馬錢苷調節AKT/AMPK/Nrf2通路改善氧葡萄糖剝奪/復氧誘導的神經元鐵死亡的機制研究

楊祎 賈健 魏小利 茍平平 袁媛 高李

摘要 目的： 探討馬錢苷通過調節蛋白激酶B（AKT）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/核因子.E2相關因子2（Nrf2）通路改善氧葡萄糖剝奪/復氧（OGD/R）誘導的神經元鐵死亡的機制。 方法： 將神經元分為對照組、OGD/R組、OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組。透射電子顯微鏡觀察神經元線粒體形態；檢測鐵含量、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性、4.羥基壬烯醛（4.HNE）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG），還原型輔酶Ⅱ（NADPH）/輔脫氫酶Ⅱ（NADP ＋）及乳酸脫氫酶（LDH）含量；使用CM.H2DCFDA、C11.BODIPY581/591分別檢測細胞內和脂質活性氧（ROS）水平；四唑鹽（MTT）試劑盒檢測細胞活性；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測B細胞淋巴瘤2（Bcl.2）、Bcl相關X蛋白（Bax）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase.3）、磷酸化的蛋白激酶B（p.AKT）/AKT、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p.AMPK）/AMPK、Nrf2蛋白表達。 結果： OGD/R組神經元線粒體出現碎片化現象，嵴減少，線粒體膜密度有所增 加。與對照組比較，OGD/R組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性、 細胞活力以及Bcl.2水平、p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、 ?Nrf2水平下降（ P ＜0.05），Fe ?2＋ 含量、細胞內ROS水平、脂質ROS水平以及4.HNE、MDA水平、LDH釋放量、Bax以及cleaved Caspase.3 水平上升（ P ＜0.05）；馬錢苷處理后神經元線粒體中的線粒體嵴變得較為完整，碎片化現象消失，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組較OGD/R組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性、細胞活力以及Bcl.2水平、p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2水平上升（ P ＜0.05），Fe ?2＋ 含量、 細胞內ROS水平、脂質ROS水平以及4.HNE、MDA水平、LDH釋放量、Bax 以及cleaved Caspase.3水平下降（ P ＜0.05），且隨著馬錢苷劑量的增加，改善效果更顯著；OGD/R＋H.馬 錢苷＋ML385組以上指標與OGD/R組趨勢一致。 結論： 馬錢苷可能通過調節AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R誘導的神經元鐵死亡。

關鍵詞 ?氧葡萄糖剝奪/復氧；鐵死亡；馬錢苷；蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶/核因子.E2相關因子2通路；神經元

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.010

Mechanism of AKT/AMPK/Nrf2 Regulated by Loganin to Improve Ferroptosis Induced by Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation

YANG Yi， JIA Jian， WEI Xiaoli， GOU Pingping， YUAN Yuan， GAO Li

Baoji Central Hospital， Baoji 721000， Shaanxi， China

Corresponding Author ?GAO Li， E.mail： gaoli1980g@163.com

Abstract Objective： To investigate the mechanism of loganin improves the ferroptosis induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R） by regulating protein kinase B（AKT）/adenylate activated protein kinase（AMPK）/nuclear factor E2 associated factor 2（Nrf2） pathway. ??Methods： The neurons were divided into control group，OGD/R group，OGD/R＋L.loganin group，OGD/R＋M.loganin ?group，OGD/R＋H.loganin group，OGD/R＋H.loganin＋ML385 group.The morphology of neuron mitochondria was observed by transmission electron microscope.Iron content，glutathione peroxidase 4（GPX4） activity，4.hydroxynonenal（4.HNE），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），reduced glutathione（GSH）/oxidized glutathione（GSSG），reduced Coenzyme Ⅱ（NADPH）/Codehydrogenase Ⅱ（NADP ＋），and Lactate dehydrogenase（LDH） content were determined.Intracellular and lipid reactive oxygen species（ROS） levels were detected by CM.H2DCFDA and C11.BODIPY581/591，respectively.MTT assay was used to detect cell activity.B.cell lymphoma 2（Bcl.2），Bcl.associated X protein（Bax），cleaved Caspase.3，phosphorylated protein kinase B（p.AKT）/AKT，phosphorylated adenylate activated protein kinase（p.AMPK）/AMPK，Nrf2 protein expression were detected by Western Blot. ?Results： In OGD/R group，mitochondrial fragmentation occurred，ridge decreased，and mitochondrial membrane density increased.Compared with the control group，the relative activities of GSH/GSSG，NADPH/NADP ＋，SOD，GPX4，and the levels of Bcl.2，p.AKT/AKT，p.AMPK/AMPK and Nrf2 in OGD/R group decreased（ P ＜0.05），Fe ?2＋ content，intracellular ROS levels，lipid ROS levels，4.HNE，MDA levels，LDH release，Bax，and cleaved Caspase.3 levels increased（ P ＜0.05）.After treatment with loganin，the mitochondrial ridge in neuronal mitochondria became more complete and the fragmentation disappeared.The relative activity of GSH/GSSG，NADPH/NADP ＋，SOD，GPX4，Bcl.2 level，p.AKT/AKT，p.AMPK/AMPK，and Nrf2 in OGD/R＋L.loganin group，OGD/R＋M.loganin group and OGD/R＋H.loganin group were higher than those in OGD/R group，Fe ?2＋ content，intracellular ROS levels，lipid ROS levels，4.HNE，MDA levels，LDH release，Bax，and cleaved Caspase.3 levels were lower than those in OGD/R group（ P ＜0.05）.With the increase of the dose of loganin，the improvement effects were more significant.The above indexes of OGD/R＋H.loganin＋ML385 group were consistent with the trend of OGD/R group. ?Conclusion： loganin may ameliorate OGD/R.induced neuronal ferroptosis by regulating the AKT/AMPK/Nrf2 pathway.

Keywords ?oxyglucose deprivation/reoxygenation; ferroptosis; loganin; protein kinase B/adenylate.activated protein kinase/nuclear factor.E2.related factor 2 pathway; neurons

腦梗死是一種常見的缺血性腦血管病，是由于各種原因造成腦動脈閉塞，引起相應供血區域腦細胞缺血、缺氧、壞死，出現相應功能障礙；臨床上通常通過恢復血流來治療，但恢復血流可能導致缺血區域的繼發性損傷，簡稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI） ?［1］ 。IRI會誘發線粒體氧化代謝受損及神經元能量消耗，進而導致細胞程序性死亡 ?［2］ 。鐵死亡是一種鐵依賴的細胞死亡形式，由脂質過氧化物的過量積累介導，其對腦梗死等多種神經系統疾病具有重要意義 ?［3］ 。尋找適當的藥物來保護神經元免受IRI的影響是目前急需解決的難題之一。

馬錢苷（loganin，log）是一種從山茱萸中提取的環烯醚萜苷，具有神經保護 ?［4］ 、抗氧化 ?［5］ 、抗炎 ?［6］ 等特性。有研究發現，馬錢苷可減輕脂多糖刺激的BV2小膠質細胞對原代神經元的損傷，對大腦中動脈閉塞小鼠發揮抗炎和神經保護作用 ?［7］ 。據報道，調節腺苷酸活化蛋白激酶（AMP.activated protein kinase，AMPK）/核因子.E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2.related factor 2，Nrf2）信號通路可以對IRI中的神經元起到保護作用 ?［8］ 。蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）參與細胞生長、增殖、凋亡和蛋白質合成等生物過程 ?［9］ 。AKT也與Nrf2介導的抗氧化反應有關 ?［10］ 。研究發現，激活AMPK/Nrf2信號通路可減輕氧葡萄糖剝奪/復 氧（oxygen.glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R） 誘導的神經元損傷 ?［11］ 。本研究探討馬錢苷通過激活AKT/AMPK/Nrf2通路減輕OGD/R誘導的神經元鐵死亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

3只妊娠C57BL/6j小鼠購自廣東省醫學實驗動物 中心［許可證號SCXK（粵）2022.0002］；飼養于晝夜12 h 交替、濕度45%、室溫（23±1）℃環境中，自由進食。馬錢苷（貨號：YT62708）購自北京伊塔生物科技有限公司；ML385（貨號：S86700）購自上海源葉生物科技有 限公司；4.羥基壬烯醛（4.hydroxynonenal，4.HNE） 試劑盒（貨號：EK.M25633）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號：EK.M29371）、 ?丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號：EK.M29370） 購自上海酶研生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）（貨號：AAT.10056）和還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine nucleoside phosphorylase b，NADPH）/輔脫氫酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP ＋）試劑盒（貨號：K347.100）購自上海研卉生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）（貨號：ybC994Hu）試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；四唑鹽（MTT）試劑盒（貨號：FT.P9S1344X）購自上海梵態生物科技有限公司；總活性氧（reactive ?oxygen species，ROS）熒光探針CM.H2DCFDA（貨號：HY.D1713）及脂質ROS熒光探針C11.BODIPY581/591 （貨號：HY.D1301）購自美國MCE公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（貨號：Dojindo） 購自上海覓拓生物科技有限公司；磷酸化的蛋白激酶B （p.AKT）抗體（貨號：4060）、AKT（貨號：9272）、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p.AMPK）抗體（貨號：4185）購自Cell Signaling Technology公司；鐵含量檢測試劑 盒（貨號：ab83366）、B細胞淋巴瘤2（B.cell lymphoma 2， Bcl.2）（貨號：ab32124）、Bcl相關X蛋白（Bcl.associated X protein，Bax）抗體（貨號：ab32503）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase.3）抗體（貨號：ab2302）、AMPK抗體（貨號：ab3760）購自Abcam公司；Nrf2抗體（貨號：bs.2013）購自RBioss公司；電泳儀（貨號：1645050.OG）購自北京智杰方遠科技有限公司；離心機（貨號：D1524R）購自大龍興創實驗儀器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代皮層神經元的培養

參考文獻［12］將妊娠的C57BL/6j小鼠處死，從胎鼠中分離原代皮質神經元。首先分離小鼠大腦皮層，大腦皮層經胰酶消化后，分離神經元置于含有2% ?B27和2 mmol/L谷氨酰胺的神經基礎培養基中，在37 ℃、5%CO 2 的條件下培養10 d后開始進行實驗。

1.2.2 OGD/R模型的構建及分組

將原代神經元用不含葡萄糖的杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養基培養，然后將培養基置于1%O 2、5%CO 2和94%N 2的缺氧37 ℃培養箱培養2 h，誘導OGD損傷。在OGD之后，將培養基更換為新鮮的基礎培養基，然后將培養基置于37 ℃、5%CO 2培養箱培養24 h構建OGD/R模型 ?［13］ 。

將神經元分為對照組、OGD/R組、OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組。對照組神經元未做任何處理，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組分別 用10、30、50 μmol/L馬錢苷預處理1 h ?［14］ ，然后暴露于 ?OGD/R；OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組用馬錢苷 （50 μmol/L）加ML385（1 μmol/L）預處理1 h后暴露于OGD/R ?［12］ 。

1.2.3 觀察神經元線粒體形態

收集各組神經元，用2%戊二醛固定2 h，然后用1%四氧化鋨固定1 h，經過乙醇脫水，包埋劑包埋后，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行染色，在透射電子顯微鏡下觀察神經元線粒體形態。

1.2.4 比色法檢測細胞內鐵含量

按照鐵含量檢測試劑盒檢測神經元內鐵濃度。Fe ?2＋ 相對含量＝［Fe ?2＋ （實驗組）－Fe ?2＋ （空白組）］/［Fe ?2＋ （對照組）－Fe ?2＋ （空白組）］×100%。

1.2.5 比色法檢測神經元細胞的GPX4、4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH水平

用裂解緩沖液裂解神經元細胞，采用GPX4、 4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH試劑盒檢測神經元細胞的GPX4、4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH水平。

1.2.6 CM.H2DCFDA及C11.BODIPY581/591檢測ROS水平

使用CM.H2DCFDA檢測細胞內ROS水平。在各組神經元中加入10 μmol/L CM.H2DCFDA 37 ℃避光孵育30 min，在酶標儀中檢測熒光強度。使用C11.BODIPY581/591測量脂質ROS水平。在各組神經元中加入2.5 ?μmol/L C11.BODIPY581/591并在37 ℃避光孵育30 min，用酶標儀檢測熒光強度。

1.2.7 MTT檢測細胞活性

藥物處理結束后收集各組細胞，棄去培養基，然后加入0.5 mg/mL MTT試劑37 ℃孵育4 h，棄去MTT溶液后，加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚，最后上機檢測吸光度。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測凋亡相關蛋白以及通路相關蛋白表達

收集經裂解液處理的各組神經元細胞，提取各組神經元的總蛋白，電泳分離后轉到聚偏二氟乙烯 （PVDF）膜上，之后用脫脂牛奶封閉，加入一抗Bcl.2 ?（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、cleaved Caspase.3（1∶2 000）、 AKT（1∶1 000）、 p.AKT（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、 p.AMPK（1∶2 000）、Nrf2（1∶2 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），在4 ℃下過夜，加入二抗，加入顯色劑使目的條帶顯色，使用Image Lab ?TM 軟件分析目標蛋白的灰度值。

1.3 統計學處理

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（ x ?± s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用SNK. q 檢驗。 P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ?馬錢苷對OGD/R誘導的神經元線粒體形態的影響

對照組線粒體形態結構正常，無異常現象；OGD/R組神經元線粒體出現碎片現象，嵴減少，線粒體膜密度有所增加；馬錢苷處理后神經元線粒體中的線粒體嵴 變得較為完整，碎片化現象消失；OGD/R＋H.馬錢 苷＋ML385組現象與OGD/R組現象相似。詳見圖1。

2.2 馬錢苷對OGD/R誘導的神經元鐵含量的影響

與對照組比較，OGD/R組Fe ?2＋ 相對含量提高 （ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組Fe ?2＋ 相對含量下降（ P ＜0.05），且隨著馬錢苷劑量的增加， Fe ?2＋ 相對含量變化更明顯，呈現劑量相關性；與OGD/R＋ H.馬錢苷組比較，OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組Fe ?2＋ 相對含量升高（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.3 ?馬錢苷對OGD/R誘導的神經元抗氧化指標的影響

與對照組比較，OGD/R組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性下調（ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性上調（ P ＜0.05）；與OGD/R＋H.馬錢苷組比較，OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性下調（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.4 ?馬錢苷對OGD/R誘導的神經元脂質過氧化的影響

OGD/R組較對照組細胞內ROS水平、脂質ROS 水平以及4.HNE、MDA水平上升（ P ＜0.05）；與OGD/R 組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組細胞內ROS水平、脂質ROS 水平以及4.HNE、MDA水平下降（ P ＜0.05）；OGD/R＋ H.馬錢苷＋ML385組較OGD/R＋H.馬錢苷組細胞內ROS水平、脂質ROS水平以及4.HNE、MDA水平上升（ P ＜0.05）。詳見表3。

2.5 馬錢苷對OGD/R誘導的神經元細胞活力和細胞死亡的影響

OGD/R組較對照組細胞活力以及Bcl.2水平顯著降低，LDH釋放量、Bax以及cleaved Caspase.3水平升高（ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組細胞活力以及Bcl.2水平升高，LDH釋放量、Bax以及 cleaved ?Caspase.3水平降低（ P ＜0.05）；OGD/R＋ H.馬錢苷＋ML385組較OGD/R＋H.馬錢苷組細胞活力以及Bcl.2水平下降，LDH釋放量、Bax以及cleaved Caspase.3水平上升（ P ＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6 馬錢苷對OGD/R誘導的神經元中AKT/AMPK/Nrf2通路蛋白表達的影響

OGD/R組較對照組p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、 Nrf2下降（ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋ L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢 苷組p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2升高（ P ＜0.05）； OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組較OGD/R＋H.馬錢苷組p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2下降（ P ＜0.05）。詳見圖3、表5。

3 討 論

據統計，腦卒中每年導致全球數百萬人腦損傷，盡管已知缺血會導致細胞損傷，但其潛在機制尚未明確，且目前還沒有確切的治療方法可以減少梗死面積或神經功能障礙 ?［15.16］ 。研究發現，馬錢苷可能是治療缺血性腦卒中的潛在神經保護劑 ?［17.18］ 。鐵死亡與腦卒中的發病機制密切相關 ?［19］ 。在本研究中，OGD/R處理后神經元線粒體出現碎片現象，嵴減少，線粒體膜密度有所增加（鐵死亡的主要特征），且神經元的細胞活力降低，細胞死亡增加，表明OGD/R促進了神經元損傷。馬錢苷處理后神經元線粒體中的線粒體嵴變得較為完整，碎片化現象消失，神經元的細胞活力增加，細胞死亡降低，提示馬錢苷可能對OGD/R神經元損傷起到了改善作用。

鐵死亡是一種細胞死亡形式，其特征在于脂質過氧化的鐵依賴性積累 ?［20］ 。4.HNE是脂質過氧化的最終產物，已被確定為參與調節細胞增殖、鐵死亡和細胞凋亡的關鍵第二信使 ?［21］ 。脂質ROS的積累是鐵死亡的一個重要指標 ?［22］ 。而GPX4是一種抗氧化防御酶，有研究發現，GXP4的消融會誘導鐵死亡并引發前腦神經元的神經變性 ?［23］ 。GPX4可使用GSH作為共底物減少脂質氫過氧化物，抑制鐵死亡 ?［24］ 。而NADPH可以誘導GSSG轉化為GSH ?［25］ 。NADPH和GSH的還原形式以及SOD是最重要的內源性抗氧化劑 ?［26］ 。 因此，本研究檢測以上指標觀察馬錢苷是否對鐵死亡 產生影響。結果發現，OGD/R處理后神經元中GSH/GSSG、 NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4水平均下降，Fe ?2＋ 含量、神經元中的細胞內和脂質ROS以及4.HNE、MDA水平增加，提示OGD/R可能降低了神經元的抗氧化能 力，誘導了鐵死亡。而馬錢苷處理后神經元中 GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4水平均升 高，Fe ?2＋ 含量、神經元中的細胞內和脂質ROS以及 4.HNE、MDA水平降低，證實馬錢苷有抗氧化作用，可減輕鐵死亡。

AKT和AMPK的磷酸化誘導Nrf2通路的活化，已有大量研究表明激活AKT/AMPK/Nrf2通路可以減輕炎癥和氧化應激損傷 ?［11］ ，研究發現，激活AMPK/Nrf2信號通路可能減輕IRI，發揮神經保護作用 ?［9］ 。本研究 結果發現，OGD/R處理后神經元中p.AKT/AKT、 p.AMPK/AMPK、Nrf2水平均下降，而馬錢苷使p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2升高，提示馬錢苷可能通過激活AKT/AMPK/Nrf2信號通路改善OGD/R誘導的神經元鐵死亡。為了進一步驗證馬錢苷的作用機制，本研究在使用馬錢苷處理的基礎上，加入AKT/AMPK/Nrf2通路抑制劑ML385，結果發現，ML385可減弱馬錢苷對OGD/R誘導的神經元鐵死亡的抑制作用，表明 馬錢苷可能通過激活AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R 誘導的神經元鐵死亡。

綜上所述，馬錢苷可能通過激活AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R誘導的神經元鐵死亡。然而，馬錢苷是否可以通過調節其他通路改善OGD/R誘導的鐵死亡，需要進一步深入探究。

參考文獻：

［1］ ?YE M， WU H，LI S G.Resveratrol alleviates oxygen/glucose deprivation/reoxygenation.induced neuronal damage through induction of mitophagy［J］.Molecular Medicine Reports，2021，23（1）：73.

［2］ ?SHE R N， LIU D H，LIAO J， et al. Mitochondrial dysfunctions induce Panoptosis and ferroptosis in cerebral ischemia/reperfusion injury：from pathology to therapeutic potential［J］.Frontiers in Cellular Neuroscience，2023，17：1191629.

［3］ ?WEILAND A ，WANG Y M，WU W H， et al. Ferroptosis and its role in diverse brain diseases［J］.Molecular Neurobiology，2019，56（7）：4880.4893.

［4］ ?XU Y D， CUI C，SUN M F， et al. Neuroprotective effects of loganin on MPTP.induced Parkinson′s disease mice：neurochemistry，glial reaction and autophagy studies［J］.Journal of Cellular Biochemistry，2017，118（10）：3495.3510.

［5］ ?ZHANG F， YAN Y，ZHANG J， et al. Phytochemistry，synthesis， analytical methods，pharmacological activity，and pharmacokinetics ?of loganin：a comprehensive review［J］.Phytotherapy Research，2022，36（6）：2272.2299.

［6］ ?WANG J W， PAN Y B，CAO Y Q， et al. Loganin alleviates LPS.activated intestinal epithelial inflammation by regulating TLR4/NF.κB and JAK/STAT3 signaling pathways［J］.The Kaohsiung Journal of Medical Sciences，2020，36（4）：257.264.

［7］ ?HUO K， XU J，MA K G， et al. Loganin attenuates neuroinflammation after ischemic stroke and fracture by regulating α7nAChR.mediated microglial polarization［J］.Environmental Toxicology，2023，38（4）：926.940.

［8］ ?ZHOU F， WANG M D，JU J， et al. Schizandrin A protects against ?cerebral ischemia.reperfusion injury by suppressing inflammation and oxidative stress and regulating the AMPK/Nrf2 pathway ?regulation［J］.American Journal of Translational Research，2019，11（1）：199.209.

［9］ ?WEI L J， ZHOU Q Q，TIAN H， et al. Integrin β3 promotes cardiomyocyte proliferation and attenuates hypoxia.induced apoptosis via regulating the PTEN/Akt/mTOR and ERK1/2 pathways［J］.International Journal of Biological Sciences，2020，16（4）：644.654.

［10］ ?LI Y， WANG X M.Chrysin attenuates high glucose.induced BMSC dysfunction via the activation of the PI3K/AKT/Nrf2 signaling ?pathway［J］.Drug Design，Development and Therapy，2022，16： 165.182.

［11］ ?PARK S Y ，CHO M H，LI M， et al. Petatewalide B alleviates oxygen.glucose deprivation/reoxygenation.induced neuronal injury via activation of the AMPK/Nrf2 signaling pathway［J］.Molecular Medicine Reports，2020，22（1）：239.246.

［12］ ?YUAN Y， ZHAI Y Y，CHEN J J， et al. Kaempferol ameliorates oxygen.glucose deprivation/reoxygenation.induced neuronal ferroptosis by activating Nrf2/SLC7A11/GPX4 axis［J］.Biomolecules，2021，11（7）：923.

［13］ ?ZHI S M， FANG G X，XIE X M， et al. Melatonin reduces OGD/R.induced neuron injury by regulating redox/inflammation/apoptosis signaling［J］.European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2020，24（3）：1524.1536.

［14］ ?CHENG Y C， CHU L W，CHEN J Y， et al. Loganin attenuates high glucose.induced schwann cells pyroptosis by inhibiting ROS generation and NLRP3 inflammasome activation［J］.Cells，2020，9（9）：1948.

［15］ ?KHOSHNAM S E ，WINLOW W，FARZANEH M， et al. Pathogenic mechanisms following ischemic stroke［J］.Neurological Sciences，2017，38（7）：1167.1186.

［16］ ?KURIAKOSE D， XIAO Z C.Pathophysiology and treatment of stroke：present status and future perspectives［J］.International Journal of Molecular Sciences，2020，21（20）：7609.

［17］ ?徐小雯， 李哲明，應夏麗.馬錢苷在腦缺血再灌注損傷中的作用及機制［J］.浙江醫學，2022，44（23）：2490.2498.

［18］ ?王璐， 付蓉，巫玉娟.馬錢苷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷神經保護作用及Wnt/β.catenin通路的影響［J］.中國老年學雜志，2022，42（18）：4531.4535.

［19］ ?XU S L， LI X W，WANG Y Q.Regulation of the p53.mediated ferroptosis signaling pathway in cerebral ischemia stroke （review）［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2023，25（3）：113.

［20］ ?LI D S， LI Y S.The interaction between ferroptosis and lipid metabolism in cancer［J］.Signal Transduction and Targeted Therapy，2020，5：108.

［21］ ?WANG F X， LI H Y，LI Y Q， et al. Can medicinal plants and bioactive compounds combat lipid peroxidation product 4.HNE.induced deleterious effects？［J］.Biomolecules，2020，10（1）：146.

［22］ ?XIE Z X ，HOU H D，LUO D， et al. ROS.dependent lipid peroxidation and reliant antioxidant ferroptosis.suppressor.protein 1 in rheumatoid arthritis：a covert clue for potential therapy［J］.Inflammation，2021，44（1）：35.47.

［23］ ?HAMBRIGHT W S ，FONSECA R S，CHEN L J， et al. Ablation of ferroptosis regulator glutathione peroxidase 4 in forebrain neurons promotes cognitive impairment and neurodegeneration［J］.Redox Biology，2017，12：8.17.

［24］ ?ZHANG Y L， SWANDA R V，NIE L T， et al. mTORC1 couples cyst（e）ine availability with GPX4 protein synthesis and ferroptosis regulation［J］.Nature Communications，2021，12：1589.

［25］ ?MORENO. SNCHEZ R，MARN.HERNNDEZ ，GALLARDO.PREZ J C， et al. Control of the NADPH supply and GSH recycling for oxidative stress management in hepatoma and liver mitochondria［J］.Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics，2018，1859（10）：1138.1150.

［26］ ?SOURI Z， KARIMI N，AHMAD P.The effect of NADPH oxidase inhibitor diphenyleneiodonium （DPI） and glutathione （GSH） on Isatis cappadocica，under Arsenic （As） toxicity［J］.International Journal of Phytoremediation，2021，23（9）：945.957.

（收稿日期：2022.10.10）

（本文編輯 鄒麗）