水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4的兩種檢測(cè)方法比較

摘要：針對(duì)水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4，利用PARMS試劑盒及基于PCR引物3'末端核苷酸雙脫氧修飾兩種檢測(cè)方法，對(duì)236份水稻材料進(jìn)行基因型檢測(cè)，兩種檢測(cè)方法結(jié)果符合率為93.18%，均可以通過(guò)SNP分型對(duì)水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4進(jìn)行基因型鑒定。對(duì)兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)具體說(shuō)明，并且提供這兩種方法的選擇或使用條件，可以為SNP檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步研究及兩種方法在水稻其他基因SNP分型中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：水稻；赤霉素；PARMS；核苷酸雙脫氧修飾；單核苷酸多態(tài)性

Comparison of Two Detection Methods for the Gibberellin

Metabolic Gene OsGA2ox4 in Rice

GU Qiaomei，ZHENG Guoli，WANG Pan

（Shanghai ZKW Molecular Breeding Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200233）

水稻是我國(guó)的主要糧食作物，提高水稻產(chǎn)量是保障我國(guó)糧食安全的重要途徑[1]。株高是水稻重要的農(nóng)藝性狀，適當(dāng)增加株高能夠提高葉片對(duì)光的吸收效率，有利于干物質(zhì)積累，提高水稻產(chǎn)量。赤霉素作為一種植物激素，可多方向調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)，通過(guò)影響細(xì)胞分裂及伸長(zhǎng)，成為影響水稻株高的關(guān)鍵因素[2-4]。

赤霉素合成及代謝途徑涉及多種重要基因的參與及調(diào)控[5]。赤霉素的合成代謝途徑發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致赤霉素含量發(fā)生變化，進(jìn)而影響水稻株高。赤霉素代謝途徑需要許多氧化酶的催化，其中GA2ox能通過(guò)β-羥基化作用將活性GA1和GA4催化為無(wú)生理活性的GA8和GA34。當(dāng)GA2ox突變后，赤霉素的代謝途徑受到阻礙，赤霉素在植物體內(nèi)大量積累，促使植物體株高增加[6]。目前在水稻中，共鑒定出10個(gè)OsGA2ox基因，已有3個(gè)基因被克隆，分別是OsGA2ox3、OsGA2ox5與OsGA2ox6。OsGA2ox3基因作為赤霉素滅活基因發(fā)揮作用[7]，過(guò)表達(dá)的OsGA2ox5基因造成水稻極端矮小且生育期延遲[8]，OsGA2ox6突變體表現(xiàn)顯著矮化和典型赤霉素缺乏表型[9]。由此可知，OsGA2ox家族對(duì)水稻的株高起到了重要的調(diào)控作用。目前對(duì)于GA2ox4基因的研究，主要集中在擬南芥和水稻上。研究者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的高羊茅FaGA2ox4基因異源轉(zhuǎn)入到水稻中，可以使水稻植株內(nèi)源GA含量降低，從而使植株出現(xiàn)矮化，葉片短寬等一系列GA缺失表型[10]。OsGA2ox4突變體水稻植株的生長(zhǎng)出現(xiàn)顯著抑制，矮化明顯[11]。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為第三代分子標(biāo)記，廣泛用于多物種的基因型鑒定，是研究人類(lèi)家族和動(dòng)植物品系遺傳變異的重要依據(jù)，因此被廣泛用于群體遺傳學(xué)研究和疾病相關(guān)基因的研究，在藥物基因組學(xué)、診斷學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中起重要作用，因此對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)、高效及高通量的檢測(cè)尤為重要。近年來(lái)，SNP檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展十分迅速，出現(xiàn)大量的SNP檢測(cè)方法，如測(cè)序、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CASP）、TaqMan探針?lè)ㄅc分子信標(biāo)、KASP特異引物檢測(cè)、引物延伸法等。除此之外，還有一些先進(jìn)的SNP檢測(cè)技術(shù)，如基因芯片法、質(zhì)譜法。這些技術(shù)都存在操作復(fù)雜、設(shè)備儀器成本昂貴、檢測(cè)成本高等問(wèn)題。五引物擴(kuò)增受阻突變體系技術(shù)（PARMS）是在四引物擴(kuò)增受阻突變體系（ARMS）的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的通過(guò)熒光檢測(cè)對(duì)SNPs進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷的技術(shù)[12]，無(wú)須對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行耗時(shí)的DNA電泳分析，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，同時(shí)保持了較高的標(biāo)記精確性，使得在大規(guī)模的育種項(xiàng)目中快速、準(zhǔn)確地篩選和鑒定抗性基因成為可能。目前已成為SNP檢測(cè)方法的首選，應(yīng)用廣泛。

采用引物延伸法的原理，往往產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性，大大限制了引物延伸法的準(zhǔn)確度。研究者對(duì)此方法進(jìn)行改造，研發(fā)出一種PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)3′末端核苷酸進(jìn)行雙脫氧修飾，擴(kuò)增時(shí)，當(dāng)引物與模板序列相同時(shí)，下一個(gè)dNTP原料由于無(wú)法與該3′末端核苷酸正常形成3′，5′-磷酸二酯鍵，因而無(wú)法添加上去，即該條引物被“封閉”，無(wú)法順利進(jìn)行延伸，因此最終結(jié)果是無(wú)法擴(kuò)增出包含SNP位點(diǎn)的目的片段；而當(dāng)引物與模板序列不同時(shí)，僅在最后一個(gè)堿基有差異，在SNP位點(diǎn)處，堿基序列發(fā)生了改變，導(dǎo)致該雙脫氧修飾引物的3′末端與此模板無(wú)法互補(bǔ)配對(duì)，即形成了錯(cuò)配，這樣在酶的作用下，可切掉該堿基，使擴(kuò)增繼續(xù)，獲得目的條帶，最終可依賴(lài)條帶的有無(wú)判定基因型。

考慮到測(cè)序法的成本昂貴，本研究以水稻OsGA2ox4基因突變型和野生型植株為材料，對(duì)PARMS檢測(cè)方法和自研基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法在水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4上的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，對(duì)比兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為水稻OsGA2ox4基因以及其他基因的SNP檢測(cè)提供一種便捷、靈敏而又準(zhǔn)確的方法，為后續(xù)與快速可視化診斷技術(shù)相結(jié)合，形成一套高效、精準(zhǔn)和高通量的SNP檢測(cè)模式奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為上海中科荃銀分子育種技術(shù)有限公司金山育種基地水稻，包括突變基因型材料（滬科1B，株高較矮，118份）和野生型材料（野香B，株高較高，39份）。

1.2 試驗(yàn)方法 本研究采用兩種SNP檢測(cè)方法對(duì)水稻材料進(jìn)行基因型鑒定，一種是利用武漢市景肽生物科技有限公司生產(chǎn)的PARMS（Penta-primer amplification refractory mutation system，五引物擴(kuò)增受阻突變體系）專(zhuān)業(yè)版檢測(cè)試劑進(jìn)行SNP檢測(cè)。另一種方法是由上海中科荃銀分子育種技術(shù)有限公司創(chuàng)制的基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法。

1.3 引物設(shè)計(jì) PARMS試劑盒采用5條引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中2條熒光通用引物包含在PARMS 2× Master Mix中，其余3條為標(biāo)記特異引物，需要根據(jù)水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4的序列設(shè)計(jì)合成。這3條中，1條為標(biāo)記位點(diǎn)的特異引物R，另2條為SNP等位基因特異引物F1和F2，這2條引物的5′端分別加上21個(gè)堿基的特定通用接頭序列，用于與熒光通用引物匹配擴(kuò)增，與FAM熒光匹配的接頭序列為GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，與HEX熒光匹配的接頭序列為GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。

根據(jù)野生型與突變型序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)OsGA2ox4基因在水稻5號(hào)染色體上第25495693位堿基由T突變?yōu)镃，該位點(diǎn)突變后，水稻植株變矮。針對(duì)另一種基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)一條SNP引物F3，另一條引物R與PARMS檢測(cè)方法共用。以上所用引物見(jiàn)表1。

1.4 水稻基因組DNA的提取 將水稻嫩葉剪直徑約2～3cm，置于96深孔板中，每孔加入2粒5mm鋼珠及TPS溶液400μL，研磨儀振動(dòng)頻率調(diào)整為60Hz，研磨1min；65℃烘箱加熱20min，期間輕微顛倒混勻；4000r/min離心20min，吸取上清液200μL轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，4000r/min離心20min；棄上清液，加入75%乙醇400μL，洗滌2次，獲得全基因組DNA，過(guò)夜至晾干為止，加入無(wú)菌水200μL溶解備用。

1.5 PCR反應(yīng)體系 PARMS檢測(cè)試劑：配制PCR反應(yīng)體系10μL，其中4.3μL的水稻基因組模板，2×PARMS 5μL，引物F1（10μM）用量0.15μL，引物F2（10μM）用量0.15μL，引物R（10μM）用量0.4μL。PCR反應(yīng)過(guò)程如下：蓋子加熱至105℃；94℃預(yù)熱15min；94℃變性20s，65℃（-0.8℃）延伸1min，10個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，57℃復(fù)性1min，28個(gè)循環(huán)。

基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的水稻OsGA2ox4基因的SNP檢測(cè)方法的PCR反應(yīng)體系為20μL，其中2μL的水稻基因組模板，高保真DNA聚合酶（2×Taq Master Mix II（Dye Plus））用量為6.7μL（20μL體系），非保真DNA聚合酶（2× Taq Master Mix（Dye Plus））用量為3.3μL（20μL體系）。上下游引物各1μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至20μL。PCR反應(yīng)過(guò)程如下：蓋子加熱至105℃；95℃預(yù)熱3min；95℃變性30s；65.2℃退火30s；65.2℃延伸30s；重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃保持10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 PARMS檢測(cè)試劑的驗(yàn)證結(jié)果 供試材料采用PARMS檢測(cè)試劑檢測(cè)水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4的基因型。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，藍(lán)色代表野生型，紅色代表突變體，綠色代表雜合體。236份材料中，有16份材料未判別出來(lái)，檢測(cè)結(jié)果顯示為“×”。在剩余220份水稻材料中，檢測(cè)出39份突變體，118份野生型，63份雜合體。

2.2 基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾檢測(cè)結(jié)果 基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4的SNP檢測(cè)方法較常規(guī)引物延伸法設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法，可有效解決假陽(yáng)性的問(wèn)題。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，236份材料中，檢測(cè)無(wú)條帶37份，鑒定為突變體，有條帶199份，包括野生型與雜合體。

2.3 OsGA2ox4基因檢測(cè)結(jié)果比較 兩種檢測(cè)方法的最終結(jié)果如表2，剔除掉16個(gè)PARMS檢測(cè)試劑熒光分型未成功的結(jié)果，有效參考水稻材料有220份。將兩種方法的220份檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，其中有15份材料在兩種檢測(cè)方法中有差異，分別是1號(hào)板的A2，5號(hào)板的F2、F6及G3，22號(hào)板的A1、A8、A12及B11，41號(hào)板的E1、E4及F8，42號(hào)板的C9、C12、E2及E5。由于用3′末端核苷酸雙脫氧修飾的水稻赤霉素代謝基因OsGA2ox4的SNP檢測(cè)方法，無(wú)論是突變體還是雜合體，皆會(huì)出現(xiàn)條帶，因此若不區(qū)分突變體與雜合體，其余205份材料二者檢測(cè)結(jié)果一致，符合率約為93.18%。

3 討論與結(jié)論

目前，DNA分子標(biāo)記檢測(cè)已成為水稻基因型鑒定的主要方法。隨著PCR技術(shù)的應(yīng)用，第一代分子標(biāo)記RFLP[13]標(biāo)記逐漸被以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記所取代，開(kāi)發(fā)出第二代分子標(biāo)記微衛(wèi)星標(biāo)記或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）。近年來(lái)廣泛采用的分子標(biāo)記是單核苷酸多態(tài)性（SNP），SNP標(biāo)記提供了分子標(biāo)記的最基本形式[14]。目前，SNP已經(jīng)成為主流的分子標(biāo)記，廣泛用于水稻育種研究[15]。

在PCR技術(shù)發(fā)明后，等位基因特異擴(kuò)增（ASP）/擴(kuò)增受阻突變體系（Amplification refractory mutation"system，ARMS）技術(shù)出現(xiàn)[16]。該技術(shù)利用引物3′末端堿基的差異，區(qū)分并特異擴(kuò)增特定等位基因DNA片段。但是天然DNA聚合酶對(duì)3′末端最后幾個(gè)堿基的復(fù)性匹配/錯(cuò)配選擇并不好，早期在引物末端人為引入新錯(cuò)配堿基，或者調(diào)整PCR退火溫度來(lái)保證擴(kuò)增的特異性，但這些手段相對(duì)復(fù)雜且有穩(wěn)定性問(wèn)題，因而限制該技術(shù)的應(yīng)用[17]。

PARMS技術(shù)從根本上解決了DNA聚合酶及PCR體系對(duì)SNP識(shí)別的問(wèn)題，能?chē)?yán)格進(jìn)行特異擴(kuò)增，產(chǎn)生正確的等位基因擴(kuò)增信號(hào)[18]。使用PARMS試劑盒進(jìn)行SNP基因分型速度快，僅PCR反應(yīng)后，熒光掃描即可得到檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果清晰可見(jiàn)，準(zhǔn)確度高。但是結(jié)果判定容易出現(xiàn)錯(cuò)誤情況，且在96孔板邊緣孔會(huì)出現(xiàn)溶液蒸發(fā)現(xiàn)象，極易影響結(jié)果判定，而且結(jié)果掃描依賴(lài)于熒光定量PCR儀或者酶標(biāo)儀，相對(duì)于普通的PCR Mix，PARMS試劑盒成本更高。

基于引物延伸法的原理，利用常規(guī)的PCR反應(yīng)即可檢測(cè)與分型SNP，往往產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性，大大限制了引物延伸法的準(zhǔn)確度[19-21]。即使通過(guò)諸多改造，如人為摻入錯(cuò)配堿基，增加外圍引物進(jìn)行巢式PCR等，都不能100%避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生。但是，基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的基因SNP檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便易行、可操作性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，高效經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。對(duì)PCR引物3′末端核苷酸進(jìn)行雙脫氧修飾，在高保真酶的作用下，切除錯(cuò)配堿基，解除了雙脫氧修飾的“封閉”作用，在DNA聚合酶的作用下可以順利延伸，最終與另一條引物一起，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)可以擴(kuò)增得到一條覆蓋SNP位點(diǎn)的目的片段。經(jīng)凝膠電泳分離后，得到清晰目的條帶，可有力區(qū)分野生型及突變型。

綜上所述，使用基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法，采用引物延伸法的原理，使用合適的反應(yīng)體系和最佳的退火溫度，效果更好，操作簡(jiǎn)單，又具有較高準(zhǔn)確度，高效經(jīng)濟(jì)。但是相對(duì)于PARMS試劑盒，耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法區(qū)分突變體與雜合體，只能檢測(cè)條帶的有無(wú)，區(qū)分野生型與突變體。因此，未來(lái)可針對(duì)其特點(diǎn)，結(jié)合后續(xù)的膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)，替換掉瓊脂糖凝膠電泳過(guò)程，開(kāi)發(fā)特異性篩查試劑盒，實(shí)現(xiàn)高效、低廉且可視化。基于PCR引物3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法不僅可用于水稻基因，還適用于所有物種的SNP檢測(cè)，普適性高。

本研究采用兩種SNP檢測(cè)方法，對(duì)236份水稻材料中的OsGA2ox4基因進(jìn)行基因型判定，結(jié)果表明兩種檢測(cè)的方法的符合率約為93.18%，證實(shí)基于3′末端核苷酸雙脫氧修飾的SNP檢測(cè)方法可用于水稻OsGA2ox4基因的檢測(cè)，該方法結(jié)果較準(zhǔn)確，具有推廣應(yīng)用潛力，研究結(jié)果也為基因型檢測(cè)鑒定技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步提供了一定的參考價(jià)值。

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