 估算的劑量用于臨床分類診斷是可行的。因此，dic 半自動化分析估算生物劑量，完全可以代替常規的人工分析估算劑量，而且與人工分析相比，半自動化分析速度更快、估算劑量更準確，是發生大規模核與輻射事故時較為理想的生物劑量估算方法。

展望未來，為了有效應對大規模核與輻射事故，生物劑量估算應該滿足自動化、快速和高通量的要求，且需要與臨床指標、物理劑量估算相互佐證。具體操作層面，國際上已有較為成熟的實踐，通過建立全流程細胞遺傳指標的全自動化分析技術，明顯提高了生物劑量估算的通量和效率[19] 。但國內有關高通量估算生物劑量的研究相對滯后，目前僅建立了dic 半自動化分析估算生物劑量方法。利用人工智能技術自動化檢測dic 等指標，研發出從細胞接種、收獲、制片/ 滴片、圖像采集和遺傳指標分析全流程自動化的高通量生物劑量估算平臺，是未來提升國內生物劑量估算效率和通量的主要目標，也是國內同行值得關注和重點研發的發展方向，以便更好地為我國核與輻射事業的發展保駕護航。

利益沖突：所有作者宣稱沒有任何利益沖突， 未接受任何不當利益。

參考文獻：

[ 1 ] HAN L， GAO Y， WANG P， et al. Cytogenetic biodosimetry for radiation accidents in China [ J]. Radiat Med Prot，2020， 1（3）： 133-139.

[ 2 ] 王平， 韓林， 李杰， 等. 雙著絲粒染色體分析在核與輻射事故應急生物劑量估算中的應用與進展[J]. 輻射防護通訊， 2020， 40（Z1）： 97-102.WANG P，HAN L， LI J， et al. Application of dicentric chromosome analysis in nuclear/ radiation emergency and its progress [J]. Radiat Prot Bulletin， 2020， 40（Z1）： 97-102.

[ 3 ] International Atomic Energy Agency. Cytogenetic dosimetry： Application in preparedness for and response to radiation emergencies[R]. Vienna： IAEA， 2011.

[ 4 ] International Organization for Standardization. Radiation protection—Performance criteria for laboratories performing initial cytogenetic dose assessment of mass casualties in radiological or nuclear emergencies—General principles and application to dicentric assay：ISO 21243[S]. ISO， Geneva， 2022.

[ 5 ] 中華人民共和國衛生部 中國國家標準化管理委員會. 染色體畸變估算生物劑量方法：GB/ T 28236—2011 [S]. 北京：中國標準出版社， 2012.

[ 6 ] Romm H， Ainsbury E， Barnard S， et al. Automatic scoring of dicentric chromosomes as a tool in large scale radiation accidents [J]. Mutat Res， 2013， 756（1-2）：174-183.

[ 7 ] 戴宏， 劉玉龍， 馮駿超， 等. 雙著絲粒染色體自動分析生物劑量估算研究[J]. 中華放射醫學與防護雜志， 2017， 37（3）：182-186.

[ 8 ] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. 放射工作人員職業健康檢查外周血淋巴細胞染色體畸變檢測與評價：GBZ 248—2014 [S]. 北京：中國標準出版社， 2014.

[ 9 ] 陳英， 駱億生， 曹珍山， 等. 特大劑量γ 射線照射的染色體畸變劑量效應曲線[J]. 輻射研究與輻射工藝學報，2006， 24（4）： 241-244.

[10] 陳英， 杜杰， 張學清， 等. 太原“4. 11”鈷源事故受照者生物劑量估算及照后一年細胞遺傳學隨訪[J]. 輻射防護，2010， 30（4）： 201-207.CHEN Y， DU J， ZHANG X Q， et al. Biological dose estimation in victims of Taiyuan “4. 11” cobalt source accident and cytogenetic follow-up observation after one year [J]. Radiat Prot， 2010， 30（4）： 201-207.

[11] Deperas J， Szluinska M， Deperas-Kaminska M， et al. CABAS： a freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry[J]. Radiat Prot Dosim， 2007， 124（2）： 115-123.

[12] Endesfelder D， Oestreicher U， Bucher M， et al. RENEB Inter-Laboratory Comparison 2021： The Dicentric Chromosome Assay[J]. Radiat Res， 2023， 199（6）：556-570.

[13] Vaurijoux A， Gruel G， Pouzoulet F， et al. Strategy for population triage based on dicentric analysis[ J]. Radiat Res，2009， 171（5）： 541-548.

[14] 韓林， 陸雪， 李杰， 等. 雙著絲粒體半自動與人工分析估算生物劑量的比較研究[J]. 中華放射醫學與防護雜志，2020， 40（11）： 826-831.HAN L， LU X， LI J， et al. Study on the comparison of semi-automatic and manual dicentric detection for biological dosimetry [J]. Chin J Radiol Med Prot， 2020， 40（11）： 826-831.

[15] Gruel G， Gregoire E， Lecas S， et al. Biological Dosimetry by automated dicentric scoring in a simulated emergency [J].Radiat Res， 2013， 179（5）： 557-569.

[16] Ryan T L， Escalona M B， Smith T L， et al. Optimization and validation of automated dicentric chromosome analysis for radiological/ nuclear triage application [J]. Mutat Res， 2019， 847： 503087.

[17] Romm H， Ainsbury E， Barnard S， et al. Validation of semi-automatic scoring of dicentric chromosomes after simulation of three different irradiation scenarios [J]. Health Phys， 2014， 106（6）： 764-771.

[18] 韓林， 張冰潔， 王平， 等. 一起介入治療意外照射導致背部大面積放射性皮膚損傷患者的生物劑量估算[J]. 中華放射醫學與防護雜志， 2021， 41（12）：886-891.HAN L， ZHANG B J， WANG P， et al. Biodosimetry estimation of a case of large area back skin injury caused by accidental irradiation in interventional procedure [J]. Chin J Radiol Med Prot， 2021， 41（12）：886-891.

[19] 呂玉民， 劉玉龍， 沈軍生， 等. 大規模核與輻射事故受照人員生物劑量估算的應對策略[J]. 輻射防護通訊， 2022，42（4-5）： 69-73.LYU Y M， LIU Y L， SHEN J S， et al. Strategy of biological dosimetry for those exposed to large-scale nuclear/ radiological incidents [J]. Radiat Prot Bulletin， 2022， 42（4-5）： 69-73.