DTX3L在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥性的影響

[摘" "要]" "目的：分析DTX3L蛋白在結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）中的表達(dá)及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥性的影響。方法：收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié)直腸癌組織及配對的癌旁正常結(jié)腸組織病理標(biāo)本330例，采用免疫組織化學(xué)染色檢測癌組織及其癌旁正常結(jié)腸組織中DTX3L表達(dá)水平，分析DTX3L表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。繪制Kaplan-Meier生存曲線分析DTX3L表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。以慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建DTX3L敲低的人結(jié)腸癌細(xì)胞系（CACO-2），將倍數(shù)稀釋的奧沙利鉑加入DTX3L敲低組和NC組CACO-2細(xì)胞中，CCK8法檢測奧沙利鉑對兩組細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織中DTX3L表達(dá)水平顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。DTX3L表達(dá)水平與患者腫瘤T分期、N分期、pTNM分期有關(guān)（Plt;0.05）。DTX3L高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間（median survival time，MST）45.5個(gè)月，小于DTX3L低表達(dá)組的55.2個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。術(shù)后接受奧沙利鉑化療患者中DTX3L高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)（HR=1.81，95%CI：1.05～3.11，Plt;0.05）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DTX3L敲低組奧沙利鉑IC50為8.14 mg/mL，小于NC組的13.36 mg/mL。結(jié)論：結(jié)直腸癌患者癌組織中DTX3L表達(dá)上調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)，敲低DTX3L可增加CRC細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，DTX3L可能成為CRC患者的預(yù)后指標(biāo)和分子治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]" "結(jié)直腸癌;DTX3L;預(yù)后;奧沙利鉑;耐藥性

[中圖分類號]" "R735.3+5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.02.001

[文章編號]1006-2440（2024）02-0111-05

Expression of DTX3L in colorectal cancer and its effect on drug resistance of colorectal cancer cells

LI Zhipeng1， GENG Liangdong1， LIU Jibin2， WANG Xingdan3， DIAO Xun1， CUI Jinghong1， CUI Xiaopeng4

（1Medical College of Nantong University， Jiangsu 226001; 2Cancer Research Institute;3Department of Radiotherapy， Tumor Hospital Affiliated to Nantong University/Nantong Tumor Hospital;4Department of General Surgery， Affiliated Hospital of Nantong University）

[Abstract]" "Objective：To analyze the expression of DTX3L protein in colorectal cancer （CRC） and its impact on drug resistance of colorectal cancer cells. Methods： A total of 330 CRC tissue and adjacent normal colon tissue pathological specimens were collected from Affiliated Hospital of Nantong University. Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of DTX3L in cancerous and adjacent normal colon tissues， and the relationship between DTX3L expression and clinical pathological characteristics of patients was analyzed. Kaplan-Meier survival curves were plotted to analyze the relationship between DTX3L expression and the prognosis of CRC patients. A human colon cancer cell line （CACO-2） with DTX3L knockdown was constructed using lentiviral transfection. Diluted oxaliplatin was added to CACO-2 cells both in the DTX3L knockdown group and the NC group， and the half-maximal inhibitory concentration （IC50） values of oxaliplatin were detected using the CCK8 method. Results： The expression level of DTX3L in CRC tissue was significantly higher than that in adjacent normal colon tissue， with a statistical difference （Plt;0.05）. The expression level of DTX3L was related to the patients′ tumor T stage， N stage， and pTNM stage （Plt;0.05）. The median survival time （MST） of patients in the high DTX3L expression group was 45.5 months， which was shorter than the 55.2 months in the low DTX3L expression group， with a statistical difference （Plt;0.05）. In patients who underwent postoperative oxaliplatin chemotherapy， high expression of DTX3L was associated with poor prognosis （HR=1.81， 95%CI： 1.05～3.11， Plt;0.05）. Cellular experiments showed that the oxaliplatin half-maximal inhibitory concentration （IC50） for the DTX3L knockdown group was 8.14 mg/mL， lower than 13.36 mg/mL for the NC group. Conclusion： Upregulation of DTX3L expression in cancerous tissues of CRC patients is associated with poor prognosis. Knockdown of DTX3L can increase the sensitivity of CRC cells to oxaliplatin， and DTX3L may become a new prognostic marker and molecular therapeutic target for CRC patients.

[Key words]" "colorectal cancer; DTX3L; prognosis; oxaliplatin; drug resistance

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者約占全球每年新增癌癥和因癌癥死亡人數(shù)的10%，目前已成為世界范圍內(nèi)第三大癌癥死亡原因[1]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢。2020年我國新發(fā)CRC患者55.5萬余例，死亡28.6萬余例[2]。結(jié)直腸癌起病隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬于中晚期。目前對中晚期結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)為主，化療為輔[3]。奧沙利鉑作為一線化療藥物在臨床廣泛應(yīng)用，但有較多患者對以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療產(chǎn)生耐藥性，出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4-6]。因此，尋找新的分子治療靶點(diǎn)對提高晚期CRC患者的預(yù)后至關(guān)重要。Deltex-3樣蛋白（Deltex E3 ubiquitin ligase 3L，DTX3L）是一種E3泛素連接酶，屬于DTX家族成員[7]。研究發(fā)現(xiàn)，DTX3L參與腫瘤細(xì)胞的增生、黏附、凋亡等過程，增加腫瘤化療的耐藥性[7]。本研究收集2011年1月—2014年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院結(jié)直腸癌組織病理標(biāo)本330例，分別取CRC組織及其對應(yīng)的癌旁正常結(jié)腸組織制作組織芯片，采用免疫組織化學(xué)染色、基因芯片技術(shù)探究DTX3L在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，采用人結(jié)腸癌細(xì)胞系CACO-2，分析DTX3L表達(dá)對CRC細(xì)胞奧沙利鉑耐藥的影響。

1" "資料與方法

1.1" "組織及細(xì)胞" "結(jié)直腸癌組織病理標(biāo)本330例，分別取CRC組織及其對應(yīng)的癌旁正常結(jié)腸組織制作組織芯片。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）手術(shù)后病理確診為CRC;（2）臨床臨床及病理資料完整;（3）隨訪截至?xí)r間2021年12月31日，隨訪信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤;（2）術(shù)前進(jìn)行化學(xué)治療、放射治療或聯(lián)合治療等。330例患者均接受根治性手術(shù)治療，其中180例患者在手術(shù)后進(jìn)行含有奧沙利鉑方案的化療。人結(jié)腸癌細(xì)胞系CACO-2來自南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2" "免疫組織化學(xué)染色" "組織芯片依次經(jīng)烘片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，在組織切片上滴加稀釋后的DTX3L抗體（1∶200），再滴加二抗，在室溫下避光孵育20 min。將稀釋后的DAB滴在組織切片上，待顯色反應(yīng)陽性時(shí)立刻用流水沖洗，脫水后封片。染色后的組織芯片由兩名臨床病理醫(yī)師以雙盲方式獨(dú)立讀片，根據(jù)染色程度和染色陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分。每個(gè)組織隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃褐色顆粒為準(zhǔn)，最終評分根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色程度和陽性染色細(xì)胞的百分比確定。染色程度評分標(biāo)準(zhǔn)：幾乎無染色計(jì)0分，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)稀疏棕色顆粒計(jì)1分，出現(xiàn)較多黃棕色顆粒計(jì)2分，出現(xiàn)彌漫性黃棕色顆粒計(jì)3分。陽性染色細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：在高倍鏡下，選取視野中央?yún)^(qū)域的50個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄陽性染色細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算陽性染色細(xì)胞百分比。染色程度的得分乘以陽性染色細(xì)胞百分比，得出H值。H值=0為陰性（-），0lt;H值lt;1為弱陽性（+），1≤H值lt;2為中度陽性（++），2≤H值lt;3為強(qiáng)陽性（+++）。H值0～1視為低表達(dá)，2～3視為高表達(dá)。

1.3" "細(xì)胞培養(yǎng)與病毒轉(zhuǎn)染" "CACO-2細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行傳代。將第二代細(xì)胞以2×105/孔密度接種到12孔板中，根據(jù)感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI）及病毒滴度計(jì)算病毒體積，CACO-2細(xì)胞MOI值設(shè)定為50，在每個(gè)孔中加入1 mL含2×105 pfu/mL病毒濃度的培養(yǎng)基，24 h后以富含血清的完全培養(yǎng)基換液。4 h后用嘌呤霉素殺滅未轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞，20 h后收集轉(zhuǎn)染后狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4" "蛋白免疫印跡檢測" "采用RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞提取蛋白，Nanodrop1000分光光度計(jì)測量蛋白濃度。取蛋白樣品進(jìn)行電泳，再轉(zhuǎn)至PVDF膜，在5%脫脂牛奶中室溫下封閉2 h。加入一抗孵育過夜（DTX3L稀釋比例1∶1 000，GD為1∶2 000，購自Abcam公司）。TBST洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，再用TBST洗膜。按照說明書配制ECL超敏顯影劑，使用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯影并保存。

1.5" "CCK-8法測定" "取對數(shù)生長期的CACO-2 DTX3L敲低細(xì)胞及CACO-2 NC細(xì)胞進(jìn)行酶解、離心。離心后重懸細(xì)胞，按5×103/孔細(xì)胞密度在96孔板中鋪板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后分別加入含不同梯度濃度奧沙利鉑的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔避光加入10 μL CCK-8溶液后放入培養(yǎng)箱，2 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。繪制細(xì)胞增殖曲線，得出各組細(xì)胞半抑制濃度（IC50）。

1.6" "統(tǒng)計(jì)學(xué)處理" "使用Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier生存曲線分析DTX3L表達(dá)對結(jié)直腸癌患者預(yù)后生存的影響。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "結(jié)直腸癌組織與癌旁正常結(jié)腸組織中DTX3L蛋白表達(dá)" "免疫組化染色顯示，結(jié)直腸癌組織中DTX3L表達(dá)陽性率為87.9%，主要表達(dá)在胞漿中。癌旁正常結(jié)腸組織中DTX3L表達(dá)陽性率為18.9%。CRC組織中DTX3L表達(dá)水平明顯高于癌旁正常結(jié)腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.80，Plt;0.0001）。見圖1。330例CRC患者癌組織中240例DTX3L高表達(dá)，90例DTX3L低表達(dá)。

2.2" "DTX3L表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系" "DTX3L表達(dá)與腫瘤T分期、N分期、pTNM分期有關(guān)（Plt;0.05），但與患者年齡、性別、腫瘤M分期無關(guān)（Pgt;0.05）。見表1。對所有330例患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，結(jié)果表明DTX3L表達(dá)水平與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)，其中高表達(dá)組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為2.16（95% CI：1.51～3.10，Plt;0.05），中位生存時(shí)間（median survival time，MST）45.4個(gè)月，小于DTX3L低表達(dá)組的55.2個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。對術(shù)后接受含奧沙利鉑方案化療的180例患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，同樣顯示DTX3L高表達(dá)組患者死亡HR為1.81（95% CI：1.05～3.11，Plt;0.05），高于低表達(dá)組患者。見圖2。

2.3" "NC細(xì)胞與DTX3L敲低細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性比較" "Western blot檢測顯示，DTX3L敲低組細(xì)胞DTX3L表達(dá)顯著降低。CCK-8法檢測顯示，DTX3L敲低組奧沙利鉑抑制細(xì)胞IC50為8.14 mg/mL，小于NC組的13.36 mg/mL，表明DTX3L敲低增加CACO-2細(xì)胞對化療藥物的敏感性。見圖3。

3" "討" " " 論

雖然CRC治療已取得明顯進(jìn)展，但化療耐藥性仍是臨床面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。奧沙利鉑用于CRC一線治療具有較好的效果，然而部分患者對其產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致預(yù)后不良[4]，因此，尋找逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑耐藥的新靶點(diǎn)具有重要意義。

近期研究發(fā)現(xiàn)，DTX3L蛋白及其泛素化底物參與多種信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附、增殖、遷移和化療耐藥[9-10]。DTX3L通過抑制caspase-3和PARP1表達(dá)，進(jìn)而抑制骨髓瘤細(xì)胞凋亡，增加化療耐藥性[11]。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，DTX3L促進(jìn)BRCA1、RAP80向DNA損傷部位募集，從而加快DNA損傷修復(fù)[12]。在結(jié)直腸癌中，DTX家族成員之一DTX4增加泊馬度胺（pomalidomide）的敏感性[13]。

本研究中對330例結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，分析DTX3L表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)DTX3L表達(dá)與腫瘤T分期、N分期、pTNM分期有關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，DTX3L高表達(dá)患者的預(yù)后差，總生存期較短。術(shù)后進(jìn)行奧沙利鉑化療的180例患者Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，DTX3L高表達(dá)組患者的預(yù)后更差，提示DTX3L高表達(dá)可能增加CRC細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，奧沙利鉑對DTX3L敲低組CRC細(xì)胞的IC50小于NC細(xì)胞，表明DTX3L敲低可增加CRC細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性。

綜上所述，DTX3L在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并與患者不良預(yù)后相關(guān)。DTX3L增加CRC細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性，可能成為CRC患者的預(yù)后指標(biāo)和分子治療的新靶點(diǎn)。

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（本文編輯" "趙喜）

* [基金項(xiàng)目] 江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（SJCX22_1629，SJCX22_1637）;南通市科技局課題（JC22022009，JC22022027）;南通市衛(wèi)生健康委員會課題（MS2023056）。

** [作者簡介] 李志鵬，男，漢族，浙江麗水人，生于1998年12月，碩士。研究方向：結(jié)直腸癌的診斷及治療。" "通信作者：崔小鵬，E-mail： cuixiaopeng2000@163.com

[引文格式]李志鵬，耿良棟，劉繼斌，等. DTX3L在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥性的影響[J]. 交通醫(yī)學(xué)，2024，38（2）：111-115.