百香果CBF基因家族鑒定與表達分析

梁宇堯 鐘昌樺 潘若云 任銳 方庭

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.007

摘要：百香果（Passiflora edulis Sims）原產熱帶地區，對低溫十分敏感。CBF（C-repeat binding factor）基因家族是AP2轉錄因子家族的一類成員，在植物應對低溫、干旱和鹽等非生物脅迫中發揮重要作用。對百香果CBF基因家族進行鑒定和分析，并探究其在低溫脅迫下的表達模式，可為進一步研究百香果CBF基因功能提供重要的參考信息。采用生物信息學方法鑒定百香果CBF基因家族成員，并對家族成員的序列組分、理化性質、系統進化關系、染色體定位、基因結構、保守基序、啟動子順式作用元件和轉錄因子結合位點等進行分析，通過qRT-PCR方法分析其在低溫脅迫下的表達模式。結果顯示，百香果基因組中共有5個CBF基因家族成員，其中3個分布在1號染色體上，2個分布在7號染色體上，被預測定位到細胞核、質膜和過氧化物酶體中；含有1～2個外顯子，11～12個motif；系統進化顯示5個百香果CBF基因、10個水稻CBF基因及6個擬南芥CBF基因共分成了2大亞組：亞組Ⅰ中包括擬南芥的全部6個CBF基因、百香果的全部5個CBF基因和水稻的4個CBF基因，水稻剩下的6個CBF基因分到了亞組Ⅱ中；啟動子區域含有25種順式作用元件，以光響應、激素與逆境脅迫響應元件為主；共有20個轉錄因子結合位點；3個百香果CBF基因在低溫脅迫下表達量極顯著上升，推測上述基因參與了百香果低溫脅迫響應。

關鍵詞：百香果；CBF基因；低溫脅迫；表達分析

中圖分類號：S667.901? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0055-07

收稿日期：2023-07-22

基金項目：福建省自然科學基金（編號：2021J05022）；福建省種業創新與產業化工程項目（編號：zycxny2021010）；福建省高原學科建設經費（編號：102/71201801101）。

作者簡介：梁宇堯（1998—），男，山西陽泉人，碩士研究生，從事果樹遺傳育種方面的研究。E-mail：670915524@qq.com。

通信作者：方? 庭，博士，副教授，從事果樹遺傳育種方面的研究。E-mail：fangting@fafu.edu.cn。

低溫脅迫是植物生長發育階段面臨的一種主要的非生物脅迫，可能會導致植物發育不良，甚至死亡。部分轉錄因子會響應低溫脅迫，提高植物的低溫的耐受性，例如AP2/ERF、NAC、MYB、WRKY、BHLH和bZIP等［1］。CBF（C-repeatbinding factor）是一種對植物抵御低溫十分重要的轉錄因子，屬于 AP2/ERF （Apetala2/Ethylene responsive factor）轉錄因子家族中的 DREB 亞家族［2］。CBF 轉錄因子除了具有1個高度保守的 AP2/ERF 結構域外，還有2個保守的特征基序（PKK/RPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR）［3］。CBF參與多種逆境響應和植株發育等過程，目前低溫信號途徑研究比較清楚的是ICE1（inducer of CBF exoresion 1）-CBF （C-repeatCRT-binding factors-COR cold responsive）信號途徑［4-6］。CBF能夠識別冷響應COR基因啟動子區CRT/DRE元件，在植物對低溫的調控中起重要作用［7-9］。在擬南芥中一共發現了6個CBF基因，分別是AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3、AtCBF4、AtDDF1和AtDDF2，其中AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3為低溫脅迫響應因子［10］，AtCBF4、AtDDF1和AtDDF2與干旱和鹽響應有關［11-12］，這6個CBF基因在擬南芥的逆境脅迫中都發揮出了重大的作用。目前有多個物種的CBF基因家族成員得到鑒定，例如甘藍型油菜［6］、水稻［13］、石榴［14］、胡楊［15］和煙草［16］等。

百香果 （Passiflora edulis Sims）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）的藤本植物，因其含有多種水果的風味而得名百香果。百香果原產熱帶地區，目前在我國廣西、福建、廣東、海南、云南、貴州和臺灣等地廣泛種植。百香果當年種植當年掛果，具有“短、平、快”的特點，是福建省重點發展的特色水果，也被稱為“脫貧果”“致富果”，為精準扶貧和鄉村振興起到一定推動作用［17］。百香果屬于亞熱帶植物，容易受到低溫脅迫，導致產量低、質量差等問題。CBF基因在植物低溫脅迫響應中發揮重要作用，但其在百香果的研究中尚未被報道。本研究主要開展百香果CBF基因家族成員的鑒定及其在低溫脅迫下的表達分析，為進一步研究該基因家族成員在百香果低溫脅迫響應中的功能提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗時間和地點

本試驗于2023年4月在福建農林大學園藝學院園藝植物遺傳育種實驗室內完成。

1.2? 百香果CBF基因家族成員鑒定

百香果的基因組信息數據下載自中國國家基因庫生命大數據平臺（China National GeneBank DataBase，CNGBdb）［18］。擬南芥CBF蛋白的氨基酸序列下載自擬南芥數據庫TAIR網站（https：//www.arabidopsis.org/ ）。以擬南芥CBF基因蛋白質序列為Query，與百香果的蛋白序列進行BLASTP比對，將得到的結果在NCBI蛋白結構域中驗證，去掉沒有蛋白結構PKKPAGRxKFxETRHP、AP2domain和DSAWR的候選序列，得到最終的5個百香果CBF基因。

使用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）在線分析百香果CBF家族成員的染色體定位結果；利用ProtParam tool在線網站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析百香果CBF蛋白的理化性質；利用BioEdit軟件分析得到百香果CBF基因的序列組分；利用Cello軟件（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）預測百香果CBF蛋白的亞細胞定位；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_ sopma.html）進行百香果CBF蛋白二級結構預測；利用在線網站SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行百香果CBF蛋白三級結構預測。

1.3? 百香果CBF基因家族成員的系統進化樹分析

提取擬南芥、水稻和百香果CBF蛋白序列，放入MEGA 7軟件中使用MUSCLE比對方法進行序列比對，采用Neighbor-Joining（NJ）法構建系統發育樹，Bootstrap method 參數值設為1 000。

1.4? 百香果CBF基因家族成員的基因結構與保守基序分析

使用TBtools軟件分析百香果CBF家族成員的基因結構。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）網站進行百香果CBF蛋白保守基序分析，并將得到的結果在TBtools中進行可視化分析。

1.5? 百香果CBF基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

提取百香果CBF基因起始密碼子前的 2 000 bp 片段作為啟動子序列，上傳至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網站進行啟動子順式作用元件預測，并將得到的結果在TBtools中進行可視化。

1.6? 百香果CBF基因家族成員的轉錄因子結合位點預測

利用PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）在線網站進行轉錄因子結合位點預測，將得到的結果在TBtools中進行可視化。

1.7? 百香果CBF基因在果皮中的表達模式分析

基于本課題組保存的百香果轉錄組數據分析百香果CBF基因家族成員在百香果果皮中的表達模式。

1.8? 百香果低溫處理和實時熒光定量分析

植物材料為臺農百香果幼苗，低溫脅迫處理條件為在4 ℃培養8 h，以28 ℃生長的幼苗為對照，處理與對照均為3株。處理完成后取相同部位的葉片樣品并立即用液氮冷凍，并在-80 ℃保存待進一步分析。RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物RNA提取試劑盒進行；cDNA合成按照北京全式金生物技術有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行。采用實時熒光定量PCR技術檢測各基因的表達量水平，試劑為SYBR Green I Master Mix （Takara），所用儀器為LightCycler 96 Real-Time PCR Systems（Roche），內參基因為Pe60S基因［19］，所用引物序列如表1所示。基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCT方法［20］，并利用SPSS軟件中的Duncans新復極差法對試驗數據進行顯著性分析，柱形圖采用Origin 9.1軟件繪制。

2? 結果與分析

2.1? 百香果CBF基因家族成員的鑒定

由表2可知，從百香果基因組中共鑒定獲得5個CBF家族成員，參考其在染色體上的位置分別命名為PeCBF1～PeCBF5。百香果CBF基因的長度在723～1 186 bp之間，最長的是PeCBF3基因，有 1 186 bp，最短的則是PeCBF1，有723 bp。每個CBF基因的脫氧核苷酸的比例都在50%左右。百香果CBF基因雙鏈分子量在439 455～720 631 u之間。

2.2? 百香果CBF基因家族成員編碼的蛋白質理化性質分析

百香果CBF基因編碼的蛋白質理化性質如表3所示，分析可知5個蛋白的長度在237～245 aa之間，長度接近；分子量在26 003.13～27 499.40 u之間，等電點在4.92～6.46，其中最大的PeCBF2為（6.46），最小的PeCBF1為（4.92），每個PeCBF編碼蛋白的等電點都小于7說明預測都是酸性蛋白。5個PeCBF基因編碼蛋白不穩定系數都大于40，都屬于不穩定蛋白。親水性在-0.860～-0.478之間，都小于0，預測都為親水性蛋白。PeCBF1、PeCBF3和PeCBF5基因亞細胞定位預測在細胞核中，PeCBF2在細胞核或者質膜上有定位信號，PeCBF4在過氧化物酶體中有定位信號。

2.3? 百香果CBF基因家族成員的基因結構分析

百香果CBF基因結構如圖1所示。PeCBF1、PeCBF4和PeCBF5基因均只含有1個外顯子結構，PeCBF2和PeCBF3均有1段內含子片段，全部5個PeCBF基因均沒有UTR片段。

2.4? 百香果CBF基因家族成員的染色體定位

百香果CBF基因染色體定位如圖2所示，5個PeCBF基因在染色體上呈現不均勻分布，定位在2條染色體上，其中PeCBF1、PeCBF2和PeCBF3定位在1號染色體上，PeCBF4和PeCBF5定位在7號染色體上，PeCBF1和PeCBF2串聯排布在1號染色體上，其余的染色體都沒有CBF基因的分布。

2.5? 百香果CBF基因家族成員編碼的蛋白質的保守基序分析

為進一步了解百香果保守基序（motif）情況將百香果基因組放入MEME在線分析軟件分析，百香果CBF基因的蛋白基序（motif）分析如圖3所示，在5個PeCBF基因中分析預測出了19個保守motif。其中PeCBF4含有12個保守motif，其他的4個PeCBF基因中均含有11個保守motif，整體相差不大。motif1、motif2、motif3、motif4、motif5和motif6在每個PeCBF基因中都存在，說明這些保守基序是高度保守的。motif7分布在PeCBF1、PeCBF4和PeCBF5中，motif8分布在PeCBF2和PeCBF4中，motif9和motif17分布在PeCBF2和PeCBF5中，motif10和motif18分布在PeCBF1和PeCBF4中，motif11和motif14分布在PeCBF3和PeCBF5中，motif12分布在PeCBF1和PeCBF2中，motif13分布在PeCBF3和PeCBF4中，motif15分布在PeCBF1和PeCBF3中，motif16分布在PeCBF2和PeCBF3中，motif19只分布在PeCBF4中。

2.6? 百香果CBF基因家族成員的系統進化樹分析

通過對5個百香果CBF基因、10個水稻CBF基因和6個擬南芥CBF基因進行進化序列比對，構建NJ進化樹（圖4）。21個CBF蛋白被分為2個亞組，與前人研究結果一致。亞組Ⅰ中包含有15個成員（百香果的和擬南芥的全部11個成員和水稻的4個成員），亞組Ⅱ中的包含有6個成員，均來自水稻的CBF家族。

2.7? 百香果CBF基因二、三級蛋白結構預測

百香果CBF基因二級蛋白結構預測如表4所示，其中5個PeCBF基因編碼蛋白中無規則卷曲占比最大，為57.50%～61.63%，占比超過50%，其次是α螺旋占比為23.85%～30.42%，延伸鏈占比為9.58%～12.55%，占比最小的是β折疊，僅為2.07%～2.95%，不到3%。

百香果CBF基因三級蛋白結構預測如圖5所示，整體結構與二級結構預測的結果相差不大，各蛋白間還是有明顯差異。

2.8? 百香果CBF基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

啟動子結構影響著基因的表達水平，通過PlantCARE網站分析啟動子順式作用元件，百香果CBF基因啟動子順式作用元件如圖6所示。PeCBF1最少，含有22個順式作用元件，PeCBF3最多，含有52個順式作用元件，PeCBF2含有50個順式作用元件，PeCBF4和PeCBF5均含有32個順式作用元件，主要有脫落酸、光響應、水楊酸、茉莉酸甲酯響應性、厭氧誘導、赤霉素、晝夜調節、防御應急、低溫響應、生長素和MYB結合過程中參與干旱誘導的位點等順式作用元件。

PeCBF1中有8種順式作用元件，大部分是脫落酸和光響應的順式作用元件，還有1個低溫響應元件。PeCBF2中有11種順式作用元件， 其中最多的是脫落酸和光響應順式作用元件，還有一些水楊酸和生長素元件，有5個茉莉酸甲酯響應性、3個玉米醇溶酶蛋白代謝調節和1個防御和應急響應元件。

PeCBF3中有10種順式作用元件，茉莉酸甲酯響應性元件占大多數，說明PeCBF3對茉莉酸甲酯有著高度的響應，還有2個MYB結合過程中參與干旱誘導的位點和2個MYBHv1結合位點。PeCBF4種有7種順式作用元件，光響應順式作用元件占大多數，有1個低溫響應元件，還有1個晝夜節律控制元件。PeCBF5種有7種順式作用元件，其中脫落酸順式作用元件占多數。

2.9? 轉錄因子結合位點預測

為進一步了解百香果CBF基因的轉錄因子結合位點情況，將百香果基因組在plantTFDB中進行轉錄因子結合位點預測，百香果CBF基因轉錄因子結合位點預測結果如圖7所示，共預測出了20個結合位點。PeCBF1中有11種結合位點，以ERF為主。PeCBF2中有9種結合位點，以BBR-BPC和AP2為主。PeCBF3種有8種結合位點，以BBR-BPC為主，還有3個特有的E2F/DP、NAC和LBD結合位點。PeCBF4有5種結合位點，而且結合位點的數量最少，有1個ERF結合位點和1個特有的B3結合位點。PeCBF5中有3種結合位點，以TCP為主，還有1個特有的CAMTA結合位點。只有PeCBF5沒有ERF結合位點，其余的PeCBF基因均有ERF結合位點，AP2結合位點在PeCBF1、PeCBF2和PeCBF3中都有體現。

2.10? 百香果CBF基因家族成員的表達模式分析

百香果CBF基因分別在紫果轉色前（PS1）、紫果成熟（PS2）、黃果轉色前（YS1）和黃果成熟（YS2）4個階段的表達情況如圖8所示，在PS1階段表達水平較高的有PeCBF2、PeCBF3和PeCBF5，在PS2階段高度表達的僅有PeCBF3，在YS1和YS2階段表達水平較高的有PeCBF2和PeCBF3。

2.11? 百香果CBF基因在低溫脅迫下的表達分析

PeCBF基因在低溫脅迫條件下的表達分析結果如圖9所示， PeCBF1、 PeCBF2和PeCBF3在低

溫條件下的表達量均極顯著上升，而PeCBF4和PeCBF5與對照相比表達量只有微量的增加。

3? 討論

CBF基因對植物的低溫脅迫發揮著重大作用，在植物中已經鑒定出了許多CBF基因，如擬南芥中有6個CBF基因［10-12，21］，石榴中有7個CBF基因［14］，胡楊中有8個CBF基因［15］，煙草中有19個CBF基因［16］等，百香果中一共篩選出5個CBF基因，這可能是物種間基因組大小差異和CBF基因擴增程度不同所導致［22］。相同進化分支上的PeCBF基因的特有保守基序也是類似的，PeCBF1和PeCBF4均有motif10和motif18；PeCBF2和PeCBF5均有motif9和motif17，但是相同進化分支的PeCBF基因也有些motif丟失，可能是串聯重復過程中造成

的堿基丟失。不同的PeCBF基因的motif差異可能反映了其中功能的差異。

通過對不同PeCBF的順式作用元件分析可得出它們均含有脫落酸、赤霉素、光響應等多個順式作用元件，說明PeCBF在光誘導和脫落酸激素中起到作用。而光敏色素互作因子（PIFs）在調控植物發育中起著關鍵作用［23-25］，部分（PIFs）可以綁定到 G-box 和AtCBF啟動子中的E-box順式元件調控其轉錄［26］。不同的PeCBF還含有獨特的順式作用元件，其中包含了厭氧誘導、干旱、生長素、低溫脅迫、防御應激和MBY結合位點等，這些也反映了不同的PeCBF基因在發揮著不同的作用。

百香果對低溫較為敏感［27］，CBF基因家族在抗凍性中具有重要作用，如在擬南芥中過表達龍眼CBF家族基因DlCBF1、DlCBF2和 DlCBF3可提高其抗寒能力［28］。PeCBFs基因啟動子中含有多個與低溫脅迫響應有關的順式作用元件，基因表達分析也發現PeCBF1、PeCBF2和PeCBF3基因在低溫脅迫下表達量極顯著上升，暗示這3個基因可能參與了百香果低溫脅迫響應。

綜上所述，本研究從百香果基因組中鑒定出5個CBF基因，并對其進行了一系列的生物信息學分析。低溫脅迫下的表達分析表明，PeCBF1、PeCBF2和PeCBF3基因在低溫脅迫下表達量極顯著上升。本研究結果為后續研究CBF基因在百香果抗寒中的功能奠定了一定的理論基礎。

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