茶樹GATA基因家族的全基因組鑒定及表達分析

青亞林　侯炳豪　張宇航　曾珊珊　高婷　葉乃興

摘要：植物轉錄因子GATA與靶基因啟動子上的WGATAR序列結合，改變下游靶基因的轉錄，從而調控植物的生長發育。對茶樹GATA轉錄因子的生物學信息特征進行鑒定與分析，為后續茶樹栽培育種等相關研究提供理論依據。利用生物信息學方法及實時熒光定量PCR技術，對茶樹GATA家族基因進行全基因組鑒定與表達分析。結果表明，（1）鑒定出的35個茶樹GATA基因分布于13條染色體上，亞細胞定位預測主要在細胞核上。（2）系統進化分析將茶樹GATA基因家族成員分為4個亞族。（3）茶樹GATA啟動子順式作用元件分析顯示，茶樹GATA啟動子上有許多光響應、激素信號響應與環境脅迫響應相關的元件。（4）組織特異性分析顯示，GATA基因在茶樹不同組織中的表達模式有顯著差異，多數基因在芽上具有較高的表達。（5）實時熒光定量PCR分析結果顯示，在不同處理下，茶樹GATA家族基因表達量總體呈下調趨勢，其中CsGATA1表達量下調最顯著。CsGATA對逆境脅迫響應敏感，說明CsGATA可能參與調控茶樹不同生長發育過程，其中CsGATA1可能參與茶樹生長發育及逆境脅迫響應的調控。

關鍵詞：茶樹；GATA基因家族；生物信息學；基因表達；全基因組鑒定

中圖分類號：S571.101 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0042-09

GATA基因是真核生物中普遍存在的調控因子之一，鋅指結構是它的顯著特征，可以特異性地結合靶基因序列，起到調控相關基因表達的作用。GATA基因家族最先在動物體中發現，之后陸續在真菌和植物體中發現［1］。GATA基因家族在植物的應激信號轉導和逆境脅迫響應等環節起著關鍵作用，是廣泛存在于植物體中的重要調節因子之一［2］。

植物中GATA家族基因與靶基因啟動子上的 W-GATA-R 序列結合，通過改變轉錄過程來調控植物的生長發育［3］，包括調控細胞生長和花朵發育［4］，調節葉綠體的形成［5］，調節干旱、冷害、鹽害等逆境脅迫響應過程［6-7］和植物葉片衰老［8］等生物學過程。

測序技術的不斷提高，推動生物信息學快速發展，有益于探究GATA基因家族在基因表達調控過程中發揮的作用，進而發揮其功能提高植物的抗逆性促進植物生長發育［9］。茶樹是重要的葉用類經濟作物，茶樹GATA基因家族的鑒定分析對研究茶樹生長發育和逆境防御反應等有一定意義，可為茶樹栽培和優良品種選育提供相關參考［10］，也能提升茶葉的產量和品質，增加經濟效益。近年來有部分茶樹基因家族如MYC［11］、YIFY［12］、U-box［13］等也逐漸被鑒定分析報道出來，為茶樹基因家族的研究提供了資源，但關于茶樹GATA基因家族的分析尚未見報道。本研究通過對茶樹GATA基因家族進行鑒定分析，了解該基因在茶樹環境脅迫時的表達特點與響應機制等，以期為之后的茶樹栽培與育種等工作提供一些參考信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2023年2月在福建農林大學茶學福建省重點實驗室進行試驗。選取全國優良茶樹品種——鐵觀音 （編號：GS13007—1985）為試驗原料。原料參照陳丹等的方法［14］進行以下處理。

逆境脅迫處理：4 ℃低溫處理：將在正常環境下生長的茶樹植株轉移到4 ℃人工氣候箱中培養以及干旱處理（10%PEG-6000溶液）；激素處理：用 100 μmol/L 的GA、MeJA和ABA處理不同株的鐵觀音茶樹。分別處理0、3、6、12、24 h后取茶樹春梢頂芽下第2葉。每個處理取3次生物學重復，后用錫紙包裹并標記，再用液氮速凍后儲存在-80 ℃冰箱中［15］。

1.2 茶樹GATA基因家族的鑒定

從NCBI數據庫中下載茶樹GATA基因家族的基因組序列。利用SMART軟件和HMMER軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）對茶樹GATA基因家族成員進行鑒定，最終篩選得到35個基因。

1.3 茶樹GATA基因的序列特征

利用TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）軟件制作茶樹GATA基因在染色體上的位置圖，通過Expasy（http：//www.expasy.org/proteomics）預測CsGATA蛋白的氨基酸個數、分子量以及等電點等。在數據庫中下載并提取每個茶樹GATA基因啟動子上游2 kb的序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare）預測啟動子順式作用元件。下載模式植物擬南芥的GATA基因家族成員蛋白序列，使用MEGA 7.0軟件與鐵觀音茶樹GATA基因家族成員共同構建系統進化樹，使用鄰接法（neighbor-joining，NJ），設置Bootstrap參數為1 000［16］。

1.4 茶樹GATA基因結構、蛋白保守基序分析

在GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）上分析CsGATA基因家族成員的基因結構。在SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）上下載各CsGATA家族基因編碼區氨基酸序列。用MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）分析CsGATA基因家族成員的保守基序，再用TBtools軟件繪制保守基序圖。

1.5 茶樹GATA基因組織特異性表達分析

下載鐵觀音茶樹的轉錄組數據，參照前人方法［17］計算獲得CsGATA基因在茶樹芽、莖、嫩葉、老葉、花和根中的FPKM值，再用TBtools軟件繪制茶樹GATA基因的表達熱圖。

1.6 實時熒光定量PCR分析

根據茶樹GATA基因組織特異性表達分析結果，篩選出在鐵觀音茶樹頂芽中表達量高的6個茶樹GATA基因，用Primer3Plus（http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）設計引物（表1）。內參基因選擇CsGAPDH（登記號GE651107）［18］。采用植物總RNA提取試劑盒對收集的樣品提取總RNA，使用全式金Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒合成cDNA用于后續基因表達水平的檢測。根據全式金Transstart Tip Green qPCR superMix試劑盒的操作步驟，在CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環，設置3次重復，反應結束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線［16］。用相對定量法（2-ΔΔCT）［19］計算基因表達水平，用SPSS 20軟件進行顯著性分析，用Prism 8軟件制作柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 茶樹GATA基因家族的鑒定與理化性質分析

從茶樹中共鑒定出35個CsGATA基因，根據基因在染色體上的位置將其分別命名為CsGATA1～

CsGATA35（表2）。通過ProParamran網站對CsGATA蛋白的理化特性進行分析，35個CsGATA基因編碼的蛋白長度在135～603 aa 之間，蛋白分子量大小在15.17～66.60 ku之間，理論等電點在4.74～9.99之間。亞細胞定位預測發現，該家族基因主要定位在細胞核（31個CsGATA）、葉綠體（3個CsGATA）、線粒體（1個CsGATA）中，推測茶樹GATA基因主要在細胞核中表達。全部基因的平均親水性指數都是負數（-1.047～-0.384），說明茶樹GATA蛋白皆為親水蛋白。

用從鐵觀音茶樹基因組中篩選獲得的35個GATA基因家族成員，制作茶樹GATA基因在染色體上的位置分布，結果（圖1）表明，茶樹GATA基因分布在13條染色體上，其中①、③號染色體上各分布有5個基因，⑧號和B12號染色體上各分布有4個基因，②號染色體上分布有3個基因，⑤、⑥、⑦、⑨、⑩、B13號染色體上各分布有2個基因，其他染色體上都只分布了1個基因。依據染色體上CsGATA基因不同的位置分布順序，把基因依次命名為CsGATA1～CsGATA35。

2.2 茶樹GATA基因家族進化

將鐵觀音茶樹和擬南芥的GATA家族基因放置在一起構建系統進化樹（圖2），便于觀察茶樹GATA基因家族的進化關系。由系統進化樹可知，茶樹GATA分為4個亞族。擬南芥作為模式植物其功能研究的比較清楚，因此和擬南芥GATA基因位于同一分支上的茶樹GATA基因屬于同一亞族，說明同一亞族成員之間的基因結構與功能具有相似性。

2.3 茶樹GATA基因家族的啟動子順式元件

對茶樹GATA基因家族成員啟動子上游2 000 bp

進行順式作用元件分析（圖3）。這其中包括有和環境脅迫響應相關的元件， 如ARE（厭氧誘導）、 MBS（干旱）、TC-rich repeats（防衛與應激）、LTR（低溫）；和激素響應相關的元件，如ABRE（脫落酸）、P-box （赤霉素）、TCA-element（水楊酸）、TGA-element（生長素）、CGTCA-motif（茉莉酸甲酯）等；和植物生長相關的元件O2-site（玉米醇溶蛋白代謝）等，以及許多光響應相關的元件。由此可知，茶樹GATA基因中含有許多響應非生物脅迫、生物脅迫、生長發育調控及光響應等的作用元件，說明CsGATA可能是茶樹生長發育與逆境脅迫響應的調控基因之一。

2.4 茶樹GATA的基因結構和Motif序列分析

利用GSDS網站繪制茶樹GATA基因結構圖。由圖4可知，茶樹GATA基因家族成員的內含子和外顯子情況。亞族Ⅰ中的CsGATA5、CsGATA31有8個內含子，其他基因有2～3個內含子。亞族Ⅱ中的CsGATA13沒有內含子，其余基因含有1～3個內含子。亞族Ⅲ中的基因內含子數在6～10個之間。亞族Ⅳ中的基因內含子數在4～9個之間。同一亞族具有相似的基因結構，且內含子數量與長度總體相似；但是第Ⅰ亞族中的CsGATA26的基因結構與同亞族中的其他成員有較大差異，也許是進化時發生了內含子插入的原因；第Ⅰ亞族和第Ⅱ亞族中的基因內含子長度較短，個數相對較少；第Ⅲ亞族和第Ⅳ亞族中的基因內含子長度較長，個數較多。

茶樹GATA基因家族成員保守基序分析顯示，進化上同源關系較近的成員一般具有相似的保守基序（圖4）。亞族Ⅰ中的基因都有Motif1元件，排列方式多為 Motif1～Motif6。亞族Ⅱ中的CsGATA13只含有Motif1、Motif2元件，CsGATA2只含有Motif4、Motif1元件，其余的基因都含有Motif1、Motif2和其他元件，并且排列方式多為 Motif8-Motif4-Motif7-Motif1-Motif2。亞族Ⅲ中的蛋白含有4個相同的Motif元件，并且排列方式都為Motif5-Motif6-Motif1-Motif9。亞族Ⅳ基因中除CsGATA19只含有1個Motif1元件外，其余的都含有Motif1、Motif10元件，并且排列方式都為 Motif1-Motif10。亞族Ⅲ中的蛋白保守基序是完全相同的，亞族Ⅱ中的蛋白間存在保守基序差異，說明該基因可能在進化過程中發生了變化。不過絕大部分的茶樹GATA基因還是遵守系統進化樹的分族規律。

2.5 茶樹GATA家族基因組織特異性分析

為進一步探究GATA基因在茶樹生長發育中的作用，篩選出35個CsGATA基因（FPKM≥10）繪制表達量熱圖。茶樹6個組織部位（芽、莖、嫩葉、老葉、花、根）中均有CsGATA基因表達，說明不同CsGATA可能參與調控了茶樹不同生長發育過程（圖 5）。茶樹GATA基因在幼嫩芽葉中表達量較高，老葉、花、根中表達量較低。在芽中表達量較高的基因有CsGATA17、CsGATA7、CsGATA8、CsGATA3、CsGATA21、 CsGATA20、 CsGATA4、CsGATA30，在莖中表達量較高的基因有CsGATA27、CsGATA6、CsGATA35，在嫩葉中表達量較高的基因有CsGATA11、CsGATA5，在老葉中表達量較高的基因有CsGATA24、CsGATA31、CsGATA33，在花中表達量較高的基因有CsGATA9、CsGATA28、CsGATA11，[JP3]在根中表達量較高的基因有CsGATA32、CsGATA12、CsGATA14、CsGATA25。

2.6 茶樹GATA基因在逆境脅迫下的表達分析

為進一步研究茶樹GATA基因的潛在功能和在逆境脅迫下的表達模式，用4 ℃的低溫、100 μmol/L的GA、MeJA、ABA激素溶液和10% PEG-6000溶液對茶樹進行處理，并對6個茶樹GATA基因的表達進行 qRT-PCR分析。結果表明，經4 ℃低溫處理3、6、12 h后全部基因表達量下調（圖6）。處理時間達到24 h后，僅CsGATA7基因表達量上調，其余基因表達量都下調，CsGATA7表達量最高。經PEG干旱處理后，全部基因在處理3、12、24 h后表達量都下調。在處理6 h后，除CsGATA7基因表達量上調外，其他基因表達量都下調。經GA處理后，全部基因在處理3 h后表達量都下調（圖7），在處理6、12、24 h后，除基因CsGATA7表達量都上調外，其他的基因表達量都下調；經MeJA處理后，全部基因表達量都下調；經ABA處理后，全部基因在處理3、12、24 h后表達量都下調。在處理6 h后，除CsGATA7基因表達量上調外，其他基因表達量都下調。由圖6、圖7可知，茶樹GATA基因家族成員在不同處理下有特異性和多樣性的表達水平。

3 討論與結論

3.1 討論

本研究對鐵觀音茶樹全基因組進行鑒定，獲取了35個茶樹GATA基因家族成員，并對這35個成員進行相關理化性質分析。分析得知，35個茶樹GATA 基因分布在13條染色體上，茶樹GATA編碼蛋白長度處于135～603 aa之間，蛋白分子量介于15.17～66.60 ku之間，PI在4.74～9.99之間，茶樹GATA蛋白都是親水性蛋白。亞細胞定位預測分析發現茶樹GATA基因家族成員主要定位于細胞核，說明茶樹GATA可能主要在細胞核中發揮作用。茶樹GATA家族基因的鋅指結構域皆有良好的保守性，與已報道的擬南芥［1］、谷子［20］、水稻［21］及玉米［22］等的研究基本一致。啟動子順式作用元件分析表明，茶樹GATA基因中含有很多的光響應、激素響應和逆境脅迫響應等順式作用元件。說明GATA是茶樹生長發育及逆境脅迫響應重要的調控基因之一，這與前人研究的GATA基因廣泛參與了色素代謝調節、逆境脅迫響應以及質體發育調控［23］相一致。

根據茶樹與擬南芥共同構建的進化樹分析顯示，茶樹GATA基因家族分為4個亞族。同時，結合茶樹GATA成員基因結構和蛋白保守基序分析結果可知，同一亞族上的成員具有類似的基因結構和蛋白保守基序，說明位于同一亞族上的基因保守性更高，可能具有相似功能［24］，這與棗［25］和高粱［26］的結果一致；由茶樹GATA基因組織特異性表達分析結果可知，大部分茶樹GATA基因在芽和嫩葉中的表達量比老葉、花和根部高很多，分析得出GATA基因家族在茶樹不同組織中的表達特異性較強，這與桑樹［24］、高粱［26］等研究結果相同。

此外，在不同的逆境脅迫條件下，茶樹GATA基因家族成員表達量基本呈下調趨勢，其中經ABA處理3 h后的CsGATA1表達量下降的最多，接近下降了3 374倍，說明茶樹GATA基因家族成員對逆境響應敏感，這與王娟等得出的結論［3］相同。此外，茶樹GATA基因家族成員在應對不同脅迫時，基因表達量上調、下調程度皆有不同，說明茶樹GATA基因家族在進化過程中功能產生了分化，不同基因對不同逆境脅迫響應程度有所不同［27］。茶樹等植物在生長發育過程中難免會遇到多種生物和非生物脅迫，造成產量、質量下降等不良影響產生經濟損失，因此研究茶樹逆境脅迫響應機制對提升茶樹等植物抗逆性具有重大意義。

3.2 結論

本研究擴充了GATA基因家族信息，可為后續研究茶樹GATA基因家族成員的生物學功能提供參考。通過實時熒光定量PCR分析，發現CsGATA是調控茶樹生長發育與逆境脅迫響應的重要基因，茶樹GATA基因家族成員基因的表達對茶樹的抗逆境脅迫及生長發育過程起著重要的作用。

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收稿日期：2023-06-13

基金項目：安溪茶葉重大科技創新專項（編號：AX2021001）；福建張天福茶葉發展基金會科技創新基金（編號：FJZTF01）。

作者簡介：青亞林（1999—），女，四川南充人，從事茶樹栽培育種研究。E-mail：1635272062@qq.com。

通信作者：葉乃興，碩士，教授，從事茶樹栽培育種與品質化學研究。E-mail：ynxtea@126.com。