蘇州地區孕婦群體CD36抗原篩查結果分析

[摘" "要]" "目的：初步篩查蘇州地區孕婦群體血小板CD36抗原和抗體表達，為預防CD36抗體介導的胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥（fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia，FNAIT）奠定基礎。方法：收集102例孕婦EDTA抗凝全血標本，采用流式細胞術檢測CD36抗原表型，PCR擴增及基因測序檢測CD36缺失標本基因突變位點，結合Luminex技術檢測CD36抗體表達強度。結果：102例標本中CD36缺失頻率為2.94%（3/102），其中2例I型CD36缺失標本檢出較強效價的CD36抗體，基因測序顯示存在c.1228_1239delATTGTGCCTATT純合突變和c.1006+2 Tgt;G+c.1156 Cgt;T復合雜合突變;1例II型CD36缺失標本未檢測到CD36基因突變。3例CD36缺失孕婦尚未發現FNAIT癥狀。結論：蘇州地區孕婦群體CD36抗原缺失頻率略高，臨床需加深對CD36抗體介導FNAIT的認識，加強對I型缺失孕婦臨床追蹤評估，做好FNAIT的預防和治療。

[關鍵詞]" "CD36缺失;胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥;基因突變

[中圖分類號]" "R722.1 [文獻標志碼]" "B [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.02.020

[文章編號]1006-2440（2024）02-0181-05

CD36又稱血小板糖蛋白IV（glycoprotein IV，GP IV），為血小板非特異性抗原，廣泛表達于血小板、單核細胞、內皮細胞、脂肪細胞等細胞表面，已被國際輸血協會（International Society of Blood Transfusion，ISBT）命名為新的紅細胞血型系統（ISBT 045），該系統目前僅發現1個抗原CD36.1（045001）。近年來CD36抗體導致的胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥（fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia，FNAIT）屢見不鮮，嚴重者可導致胎兒死亡[1-5]。據報道，I型CD36抗原缺失易產生CD36抗體而發生同種免疫性反應，而II型CD36缺失發生同種免疫性反應的風險較低[6-7]。由于CD36抗體介導的FNAIT或將成為引起我國胎兒/新生兒死亡的主要原因之一，對孕婦血液標本進行CD36抗原篩查具有重要意義。本研究對蘇州地區102例孕婦血液標本進行血小板CD36抗原和抗體篩查，報告如下。

1" "材料與方法

1.1" "標本來源" "隨機收集南京醫科大學附屬蘇州醫院/蘇州市立醫院2023年8月28—29日102例孕婦EDTA抗凝全血標本1 mL，立即檢測或在4 ℃保存12 h后檢測。。

1.2" "試劑與儀器" "PE anti-human CD36（批號：336206）、FITC anti-human CD14（批號：325604）（BioLegend，上海達科為生物技術有限公司）;10×紅細胞溶血劑（批號：A11895，Beckman Coulter）;DNA提取純化試劑盒（批號：0000481104;Promega）;PCR擴增反應混合液（批號：00000211042，Promega）;PAK LxTM Assay試劑盒（批號：3012631，Immucor）;流式細胞儀（型號：DxFLEX;Beckman Coulter）;Luminex檢測設備（型號：FLEXMAP-3D，Luminex）;全自動核酸提取純化儀（型號：MX3031，Promega）;PCR擴增儀（型號：GenAmp9700，Applied-Biosystems）。

1.3" "血小板表面CD36抗原檢測" "將EDTA抗凝全血標本200 g離心5 min，取上層富血小板血漿移入干凈試管中，1 200 g離心5 min，分離血小板（血漿留存備用），0.2% EDTA-PBS洗滌離心（1 200 g，5 min），并重懸血小板。取100 μL血小板懸液與PE anti-human CD36抗體室溫孵育20 min，以800～1 000 μL 0.2% EDTA-PBS洗滌離心（1 200 g，5 min），棄上清后用300 μL 0.2% EDTA-PBS重懸血小板，于流式細胞儀檢測血小板表面CD36平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.4" "單核細胞表面CD36抗原檢測" "對血小板CD36抗原表達陰性標本檢測單核細胞CD36表達水平。取100 μL EDTA抗凝全血標本于流式細胞管中，加入1×紅細胞溶血劑1 mL，室溫避光10～15 min（期間震蕩數次），而后加入2 mL PBS洗滌離心2遍（350 g，5 min），棄上清后用100 μL PBS重懸細胞。分別加入PE anti-human CD36、FITC anti-human CD14，4 ℃避光孵育 20 min。加入800～1 000 μL PBS 洗滌離心（350 g，5 min），300 μL PBS重懸細胞，于流式細胞儀檢測CD14+單核細胞表面CD36抗原的MFI值。

1.5" "CD36抗體檢測" "按照PAK LxTM Assay試劑盒說明書對3例CD36缺失標本的血漿進行人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）、CD36抗體檢測，通過Luminex檢測設備捕獲特異性熒光結合微珠，并使用配套分析軟件解讀數據，判斷是否存在血小板抗體及其種類。按照熒光微球MFI值判定抗體結果，MFIlt;500為陰性，MFI≥500則為陽性。

1.6" "CD36基因突變位點檢測" "首先采用DNA提取試劑盒提取3例CD36缺失標本的DNA，然后參照先前已報道的擴增及測序流程進行PCR-SBT測序分析[8]，并采用Chromas軟件和DNAMAN軟件對基因突變位點進行分析。

2" "結" " " 果

2.1" "CD36表型分型" "經流式細胞術對102例孕婦血小板及CD14+單核細胞CD36抗原表達水平檢測，發現有3例標本（No.286、287、353）血小板CD36抗原表達缺失（圖1A），占比2.94%（3/102）;3例標本中有2例（No.286、353）CD14+單核細胞CD36抗原表達陰性，為I型CD36缺失，另1例（No.287）CD14+單核細胞CD36抗原表達陽性，為II型CD36抗原缺失（圖1B）。

2.2" "CD36缺失標本血小板抗體檢測" "采用Luminex技術檢測CD36缺失標本中是否存在血小板抗體。2例I型CD36缺失標本血漿中CD36抗體呈陽性，其中No.286標本CD36抗體MFI為2 793，No.353標本CD36抗體MFI為1 749，這2例標本也檢測到可疑HPA抗體（抗體MFI位于cut-off值附近，MFI=500～1000），見表1。

2.3" "CD36缺失標本基因突變分析" "對3例CD36缺失標本基因外顯子（exon1-15）進行擴增和PCR-SBT測序。II型CD36缺失標本（No.287）未見基因突變，而2例I型CD36缺失標本（No.286和No.353）均檢測到基因突變，如表2所示。

2.4" "CD36表達陰性孕婦臨床資料回顧性調查" "3例CD36表達陰性孕婦均無輸血史和生產史，No.353孕婦有2次懷孕史，其中1次不明原因流產。見表3。

3" "討" " " 論

我們在前期對蘇州地區無償獻血者CD36抗原進行初步篩查，發現CD36抗原缺失頻率為2.13%，在此基礎上建立蘇州地區CD36陰性表型資料庫，以應對臨床因CD36抗體導致的血小板輸注無效和FNAIT現象[6]。本研究對孕婦群體CD36抗原展開篩查，發現孕婦CD36抗原缺失頻率為2.94%，略高于無償獻血者CD36缺失率，但兩者差異尚無統計學意義（P=0.4837，Fisher′s test）。在2例I型CD36缺失者體內不僅檢出較強的CD36抗體，還檢出可疑的HPA抗體，這大大增加FNAIT發生幾率。

我國針對FNAIT的預防一般建議所有孕婦進行HPA抗體篩查，出現抗篩陽性則進行抗體鑒定及抗體效價監測，特別對存在HPA抗體免疫風險的孕婦每2周監測抗體效價，評估抗體效價的增長，直至妊娠結束，以判斷HPA抗體介導的FNAIT嚴重程度及采取的干預措施。本文中2例孕婦體內存在可疑HPA抗體，建議臨床在后續產檢中追蹤HPA抗體的效價，警惕發生FNAIT。

此前多篇文章已報道CD36抗體是繼HLA抗體和HPA抗體后最常見的血小板抗體，與亞洲人群FNAIT疾病密切相關，而在中國由CD36抗體引起的FNAIT甚至比HPA同種抗體更為常見[1，3-4，9]。與其他類型抗體介導的FNAIT不同，CD36抗體病例通常與貧血及胎兒水腫有關。CD36抗體與紅細胞前體細胞反應可導致CD34+紅細胞/髓前體細胞凋亡，引起胎兒宮內貧血;CD36抗體還通過與單核細胞相互作用，增加血管內皮細胞通透性，使血管內皮細胞功能發生障礙，導致胎兒/新生兒水腫和腦積水[10-11]。FNAIT是以血小板減少為主要特征的妊娠疾病，可引發胎兒/新生兒出血，主要風險為顱內出血，嚴重影響胎兒/新生兒生存質量[12]。本文2例I型CD36抗原缺失者都為年輕孕婦，此前均無生產史，未接受過任何形式的輸血，其中1例孕婦不明原因流產1次。這2例I型CD36抗原缺失孕婦體內高強度的CD36抗體或許是由于胎兒血小板上來自父親CD36基因的刺激，從而引發同種免疫性反應導致CD36抗體的產生。CD36抗體又可借助胎盤進入胎兒體內，破壞胎兒血小板，從而引起血小板減少癥。目前No.353孕婦已生產，未發生FNAIT現象，而No.286孕婦目前各項指征平穩，隨著孕周延長，CD36抗體借助胎盤進入胎兒體內引起同種免疫性反應強度可能增加，尚需加強檢測警惕發生FNAIT的可能。一旦發生FNAIT，臍血檢測后可行宮內輸注CD36陰性紅細胞和血小板，以糾正胎兒貧血和血小板低下[3，11]。

I型CD36缺失主要由于純合突變和復合雜合突變導致血小板和單核細胞均不表達CD36抗原，而II型CD36缺失是血小板不表達CD36抗原，但其原因較復雜，部分II型缺失標本并未檢測到基因突變。目前對CD36缺失機制解釋除了編碼區突變外，非編碼區的剪接突變也越來越被重視。本研究中No.353 I型CD36缺失者分別在第10外顯子和第12外顯子發生c.1006+2 Tgt;G和c.1156 Cgt;T復合雜合突變。c.1006+2 Tgt;G突變是位于第10外顯子后內含子的第2個堿基的剪切突變，導致CD36從274號氨基酸開始出現移碼突變，且于289號氨基酸變為終止子，使得CD36氨基酸序列發生改變并提前終止[13];而c.1156 Cgt;T為錯義突變，導致第386位精氨酸變為色氨酸，從而CD36蛋白結構發生改變，表現為CD36抗原表達缺失[14-15]。No.286 I型CD36缺失者第13外顯子存在1228_1239delATTGTGCCTATT純合突變，導致410_413位Ile-Val-Pro-Ile氨基酸缺失，使CD36前體蛋白的轉運功能受損，進而導致CD36蛋白表達缺失[16-17]。

CD36作為血小板同種抗原在血小板同種免疫反應中發揮重要作用。CD36抗原缺失者經輸血、移植或妊娠等途徑被CD36抗體免疫，除了介導FNAIT外，還易導致血小板輸注無效、輸血后紫癜以及引發輸血相關急性肺損傷[15，18]。因此，本研究檢測到的3例CD36抗原缺失者，尤其是2例I型缺失孕婦，除了需警惕在孕期發生FNAIT現象外，還要避免輸血以防同種免疫性反應的發生。此外，鑒于前期無償獻血者CD36抗原的篩查及本研究對孕婦群體的篩查，蘇州地區CD36缺失問題不容忽視，建立CD36陰性供者資料庫十分必要。

近年來我國陸續報道CD36抗體引發的FNAIT，尤以廣東地區居多，部分研究已闡明CD36抗體引發FNAIT的機制，這對臨床預防和治療這類疾病具有重要意義。建議臨床科室增加CD36相關檢測項目，供孕婦在產檢時有選擇性的篩查CD36抗原和抗體，以進一步預防FNAIT。臨床各科室應與血液中心或血站緊密聯系，確保CD36陰性孕婦或臨床血小板輸注患者在需要時能及時輸注CD36抗原陰性的紅細胞和血小板。

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（本文編輯" "王曉蘊）

* [基金項目] 蘇州市衛生青年骨干人才“全國導師制”培訓項目（Qngg2022033）;蘇州市姑蘇衛生人才計劃（GSWS2022096;2022-160）;蘇州市醫學重點學科項目（SZXK202118）。

** [通信作者] 張祥云，E-mail：szbc@live.com

[引文格式]何紅紅，俞錢，張祥云. 蘇州地區孕婦群體CD36抗原篩查結果分析[J]. 交通醫學，2024，38（2）：181-185.