SmZIP11 基因過表達增強楊樹對重金屬的吸收和轉運

摘要： 【目的】利用木本植物修復重金屬污染土壤是經濟、安全、有效的方法。研究鋅鐵轉運蛋白家族中SmZIP11 基因表達對吸收和轉運重金屬的影響，為重金屬污染土壤植物修復提供重要的基因資源?！痉椒ā坎捎灭z頭柳（Salix matsudana var. matsudana f. umbraculifera Rehd.） 無性系一年生幼苗進行水培試驗。幼苗在正常營養液中生長60 天后進行重金屬脅迫處理，重金屬處理包括：200 μmol/L ZnSO4、100 μmol/L CuSO4 和100 μmol/L CdSO4。在重金屬處理0、1、4、7、14 和21 天時，取根、莖和葉組織樣品提取RNA，利用實時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR， qRT-PCR） 測定SmZIP11 的表達水平。利用葉盤法將提取的SmZIP11 基因轉入銀灰楊（Populus × canescens） 中，經卡那霉素抗性篩選共得到8 個過表達SmZIP11 基因的轉化楊樹株系（OEs）。選擇SmZIP11 基因表達水平較高的3 個轉基因株系和野生型株系（WT） 于重金屬脅迫營養液中培養14 天后，測定根、莖、葉生物量和重金屬含量，計算耐受性指數和轉移系數?！窘Y果】SmZIP11 基因編碼區序列長度為1053 bp，編碼351 個氨基酸，分子量為37.71 kDa，含有9 個保守的跨膜結構域，該基因編碼的蛋白定位于細胞膜。系統進化樹分析結果顯示，饅頭柳SmZIP11 與楊柳科的親緣關系最近，與大戟科、錦葵科、傘形科植物的ZIP11 親緣關系相對較遠。qRT-PCR 結果表明，在Zn、Cu 和Cd 脅迫下，饅頭柳莖和葉片中的SmZIP11 比對照顯著上調；在Cd 和Zn 脅迫下，根、莖和葉片中該基因的表達量都顯著提高。在轉基因楊樹中，SmZIP11 基因顯著增強了植株對Zn 和Cu 的耐受性，促進了Cd 從根系向莖中轉移，以及Zn 向葉片中轉移，同時將Cu 富集在根部。與WT 相比，OE7 株系對Zn 的耐受指數和地上部Zn 的含量及轉移系數都顯著提高?！窘Y論】饅頭柳SmZIP11 基因增強了轉基因楊樹對Cu 和Zn 的耐受性，并提高了從根系向地上部轉移Cd 和Zn 的能力，為植物修復土壤重金屬污染提供了基因資源和理論指導。

關鍵詞： 饅頭柳； SmZIP11 基因； 重金屬脅迫； 功能分析

據《全國土壤污染狀況調查公報》[1]和《2020 年全國生態環境質量簡況》[2]，重金屬是目前影響農用地土壤環境質量的重要污染物，污染面廣且擴展迅速，是優先監測和控制的土壤污染物。一般來說，密度大于4.5 g/cm3 的金屬元素稱為重金屬，大部分重金屬不易被分解，具有一定的累積效應[3]。土壤中的重金屬來源途徑多樣，如大氣沉降、養殖廢水灌溉[4]、污泥再次利用、有機肥和化肥的施用等[5]。目前，國家已把修復重金屬污染列入“十四五”全國農業農村科技發展規劃（農業農村部，農科教發〔2021〕13 號），并成為我國“十四五”期間的重要工作之一。

木本植物具有龐大的樹冠和發達的根系，能有效地吸收土壤中的重金屬，在重金屬污染修復中具有較大潛力[6]。例如，美洲黑楊（Populus deltoids） 和蒿柳（Salix viminalis） 已被用于治理土壤鎘污染[7?8]。近年來，450 種灌木柳中已有10 種被試用于土壤重金屬污染植物修復中[9]，以灌木柳為主。

土壤中的重金屬被植物根吸收，部分儲存在根系，部分轉運到木質部導管中，在細胞壁和液泡中被隔離和解毒。因此，重金屬的吸收、轉運、區隔化和解毒是木本植物修復土壤重金屬污染的關鍵過程。重金屬離子的吸收和在細胞內的平衡由植物體內的轉運蛋白調控，運轉蛋白都是典型的膜蛋白，屬于不同的植物金屬轉運蛋白家族，可以在組織水平或器官水平起作用[ 1 0 ]。鋅鐵轉運蛋白（zincregulatedtransporter and iron-regulated transporter-likeprotein， ZIP） 是一類金屬轉運體，幾乎所有的ZIP 蛋白都含有8 個以上的跨膜結構域和類似的膜拓撲結構，其中的氨基和羧基末端均位于質膜外表面[11]。絕大多數的ZIP 蛋白長度為309～476 個氨基酸，第III 和IV 跨膜結構域之間的“可變區”的長度不同造成了氨基酸數目的不同，也決定了其對金屬離子的專一性。ZIPs 可變區的金屬結合結構域富含組氨酸（His），它可以作為重金屬的結合位點[12]。在水稻中，OsZIP1 參與土壤中Zn 的吸收，OsZIP4、OsZIP5、OsZIP7 和OsZIP8 則參與了鋅在地上部的轉運或分配[13?15]。OsZIP9 蛋白定位于水稻根外皮和內皮，是水稻中鋅的重要轉運蛋白，在缺鋅條件下，OsZIP9蛋白有助于水稻對鋅的吸收[16]。雖然已有大量有關ZIP 家族蛋白參與Zn、Fe 和Cd 等元素的吸收、轉運和分配的研究，但主要集中在擬南芥和水稻等草本植物中，較少針對用于土壤重金屬污染修復的木本植物。

灌木柳是重金屬高效吸收和高積累的木本植物。例如，杞柳（S. integra） 對鉛脅迫有很強的耐受性，被認為是尾礦鉛鋅固定植物的潛在候選物種[17]。蒿柳（S. viminalis） 和黃花柳（S. caprea） 可以降低土壤中Cd、Zn 和Cu 的濃度[18]。柳樹（Salix spp.） 生長速度快、適應性強、無性繁殖容易、生物量大，具有很高的重金屬吸收能力[19]。本實驗室前期研究發現，饅頭柳（S. matsudana var. matsudana f. umbraculiferaRehd.） 是一種高鎘積累和耐鎘的喬木[20?21]。在鎘脅迫的旱柳和饅頭柳的根系中，有8 個ATP 結合盒轉運蛋白（ABC 轉運蛋白）、3 個黃色條紋蛋白（YSLs）、4 個ZIPs 和1 個天然抗性相關巨噬蛋白（NRAMP） 基因，僅在Cd 脅迫處理下的饅頭柳根系中上調表達，可能參與了饅頭柳根系對Cd 吸收、向地上部的轉運和積累[20]，這些轉運蛋白的功能需要進一步研究。本研究對ZIPs 家族成員中SmZIP11 的基因長度、蛋白結構、表達部位、轉運功能等進行了預測與分析，為利用生物技術培育高抗和高積累的木本植物，修復土壤重金屬污染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為饅頭柳無性系，保存于中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所苗圃。取饅頭柳一年生枝條（約15 cm），在12 L 的塑料盆中進行水培培養[22]。塑料盆中加入1/2 霍格蘭營養液[23]，pH 值控制在6.0 左右，持續充氣，營養液每3 天更換1 次。光周期16 h/8 h，室溫23℃～25℃，空氣濕度為50%～60%[21]。預培養60 天后選取生長一致的60 株無性系扦插苗，分為4 組，15 株為1 組，每3 株移栽于2 L 的黑色塑料桶中，作為1 個處理時間點的3 個生物學重復，共20 盆。其中3 組分別進行以下3 種重金屬處理：200 μmol/L ZnSO4、100 μmol/LCuSO4 和100 μmol/L CdSO4；另外1 組繼續用1/2 霍格蘭營養液培養作為對照。在培養1、4、7、14 天和21 天時分別取樣，采集根、莖和葉的樣品迅速用液氮速凍，保存于?80℃ 超低溫冰箱備用。

1.2 RNA 的提取

使用RNA prep Pure Plant Plus 試劑盒（DP441，天根生物科技有限公司，北京，中國） 提取饅頭柳的根、莖、葉的RNA。評估RNA 的完整性：1.0% （W/V）瓊脂糖凝膠電泳，并使用N a n o D r o p 2 0 0 0 分光光度計測定濃度。

1.3 SmZIP11 基因克隆

利用轉錄組數據獲取SmZIP11 基因序列，運用Primer3 Input （http：//frodo.wi.mit.edu） 在線軟件，設計引物（表1），由浙江尚亞生物技術有限公司合成。利用PrimeScript? III 1st Strand cDNA SynthesisKit 反轉錄試劑盒（寶日醫生物技術有限公司，北京，中國） 合成cDNA 第一鏈。以饅頭柳根系、莖和葉片混合cDNA 為模板，通過PCR 進行擴增。PCR反應體系為25 μL：2×Phanta Max Master Mix （DyePlus） 高保真DNA 聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL （10 μmol/L），cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。取10 μLPCR 產物利用質量分數為1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測其長度。將基因長度正確的DNA 凝膠片段利用DNA 凝膠回收試劑盒（杭州Axygen，中國） 進行回收。連接T 載體，轉化TOP10 大腸桿菌感受態細胞，送至浙江尚亞生物技術有限公司進行測序。

1.4 SmZIP11 基因生物信息學分析

本研究通過TMHMM 軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM） 分析SmZIP11 蛋白質的跨膜區域；用SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/） 預測SmZIP11 蛋白質結構；利用DNAMAN 軟件計算SmZIP11 的分子量；從網站NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 和擬南芥基因組數據庫（https：//www.arabidopsis.org/） 檢索并下載與SmZIP11 相似度較高的17 個物種氨基酸序列；利用DNAMAN 軟件比對相似序列，確定ZIP11 相對保守區域；通過MEGA X 中Neighbor-joining （NJ）phylogenetic tree 構建系統進化樹，其中bootstrap測試重復1000 次；利用在線軟件Wo LF PSORTⅡ（https：//wolfpsort.hgc.jp/） 預測SmZIP11 蛋白亞細胞定位。

1.5 SmZIP11 基因實時熒光定量PCR （qRT-PCR）

為了探索SmZIP11 在不同組織中的表達水平，使用qRT-PCR 技術進行檢測。利用Prime Script TMRT Master Mix （RR036，寶生物，大連，中國） 合成cDNA 第一鏈，分別利用去離子水5 倍稀釋根、莖、葉cDNA。根據獲得的SmZIP11 基因cDNA 序列，采用在線軟件Primer3.0 （http：//frodo.wi.mit.edu） 設計qRT-PCR 引物 （表1）。qRT-PCR 反應體系（RR420，寶生物，大連，中國） 為20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。其擴增條件為預變性95℃，30 s；變性95℃，5 s；退火60℃，30 s；40 個循環。Ct 值使用7300 Real TimePCR 系統（Applied Biosystems，CA，USA） 測定。為了使表達水平正?；?，將內源基因DnaJ 作為內參基因[24]。每個樣品進行4 次技術重復。

1.6 亞細胞定位載體構建

根據SmZIP11 序列設計含有酶切位點引物（表1）。通過同源重組的方法構建亞細胞定位重組載體，用Xba I 和Kpn I 對植物表達載體PBI121-GFP 的質粒進行雙酶切，酶切體系為50 μL：10×QuickCut GreenBuffer 10 μL，Xba I 和Kpn I 各1 μL，質粒5 μL，ddH2O 33 μL，設置酶切溫度為37℃，在恒溫水浴鍋中酶切2～3 h，凝膠電泳檢測其是否酶切完全，進行切膠回收。

利用同源重組酶將目的基因擴增片段純化產物與酶切后的載體連接。10 μL 體系：回收DNA 片段2 μL、雙酶切后的pBI121-GFP 載體3 μL、2 ×Ezmax? Universal CloneMix 5 μL。在37℃ 下溫育15 min 后，將連接產物轉入TOP10 大腸桿菌感受態細胞，均勻的涂布于50 μg/mL 卡那霉素的LB 固體培養基進行篩選。挑取單克隆菌落，液體培養并使用含有酶切位點引物（ S m Z I P 1 1 - p B I 1 2 1 - F 和SmZIP11-pBI121-R）（表1） 進行PCR 檢測，選擇條帶大小正確的菌液送至浙江尚亞生物技術有限公司進行測序。提取測序結果正確的陽性菌擴大培養，提取質粒轉入農桿菌GV3101 感受態細胞。挑取農桿菌單克隆在180 r/min 28℃ 搖床振蕩培養至OD6000.6～0.8。

選擇生長狀態良好、健壯的3～4 周齡本氏煙草幼苗（由林木遺傳育種國家重點實驗室提供），轉化前澆透水并置于光照下培養使氣孔充分張開。挑選平整的葉片，避開葉脈注射。使用核marker （p2300-35S-H2B-mCherry） 和膜marker（pm-rb CD3-1008） 作為對照。注射完的煙草做好相應的標記后暗培養12 h，隨后培養室光照培養2 天[25]。使用激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM900，德國） 觀察熒光蛋白定位情況。

1.7 植物表達載體構建

植物表達載體構建采用Gateway 技術。設計引物SmZIP11-pDONR222-F、SmZIP11-pDONR222-R （表1） 進行目的基因PCR 擴增。入門質粒的構建：純化的PCR 產物首先連接到pDONR222 載體（Invitrogen，Carlsbad，USA），進行Gateway?BPClonase 反應。反應體系為3 μL：PCR 回收產物2 μL，pDONR222 0.4 μL，BP ClonaseTMⅡEnzymeMix 0.6 μL。連接后對入門質粒進行測序。

植物表達載體為p K 2 G W 7 . 0。LR 反應：將pDONR222-SmZIP11（BP 質粒） 與植物表達載體pK2GW7.0 進行LR 反應。反應體系為5 μL：BP 質粒1 μL，表達載體pK2GW7.0 1 μL，TE buffer 1 μL，LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix 1 μL，LR reaction buffer1 μL。測序正確，得到植物表達載體pK2GW7.0-SmZIP11。

1.8 楊樹遺傳轉化

將構建好的pK2GW7.0-SmZIP11 植物表達載體按照葉盤法[26]轉化銀灰楊（Populus × canescens）。轉化苗長至3 cm 左右時，取0.1 g 左右的葉片，用CTAB法提取再生植株葉片中基因組DNA，并作為模板進行兩次PCR 擴增，以提高PCR 檢測的準確性，第一次PCR 擴增所用引物為根據SmZIP11 的克隆基因序列所設計的引物SmZIP11-F 和SmZIP11-R；第二次PCR 擴增所用引物為NPTII 基因的特異引物NPTIIF和NPTII-R （表1）。PCR 擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測其片段大小。用PCR 鑒定的陽性植株進一步通過qRT-PCR 鑒定SmZIP11 的表達量。選取3 個表達水平較高的轉基因株系進行后續試驗。

將生根后的WT 和轉基因株系移栽到通氣的1/2 霍格蘭營養液中[27]，每3 天更換1 次。培養60 天后，在1/2 霍格蘭營養液中用200 μmol/L ZnSO4、100 μmol/L CuSO4 和100 μmol/L CdSO4 分別處理14 天，4 次生物學重復，取根、莖和葉稱重。進一步測定轉基因楊樹中的重金屬含量。將根浸泡在20 mmol/L EDTA 中30 min，用去離子水徹底清洗。所有樣品在65℃ 下干燥，直到恒重。干燥的樣品在研磨機（Tissuelyser-48，JINGXIN，上海，中國） 中研磨成細粉，稱取研磨樣品至少0.2 g 在微波加速反應系統（CEM，Matthews，NC，美國） 中在120℃～190℃ 下用65% HNO3 和30% H2O2 的混合物（比例為6：1 v/v） 消解。隨后，將樣品轉移至容量瓶，定容至25 mL，過濾。重金屬含量采用電感耦合等離子體光學發射光譜（ICP-OES，icap-7400，ThermoFisher，美國） 測定[20]，方法參考GB5009.268—2016。

1.9 數據統計分析

1.9.1 qRT-PCR 數據分析

計算SmZIP11 基因的相對表達水平，對于分析SmZIP11 基因在不同重金屬脅迫下不同組織中的表達量，將對照組的相對表達量（y 軸“relative expression”） 設定為1。用2?ΔΔCt 法計算相對表達水平[28]。

1.9.2 耐受性指數

計算植物耐受性指數，判斷植物受重金屬脅迫程度。耐受性指數=（脅迫處理器官干重）/（對照器官干重）[29]。

1.9.3 轉移系數

轉移系數代表根部向地上部轉運的能力。植物體內Zn、Cd、Cu 從根向葉或莖的轉移系數（TF） 表達式為：TF=地上部Zn、Cd、Cu 濃度/根系中Zn、Cd、Cu 濃度[20]。

以上數據采用SAS 統計軟件包（version 9.3，SAS Institute，Cary，NC） 進行單因素方差分析。結果以平均數±標準差表示。處理間差異采用最小顯著性差異（LSD） 檢驗，概率水平為0.05[20]。

2 結果與分析

2.1 SmZIP11 基因克隆及生物信息學分析

以饅頭柳根、莖和葉混合cDNA 為模板，通過PCR 擴增出與預期大小一致的條帶（約1050 bp）（圖1A），經測序后確認饅頭柳SmZIP11 基因，包含1053 bp 完整的開放閱讀框，編碼351 個氨基酸，等電點為5.441，分子量為37.71 kDa。TMHMM 軟件分析表明SmZIP11 蛋白含有9 個保守的跨膜結構域（圖1B）。SWISS-MODEL 預測的SmZIP11 蛋白質結構含有9 個螺旋（圖1C）。此外，與其他5 個物種的ZIP11 蛋白氨基酸序列比對結果顯示，都含有9個保守的跨膜結構域（圖1D）。由此可見，SmZIP11蛋白含有ZIP 的保守結構域，屬于ZIP 家族成員。

2.2 同源性分析

將饅頭柳、紫紅柳、擬南芥、胡楊、毛果楊等17個物種的ZIP 基因氨基酸序列進行比對（圖2）。利用NCBI 數據庫獲得其他相似性高的物種的氨基酸序列，通過MEGA X 中Neighbor-joining （NJ）phylogenetic tree 構建饅頭柳與其它物種ZIP11 蛋白的系統進化樹，顯示同一科的植物物種聚在一起。SmZIP11 蛋白首先與紫紅柳聚在一類，親緣關系最近，再與楊柳科的其他3 種楊樹聚在一個小分支上。與大戟科、錦葵科、傘形科植物的ZIP11 親緣關系相對較遠。此外，與AtZIP11 氨基酸序列相似性為7 9 . 1 %，與S p Z I P 1 1 氨基酸序列相似性為96.59%，屬于ZIP 亞家族。綜合系統發育樹和蛋白結構，結果表明SmZIP11 是ZIP 蛋白家族的成員。

2.3 實時熒光定量分析

對饅頭柳不同組織中SmZIP11 基因進行實時熒光定量分析，結果（圖3） 表明，SmZIP11 基因在饅頭柳根、莖、葉中的表達受Cd、Zn 和Cu 調控。在根系中，Cu 處理后，SmZIP11 表達量有所下降（圖3A）；Cd 處理后SmZIP11 表達呈先上升后下降的趨勢，在第4 天時達到高峰（圖3B）；Zn 處理7 天以內，SmZIP11 的表達水平沒有升高，14 天之后劇烈上升（圖3C）。在莖中，Cu 處理使SmZIP11 表達量緩慢上升，處理2 1 天時達到高峰（圖3 D ）；C d 脅迫時SmZIP11 表達量雖然有所上升，但是只在處理7 天時其表達水平達到對照的2 倍（圖3E）；而Zn 脅迫強烈誘導了該基因的表達，呈現先上升后下降的趨勢，處理4 天時達到高峰，為對照的50 倍（圖3F）。在葉片中，3 種重金屬處理都顯著誘導了SmZIP11的表達，但是趨勢有所不同；Cu 處理1 天就達到了高峰，隨后逐漸下降（圖3G）；Cd 處理下SmZIP11的表達表現出緩慢上升的趨勢，14 天時最高（圖3H）；Zn 處理21 天內，其表達量一直上升（圖3I）。 綜上所述，SmZIP11 響應多種重金屬脅迫，在不同組織中對不同的重金屬響應時間不同。

2.4 亞細胞定位分析

為確定SmZIP11 蛋白的表達位置， 分別將pBI121-GFP 空載體質粒與pBI121-SmZIP11-GFP 重組質粒轉入GV3101 農桿菌中，用不帶針頭的注射器將2 種帶有共轉膜marker 和核marker 侵染菌液從本氏煙草葉片的下表皮緩緩注入，做好標記。空載體用共轉膜marker 和核marker 作為陽性對照，重組質粒用膜marker 作為對照。培養兩天后，使用LSM 900 激光共聚焦顯微鏡觀察并保存試驗結果。結果（圖4） 顯示，對照GFP 蛋白在細胞核和細胞膜中均有分布，而pBI121-SmZIP11-GFP 融合蛋白在細胞膜處有明顯的綠色熒光信號，與膜marker的紅色熒光信號完全重疊，證明SmZIP11 蛋白定位于細胞膜。

2.5 轉基因楊樹鑒定

通過轉化銀灰楊，經卡那霉素抗性篩選到了8株轉化植株。采用SmZIP11 引物PCR 鑒定轉基因植株，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物的大小，擴增出1053 bp 的特異條帶（圖5A）。此外，用NPTII引物擴增出494 bp 的特異條帶（圖5B），片段大小與預期結果相同，說明表達載體已經成功轉化至銀灰楊。實時熒光定量結果顯示，編號OE2、OE7、OE8的3 個轉基因楊樹株系表達量較高（圖5C），將這3 個株系組培苗擴繁，用于后續試驗。

2.6 轉基因楊樹耐性指數測定

為了進一步研究SmZIP11 在轉基因楊樹中吸收和轉運重金屬的生物學功能，將3 個轉基因楊樹株系和WT 以水培的方式用3 種重金屬分別進行脅迫14 天，測定不同組織的生物量（圖6）。Cu 和Cd 脅迫降低了轉基因株系和野生株系的生物量，而Zn 脅迫提高了轉基因株系的生物量。Cu 和Cd 脅迫下3 個轉基因株系根、莖、葉的生物量降幅均小于野生型楊樹株系。在Zn 脅迫下，OE7 植株的根、莖、葉生物量的增幅顯著高于其他株系（圖6A，6B，6C）。Cu 和Zn 脅迫明顯提高了3 個轉基因株系的耐性指數，且Zn 脅迫的提升幅度顯著高于Cu 脅迫。Cd 脅迫顯著降低了3 個轉基因株系葉和莖的耐性指數。OE7 植株根、莖和葉中的Zn 耐受性指數均顯著高于其他2 個株系，其他兩個株系的Zn 耐受性指數在根和莖中與WT 相比也顯著提高，在葉片中差異不顯著。SmZIP11 基因對Cu 和Zn 有一定的耐性作用，提高了轉基因植株對重金屬的耐受性，尤其是對Zn的耐受性更強（圖6D，6E，6F）。

2.7 重金屬轉移系數測定

為了研究SmZIP11 在轉基因楊樹中對不同重金屬的轉運能力，分別對脅迫前后的根、莖和葉組織進行Cd、Cu 和Zn 的含量測定（圖7）。重金屬脅迫下的轉基因株系和WT 株系根、莖、葉中的Cd、Cu 和Zn 含量顯著高于非脅迫處理（圖7A，7C，7E），且轉基因楊樹根、莖和葉中的Cd 含量均顯著高于野生型楊樹（圖7A）；Zn 元素是植物本身必需微量元素，轉基因楊樹Zn 含量只在葉片中比WT 顯著增加，維持根系及莖中Zn 含量穩態（圖7E）；Cu 在根中的含量高于葉片和莖，很少轉移到地上部（圖7C）。轉基因植株中Cd、Cu 和Zn 的濃度普遍升高，表明SmZIP11 基因通過根系促進了轉基因植株對Cd、Cu和Zn 的吸收。通過分析重金屬轉移系數發現，轉基因植株對Cu 向地上部分的轉移能力無顯著提高（圖7D）；OE7 和OE8 兩個植株對Cd 向莖的轉移能力顯著提高（圖7B）；3 個轉基因植株均對Zn 向葉片的轉移能力顯著提高（圖7F）。以上結果表明SmZIP11基因可能提高了轉基因楊樹向地上部運輸Cd 和Zn金屬離子的能力。

綜上所述，SmZIP11 促進了Cu 的吸收并富集在根部，增強了Cd 和Zn 從根系向地上部分的轉運作用，對改善Cd 和Zn 污染地區的生物修復研究具有一定的意義。

3 討論

ZIP 轉運蛋白普遍存在于植物、細菌、真菌和人類中[30]，迄今為止對植物ZIP 家族成員的功能研究集中在ZIP1～ZIP9，對其他成員的研究非常有限。植物ZIP 家族轉運蛋白預計有6～9 個或者更多的跨膜結構域（α-螺旋），其中8 個是最普遍的形式，跨膜結構域IV 中有鋅鐵轉運家族蛋白最保守的部分，C 和N 端位于質膜結構兩側[31]。分子量從33.1 到51.4 kDa不等，具有322 到478 個氨基酸不等，等電點值在5.31～8.92。研究發現，ZIP 轉運蛋白在不同物種間具有很好的保守性和相似的理化性質[ 3 2 ]。在蘋果（Malus domestica） 和玉米（Zea mays） 基因組中分別鑒定出了18 和12 個ZIP 成員，多數含有8 個跨膜結構域[33?34]，比較特殊的是ZmZIP12 最多有13 個TM 結構域，可能與結合的底物運出質膜有關。本研究結果表明饅頭柳中SmZIP11 基因，編碼351 個氨基酸，含有9 個保守的跨膜結構域，該基因編碼的蛋白定位于細胞膜。SmZIP11 的蛋白質結構與已知5 個物種的ZIP 家族其他基因成員相似。總之，SmZIP11 含有ZIP 的保守結構域，屬于典型的ZIP家族成員。

目前研究表明，ZIP 基因家族是一類調節植物離子吸收和轉運的轉運蛋白家族，參與金屬離子轉運的ZIP 家族成員主要有ZNT1、IRT1、ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZIP4、ZIP6 等[ 3 5 ]，具有轉運多種陽離子如Cd2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+和Zn2+等的能力[10]。ZIP11 基因在植物吸收和轉運重金屬中的作用報道較少，目前我們也只獲得了水稻（Oryza sativa） OsZIP11、枳殼（Poncirus trifoliate） PtZIP11 和煙草（Nicotianatabacum） NtZIP11 的一些基本信息[36?39]。本研究分析了Cd、Zn 和Cu 脅迫下的SmZIP11 基因在不同組織中（根、莖、葉） 的表達水平。結果顯示，與對照相比，植株受到重金屬Cd、Cu 和Zn 脅迫時SmZIP11在葉片和莖中顯著上調表達，所有組織中受Cd 和Zn 誘導。這一結果與煙草中NtZIP11 基因表現基本相同，當高鋅脅迫時，煙草葉片中NtZIP11 顯著性上調，但在根的頂端和基部未檢測到；隨著煙草植株年齡的增長，NtZIP11 在根和葉中的表達豐度增加[37]；擬南芥生態型AhZIP6-1 在莖中表達更高，而AhZIP6-2 在根中表達更高[40]。與煙草不同的是，在水稻中，缺Fe 誘導下，根和地上部OsZIP11 表達水平顯著升高，但在缺Zn 和Cu 的情況下則不然。這表明OsZIP11 功能可能與水稻中鐵的獲取或積累有關[38]；同時在擬南芥的AtZIP11 研究中發現，Zn 限制條件下AtZIP11 轉錄水平在地上部中有所增加，其可能在缺鋅狀態下促進了擬南芥對鋅的獲取[41]；另外玉米ZIP 基因家族包含12 個成員，ZmZIP11 在玉米旗葉中表達量較高，可能對轉運鋅有一定的作用[33]。存在以上這些差異可能是由于物種、ZIP 蛋白結構和在各植物中實施的功能不同有關。

我國優質耕地資源短缺，需對重金屬污染土壤進行修復再次利用。土壤重金屬污染嚴重，需通過植物將土壤中的重金屬轉運并存儲到地上部，減少土壤中重金屬含量[42]。試驗中，在Zn、Cu 和Cd 處理下，轉基因楊樹中各離子濃度與對照組相比顯著升高，表明SmZIP11 基因對植物吸收重金屬可能有促進作用。SmZIP11 基因的過表達賦予了植物對重金屬的耐受性，實驗組中根、莖、葉的耐性指數均對Zn 和Cu 有不同程度的升高，尤其對Zn 離子。此外研究表明ZIP 家族基因對Zn、Fe、Cd 等金屬離子具有轉運作用[43]，同樣SmZIP11 基因也具備相類似的功能，轉基因植株將Cu 富集于根部；將Cd 向莖中轉移，Zn 向葉片中轉移。在擬南芥中AtZIP11 是鋅的吸收與轉運蛋白，并且可以與鐵離子結合[44]。相比較而言，ZIP 家族成員對Zn 更加親和，雖然轉運Cd、Cu 等，但是對其不具有專一性[45]。NtZIP11 的主要作用是高鋅濃度時負責煙草葉片細胞對鋅的吸收，并且依賴于NtWAK2 衍生的信號[ 3 6 ? 3 7 ]，但是N t Z I P 1 1 不參與C d 和F e 轉運。在枳殼中，PtZIP11 被認為與Mn 轉運有關，而與Zn 或Fe 轉運無關[39]。OsZIP11 是水稻生長發育過程中鐵獲取所必需的[38]。在本研究中，SmZIP11 不僅受Zn 脅迫誘導，還提高了對Zn 的耐性，促進了向葉片的轉移。因此對ZIP 基因作物進行基因改造有助于Zn 等重金屬污染地區植物修復。本研究結果對SmZIP11 轉運蛋白基因的鑒定以及功能進行了驗證，利用這些信息，通過轉基因或標記輔助選擇來設計高生物量超積累型作物，為植物修復品種篩選提供了新思路，對調控饅頭柳對重金屬的耐受性具有重要意義。

4 結論

鐵鋅運轉蛋白ZIPs 家族成員中的SmZIP11 基因定位于細胞膜，當植株受到重金屬脅迫時，SmZIP11基因在植物體內表達上調，尤其在根、莖和葉片中受Cd 和Zn 脅迫顯著上調。轉SmZIP11 基因楊樹較野生型顯示了更高的吸收和運轉Zn 和Cd 的能力，并提高了對Cd、Zn、Cu 脅迫的耐受能力。因此，SmZIP11 基因是提高楊樹重金屬修復能力的基因。

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基金項目：國家重點研發計劃項目（2021YFD2200201）；國家自然科學基金項目（31872168）。