骨質(zhì)疏松癥銅死亡基因的免疫浸潤(rùn)分析及潛在中藥預(yù)測(cè)

〔摘要〕 目的 通過(guò)分析銅死亡基因在骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）免疫浸潤(rùn)中的作用，探索與OP相關(guān)的免疫細(xì)胞、免疫功能、生物標(biāo)志物和潛在治療中藥。方法 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索下載OP數(shù)據(jù)集，對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和消除批次效應(yīng)后合并。提取數(shù)據(jù)集中銅死亡的相關(guān)基因后，進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，對(duì)銅死亡基因進(jìn)行富集分析和中藥預(yù)測(cè)。結(jié)果 （1）對(duì)GSE13850、GSE56116、GSE56815、GSE230665數(shù)據(jù)集合并后篩選出18個(gè)銅死亡基因；（2）樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等在細(xì)胞浸潤(rùn)中占比較高，免疫細(xì)胞功能主要表現(xiàn)為抗原呈遞共抑制、Ⅰ型干擾素反應(yīng)、Ⅱ型干擾素反應(yīng)等；（3）與健康對(duì)照組相比，巨噬細(xì)胞與未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞在OP患者組中呈現(xiàn)高表達(dá)，而濾泡輔助性T細(xì)胞在健康對(duì)照組中顯著表達(dá)；（4）SLC31A1等13個(gè)銅死亡基因與OP免疫浸潤(rùn)相關(guān)，其中，SLC31A1最有可能是導(dǎo)致OP的風(fēng)險(xiǎn)因子；（5）OP的進(jìn)展涉及乙酰輔酶A生物合成與代謝等生物過(guò)程，與脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)等通路相關(guān)；（6）共篩選出魚(yú)鰾膠等10味重要中藥，四氣多屬溫、平，五味多屬甘，歸腎、脾經(jīng)，功效多為補(bǔ)氣、健脾、補(bǔ)腎、活血、行氣和止痛。結(jié)論 銅死亡基因可能通過(guò)干預(yù)免疫細(xì)胞和功能參與OP的進(jìn)展。SLC31A1等銅死亡基因可能有助于闡釋OP的發(fā)病機(jī)制，并成為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，魚(yú)鰾膠等中藥可能是防治OP潛在分子藥物的來(lái)源。

〔關(guān)鍵詞〕 銅死亡；骨質(zhì)疏松癥；免疫浸潤(rùn)；單樣本基因集富集分析；中藥預(yù)測(cè)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R274.9" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.025

Immune infiltration analysis of cuproptosis-related genes in osteoporosis and prediction of potential Chinese medicines

SONG ShiLei1， CHEN Yueping2*

1. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200， China; 2. Ruikang Hospital of

Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530011， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To analyze the role of cuproptosis-related genes in immune infiltration of osteoporosis （OP）， so as to explore the immune cells， immune function， biomarkers， and potential therapeutic Chinese medicines related to OP. Methods The OP datasets were retrieved and downloaded from the GEO database， and they were standardized and merged after eliminating batch effects. After extracting the relevant cuproptosis-related genes from the datasets， the immune infiltration analysis was carried out and the risk model was constructed to perform enrichment analysis on the cuproptosis-related genes and to predict Chinese medicines with potential therapeutic effects. Results （1） Eighteen cuproptosis-related genes were screened from the merged datasets of GSE13850， GSE56116， GSE56815， and GSE230665; （2） dendritic cells， B cells， CD8+T cells， and other cells accounted for a relatively high proportion in cell infiltration， and immune cell functions mainly manifested as antigen presentation co-suppression， type I interferon response， type II interferon response， and others; （3） compared with the healthy control group， macrophages and immature dendritic cells were highly expressed in the OP group， while follicular helper T cells were significantly expressed in the healthy control group; （4） thirteen cuproptosis-related genes including SLC31A1 were associated with OP immune infiltration， among which SLC31A1 was the most likely risk factor for OP; （5） the progress of OP involved biological processes such as acetyl-CoA biosynthesis and metabolism， which were related to fatty acid metabolism， tricarboxylic acid cycle， and other pathways; （6） a total of ten important Chinese medicines， including fish bladder glue， were screened out. Most of them are warm and neutral in property， sweet in flavour， and access the kidney and spleen meridians. And their effects are mostly supplementing qi， strengthening the spleen， tonifying the kidney， circulating blood， moving qi， and alleviating pain. Conclusion Cuproptosis-related genes may be involved in the progression of OP by intervening with immune cells and functions. Those such as SLC31A1 may help elucidate the pathogenesis of OP and become potential biological markers and therapeutic targets. Moreover， Chinese medicines such as fish bladder glue may be the source of potential molecular drugs for OP prevention and treatment.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 cuproptosis; osteoporosis; immune infiltration; single-sample gene set enrichment analysis; Chinese medicines prediction

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP）作為一種骨科代謝性疾病，病理改變通常表現(xiàn)為骨密度與骨強(qiáng)度的降低，這極大增加了骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。隨著醫(yī)療衛(wèi)生的不斷改善，人口老齡化日趨加重，OP的患病率逐年升高[1]。目前認(rèn)為骨代謝紊亂、免疫系統(tǒng)失衡、激素水平改變、遺傳因素等是OP重要的致病因素[2]。隨著對(duì)骨免疫的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞在維持骨骼健康方面發(fā)揮重要作用，受T細(xì)胞調(diào)節(jié)的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）被證明可以加速成骨細(xì)胞的凋亡；B細(xì)胞產(chǎn)生的破骨細(xì)胞分化因子可刺激破骨細(xì)胞生成，從而加速骨丟失[2]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，骨相關(guān)炎性疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牙周炎等均存在骨丟失，骨代謝失衡導(dǎo)致的骨丟失與免疫細(xì)胞具有一定的關(guān)聯(lián)[3]。因此，通過(guò)對(duì)OP的免疫浸潤(rùn)機(jī)制研究，可以發(fā)現(xiàn)致病性的免疫細(xì)胞和免疫功能，并尋找方法對(duì)其進(jìn)行消除或抑制，對(duì)治療OP具有重要意義。

銅在生命過(guò)程中是一種不可或缺的元素，它作為酶的輔助因子參與線粒體三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle， TCA）等多種生理途徑。研究發(fā)現(xiàn)，銅離子與TCA中的脂酰化成分結(jié)合，可導(dǎo)致脂酰化蛋白的異常聚集和鐵-硫簇蛋白的丟失，從而引發(fā)蛋白負(fù)荷應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。同時(shí)，銅也參與免疫系統(tǒng)的多種功能，包括調(diào)節(jié)先天性免疫細(xì)胞的激活，影響組織中免疫細(xì)胞的分布等[5]。目前，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，銅死亡基因?qū)γ庖呒?xì)胞在組織中的表達(dá)具有一定影響，比如對(duì)正常膀胱組織與膀胱癌組織的免疫浸潤(rùn)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，銅死亡基因的高表達(dá)促使T細(xì)胞與B細(xì)胞等出現(xiàn)高表達(dá)[6]；另一項(xiàng)銅死亡基因?qū)肆_恩病的免疫浸潤(rùn)影響機(jī)制研究也得到類(lèi)似的結(jié)果[7]。上述研究說(shuō)明銅死亡可能與免疫系統(tǒng)的調(diào)控和炎癥反應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)。目前，銅死亡引起OP的機(jī)制研究雖并不完善，但結(jié)合銅死亡基因?qū)γ庖呒?xì)胞的影響以及免疫細(xì)胞對(duì)骨代謝的影響，可得出銅死亡基因可能通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞從而對(duì)骨代謝平衡產(chǎn)生影響。深入了解銅死亡在免疫浸潤(rùn)中的作用機(jī)制，有助于揭示細(xì)胞死亡與免疫調(diào)節(jié)之間的相互關(guān)系，為OP的治療提供新的思路。因此，本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)方法，深入研究銅死亡基因在OP免疫浸潤(rùn)中的作用。

本研究通過(guò)對(duì)OP銅死亡基因的篩選，將篩選出的銅死亡基因與免疫細(xì)胞及功能之間進(jìn)行相關(guān)分析，同時(shí)，分析銅死亡基因與免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。此外，通過(guò)構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，篩選出關(guān)鍵基因并對(duì)其進(jìn)行富集分析和中藥預(yù)測(cè)。通過(guò)解析銅死亡基因的潛在功能和與其相互作用的免疫浸潤(rùn)網(wǎng)絡(luò)，分析中藥治療OP的生物標(biāo)志物與藥物靶點(diǎn)，為中醫(yī)治療OP提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1" 相關(guān)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)信息

本次研究使用的軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)信息如下。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；Perl語(yǔ)言5.38.0；R語(yǔ)言4.3.1；分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）；miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.mirbase.org/）；miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//mirdb.org/）；miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）；TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.targetscan.org/vert_80/）；spongeScan數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//spongescan.rc.ufl.edu）；Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.coremine.com/）；Cytoscape軟件3.10.1。

1.2" OP原始數(shù)據(jù)及銅死亡基因獲取

以“Osteoporosis”“Gene expression”為關(guān)鍵詞，以“Expre-ssion profiling by array”“Homo sapiens”“Series”為限定標(biāo)準(zhǔn)，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載OP基因表達(dá)探針矩陣文件及平臺(tái)文件。通過(guò)對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)一步篩選，最后納入4個(gè)數(shù)據(jù)集，包括GSE13850、GSE56116、GSE56815和GSE230665，共包含82例OP患者（OP患者組）與66例健康者（健康對(duì)照組），數(shù)據(jù)集分別由GPL570平臺(tái)、GPL4133平臺(tái)、GPL570平臺(tái)、GPL10332平臺(tái)生成。

檢索國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)相關(guān)網(wǎng)站，如中國(guó)知網(wǎng)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，Embase、PubMed等。以“銅死亡”為中文檢索詞，以“Cuproptosis”為英文檢索詞，同時(shí)追蹤納入研究的參考文獻(xiàn)，檢索時(shí)限均為建庫(kù)至2023年10月30日。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

利用Perl語(yǔ)言對(duì)下載的4個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲得含有基因名的OP矩陣文件，利用R語(yǔ)言的“l(fā)imma”包（版本3.2）和“SVA”包（版本3.8）對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并對(duì)合并后的矩陣進(jìn)行批次校正。根據(jù)結(jié)果繪制批次校正前和批次校正后的主成分分析（principal components analysis，PCA）圖，同時(shí)輸出合并后的基因表達(dá)矩陣，對(duì)合并輸出后的基因進(jìn)行銅死亡基因篩選，最終獲得銅死亡基因表達(dá)矩陣。

1.4" 免疫細(xì)胞和功能的提取與量化

在分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索關(guān)鍵詞“Immunity”，下載相關(guān)數(shù)據(jù)文件“gmt”，使用R語(yǔ)言中的“GSVA”數(shù)據(jù)處理包對(duì)4個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并處理分析，使用單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）對(duì)合并后的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行分析。最后，使用R語(yǔ)言的“pheatmap”包繪制熱圖。

1.5" 免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

為探索不同免疫細(xì)胞間的關(guān)聯(lián)以及不同免疫功能間的關(guān)聯(lián)，運(yùn)用R語(yǔ)言中的“corrplo”數(shù)據(jù)處理包進(jìn)行相關(guān)性分析，并聯(lián)合ssGSEA得出的結(jié)果，最終獲得免疫細(xì)胞間以及免疫功能間的相關(guān)性信息。

1.6" 免疫浸潤(rùn)的差異性分析

為比較OP患者組和健康對(duì)照組中免疫細(xì)胞以及免疫功能的差異，將樣本的分組信息與ssGSEA表達(dá)矩陣結(jié)果進(jìn)行整合。隨后，運(yùn)用R語(yǔ)言的“ggpubr”包進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，并以箱線圖的形式展示結(jié)果，以便篩選出在兩組之間存在顯著差異的免疫細(xì)胞和免疫功能。

1.7" 銅死亡基因與免疫浸潤(rùn)及免疫功能的相關(guān)性分析

將“1.4”獲得的ssGSEA表達(dá)矩陣與篩選出的銅死亡基因進(jìn)行整合，并運(yùn)用R語(yǔ)言中的“psych”數(shù)據(jù)包對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析，使用R語(yǔ)言的“ggcorrplot”包對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行可視化處理，繪制相關(guān)性熱圖。最后，篩選出與免疫浸潤(rùn)結(jié)果具有強(qiáng)相關(guān)性的銅死亡基因。

1.8" 預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

運(yùn)用銅死亡關(guān)鍵基因表達(dá)矩陣中的健康對(duì)照組樣本和OP患者組樣本的分組數(shù)據(jù)構(gòu)建Logistic回歸風(fēng)險(xiǎn)模型，得到相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)作為分割點(diǎn)，高于中位數(shù)代表高風(fēng)險(xiǎn)，低于中位數(shù)代表低風(fēng)險(xiǎn)。再利用R語(yǔ)言的“rms”包，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖。并通過(guò)校準(zhǔn)曲線和受試者工作曲線（receiver operating characteristic，ROC）進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)估模型的準(zhǔn)確性。

1.9" GO與KEGG富集分析

運(yùn)用R語(yǔ)言的“clusterProfiler”包對(duì)篩選獲得的銅死亡關(guān)鍵基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因本體論（gene ontology， GO）與京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析，將獲得的結(jié)果再利用R語(yǔ)言的“ggplot2”包進(jìn)行可視化處理。

1.10" 潛在中藥的篩選預(yù)測(cè)

在Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)中逐個(gè)檢索關(guān)鍵基因和GO富集分析中與免疫浸潤(rùn)相關(guān)的生物過(guò)程，包括乙酰輔酶A生物合成與代謝、核苷二磷酸生物合成、巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程、白細(xì)胞凋亡過(guò)程、干細(xì)胞分化、白細(xì)胞遷移和白細(xì)胞介素-1（interleukin-1， IL-1）的產(chǎn)生等，篩選“Traditional Chinese Medicine”模塊中的信息，以確定其中具有潛在治療作用的中藥。隨后采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，并以Plt;0.01為篩選條件，篩選對(duì)各預(yù)測(cè)靶標(biāo)具有生物學(xué)效應(yīng)的前10味中藥，對(duì)中藥的四氣五味、歸經(jīng)和功效進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1" 銅死亡基因檢索結(jié)果

通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)（4篇[3-6]）以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得19個(gè)與銅死亡相關(guān)的基因，包括NFE2L2、NLRP3、ATP7B、ATP7A、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、LIPT2、DLD、GLS、CDKN2A、DBT、GCSH、DLST。

2.2" PCA分析和銅死亡基因提取

對(duì)4個(gè)數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，去除數(shù)據(jù)集間的批次效應(yīng)并進(jìn)行合并，輸出合并后的數(shù)據(jù)集。再根據(jù)結(jié)果繪制批次校正前和批次校正后的PCA圖（圖1A）。在批次校正前的PCA圖中，不同批次之間存在明顯的分離現(xiàn)象。而在批次校正后，批次之間發(fā)生重疊，表明批次校正成功地消除了批次效應(yīng)。再提取該矩陣中的銅死亡基因，共得到18個(gè)銅死亡基因組成的表達(dá)矩陣（圖1B）。

2.3" 免疫細(xì)胞和免疫功能的浸潤(rùn)情況

本研究共涉及29種免疫細(xì)胞和免疫功能的類(lèi)型，免疫細(xì)胞包括活化樹(shù)突狀細(xì)胞（activated dendritic cells， aDCs）、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等；免疫功能則包括抗原呈遞共抑制、Ⅰ型干擾素反應(yīng)、Ⅱ型干擾素反應(yīng)等。使用ssGSEA算法計(jì)算合并后的數(shù)據(jù)集中免疫細(xì)胞及免疫功能在各個(gè)樣本中的表達(dá)水平。詳見(jiàn)圖2。

2.4" 免疫細(xì)胞間、免疫功能間的相關(guān)性

本研究通過(guò)分析OP中免疫細(xì)胞間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）與輔助性T淋巴細(xì)胞呈強(qiáng)正相關(guān)性（r=0.77）、TIL與CD8+T細(xì)胞呈強(qiáng)正相關(guān)性（r=0.67）。通過(guò)分析OP中免疫功能間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞溶解活性與促進(jìn)炎癥活動(dòng)呈強(qiáng)正相關(guān)性（r=0.78）、T細(xì)胞共刺激與免疫細(xì)胞檢查點(diǎn)呈強(qiáng)正相關(guān)性（r=0.76）。詳見(jiàn)圖3。

2.5" 差異性免疫細(xì)胞和免疫功能

對(duì)OP患者組與健康對(duì)照組進(jìn)行組間免疫細(xì)胞差異分析，Plt;0.05則代表差異具有顯著性。結(jié)果顯示，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在OP患者組中顯著表達(dá)（Plt;0.01），而濾泡輔助T細(xì)胞在健康對(duì)照組中顯著表達(dá)（Plt;0.01）。對(duì)OP患者組與健康對(duì)照組進(jìn)行組間免疫功能差異分析，Plt;0.05則代表差異具有顯著性。結(jié)果顯示，趨化因子受體、組織相容性復(fù)合體Ⅰ在OP患者組中顯著表達(dá)（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖4。

2.6" 銅死亡基因與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

對(duì)OP銅死亡相關(guān)基因與免疫浸潤(rùn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，多個(gè)銅死亡基因如SLC31A1、PDHB、PDHA1、NFE2L2等與多個(gè)免疫細(xì)胞及功能之間存在顯著的相關(guān)性。將上述基因作為本次研究的關(guān)鍵基因，用于后續(xù)的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型、KEGG和GO富集分析等。

2.7" 預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

從構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中可看出銅死亡基因SLC31A1最有可能是導(dǎo)致OP的風(fēng)險(xiǎn)因子。ROC曲線評(píng)估可見(jiàn)AUC值為0.72，大于0.6，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型的列線圖具有較高的準(zhǔn)確性，具有高度的診斷效能。校正曲線顯示，其與理想曲線擬合較好，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型在預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性方面表現(xiàn)出了很高的可信度。詳見(jiàn)圖6。

2.8" GO與KEGG富集分析

對(duì)13個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果表明，關(guān)鍵基因主要富集在乙酰輔酶A生物合成與代謝、核苷二磷酸生物合成、巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程、白細(xì)胞凋亡過(guò)程、干細(xì)胞分化、白細(xì)胞遷移和IL-1的產(chǎn)生等生物過(guò)程中；在細(xì)胞成分上，主要有線粒體基質(zhì)、氧化還原酶復(fù)合體和TCA酶復(fù)合體；分子功能方面，主要在氧化還原酶活性、過(guò)渡金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性和酰基轉(zhuǎn)移酶活性中發(fā)揮作用（圖7）。分析結(jié)果顯示，在所有生物過(guò)程中，巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程、白細(xì)胞凋亡過(guò)程、干細(xì)胞分化、白細(xì)胞遷移和IL-1的產(chǎn)生與免疫浸潤(rùn)關(guān)系密切。KEGG富集分析結(jié)果表明，OP的關(guān)鍵基因主要在脂肪酸代謝、TCA、2-酮羧酸代謝和丙酮酸代謝中被激活（圖8）。

2.9" 中藥預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)，以Plt;0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)關(guān)鍵基因和免疫浸潤(rùn)相關(guān)的生物過(guò)程進(jìn)行中藥預(yù)測(cè)，共得到156種中藥。為了更好地展示預(yù)測(cè)結(jié)果，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，創(chuàng)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的中藥為魚(yú)鰾膠、魚(yú)腦石、柴胡、姜黃、郁金、靈芝、人參、甘草、黃芪和白術(shù)（圖9），表明它們是治療OP的主要藥物。四氣五味、歸經(jīng)與功效分析結(jié)果顯示，藥物四氣多屬溫、平，五味多屬甘，歸經(jīng)主要集中在腎、脾經(jīng)，功效多為補(bǔ)氣、健脾、補(bǔ)腎、活血、行氣和止痛（圖10）。

3 討論

OP為一種全身性代謝性疾病，其主要特征在于骨骼系統(tǒng)的不平衡狀態(tài)。骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在緊密的關(guān)聯(lián)，免疫細(xì)胞在調(diào)節(jié)骨代謝中扮演著重要角色，如B細(xì)胞參與骨吸收和骨形成的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞則通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)骨骼健康產(chǎn)生影響[8-9]。此外，與免疫系統(tǒng)相關(guān)的因素也可能在OP的預(yù)防和管理中扮演關(guān)鍵角色[10]。因此，識(shí)別和探討OP免疫相關(guān)的分子機(jī)制對(duì)其治療具有重要意義。

本研究通過(guò)分析免疫細(xì)胞間和免疫功能間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，OP與免疫系統(tǒng)之間存在緊密關(guān)聯(lián)。我們發(fā)現(xiàn)TIL與輔助性T細(xì)胞、TIL與CD8+T細(xì)胞之間存在強(qiáng)正相關(guān)性，表明它們?cè)贠P中的協(xié)同作用可能有助于維持骨質(zhì)的穩(wěn)定性。輔助性T細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)TIL的免疫反應(yīng)，發(fā)揮維持骨骼健康的作用，而CD8+T細(xì)胞則在清除受損細(xì)胞方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11-12]。對(duì)于免疫功能的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞溶解活性與炎癥促進(jìn)活動(dòng)之間存在強(qiáng)正相關(guān)性，表明免疫系統(tǒng)的活性和免疫調(diào)控之間存在密切的互動(dòng)。細(xì)胞溶解活性代表免疫系統(tǒng)清除異常細(xì)胞的潛力，而炎癥促進(jìn)活動(dòng)則涵蓋了免疫系統(tǒng)引發(fā)炎癥的功能。這種正相關(guān)性提示，細(xì)胞的溶解和炎癥過(guò)程可能存在相互促進(jìn)作用[13]。另外，T細(xì)胞共刺激與免疫細(xì)胞檢查點(diǎn)也呈強(qiáng)正相關(guān)性，表明T細(xì)胞的激活和免疫調(diào)節(jié)之間存在動(dòng)態(tài)平衡。T細(xì)胞共刺激代表T細(xì)胞相互協(xié)作的過(guò)程，而免疫細(xì)胞檢查點(diǎn)則代表免疫系統(tǒng)中的一種負(fù)性調(diào)控機(jī)制，這種相關(guān)性對(duì)于維持免疫平衡和骨骼健康至關(guān)重要[14]。

通過(guò)分析免疫細(xì)胞和免疫功能的差異性發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)的異常活躍狀態(tài)可能是導(dǎo)致OP發(fā)生發(fā)展的重要原因。在OP患者中，樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、趨化因子受體、組織相容性復(fù)合體Ⅰ表達(dá)顯著增加。其中樹(shù)突狀細(xì)胞可以通過(guò)呈遞抗原和激活T細(xì)胞的方式引發(fā)免疫反應(yīng)，然而在OP病理情況下，樹(shù)突狀細(xì)胞可能異常激活T細(xì)胞，誘發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)吸收增加[15]。巨噬細(xì)胞在炎癥條件下，會(huì)分泌腫瘤壞死因子和IL-1等炎癥介質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡和骨吸收[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，趨化因子受體和組織相容性復(fù)合體Ⅰ顯著表達(dá)，說(shuō)明OP患者的免疫系統(tǒng)處于高度活躍狀態(tài)，可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞進(jìn)入骨組織并產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)。這些細(xì)胞會(huì)攻擊健康的骨組織并引發(fā)骨骼中的細(xì)胞凋亡和溶解，導(dǎo)致骨質(zhì)丟失[17]。在健康對(duì)照組中，濾泡輔助T細(xì)胞的顯著表達(dá)反映了其在維持正常骨骼健康中的重要作用。濾泡輔助T細(xì)胞通常參與抗體產(chǎn)生和細(xì)胞免疫應(yīng)答，在淋巴組織中的定位使其能夠調(diào)控局部免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體，有助于維持骨骼的免疫平衡，確保不會(huì)發(fā)生過(guò)度的骨質(zhì)吸收或不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)[12]。

為進(jìn)一步探究銅死亡在OP免疫浸潤(rùn)方面的機(jī)制，運(yùn)用風(fēng)險(xiǎn)模型篩選出與OP免疫浸潤(rùn)相關(guān)的13個(gè)銅死亡基因，包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、NFE2L2、LIPT1等，其中SLC31A1最有可能是導(dǎo)致OP的風(fēng)險(xiǎn)因子。研究發(fā)現(xiàn)[18-20]，SLC31A1和ATP7B編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有助于維持免疫細(xì)胞內(nèi)的銅平衡，進(jìn)而維持其抗氧化和免疫功能；在OP中，SLC31A1和ATP7B的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞內(nèi)銅供應(yīng)不足，降低其抗氧化能力，導(dǎo)致細(xì)胞更容易受到氧化應(yīng)激的損害，并影響免疫細(xì)胞的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)。PDHB、PDHA1、DLD和DLAT編碼的線粒體脫氫酶在免疫細(xì)胞中參與葡萄糖代謝和線粒體呼吸，并提供所需的能量和功能，而免疫細(xì)胞在激活狀態(tài)下具有高能量需求，因此，異常的葡萄糖代謝和線粒體功能會(huì)對(duì)免疫細(xì)胞的活性和功能產(chǎn)生不利影響，繼而影響骨代謝[3，21]。LIPT1與脂質(zhì)代謝和細(xì)胞膜組成緊密相關(guān)，細(xì)胞膜的組成對(duì)于免疫細(xì)胞的功能和信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要，而異常的脂質(zhì)代謝會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損、信號(hào)傳導(dǎo)異常以及免疫平衡紊亂，進(jìn)而干擾免疫細(xì)胞對(duì)骨組織的免疫反應(yīng)[22]。CDKN2A編碼細(xì)胞周期抑制蛋白，對(duì)細(xì)胞的增殖和生存起調(diào)控作用，然而，CDKN2A的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞的數(shù)量減少、功能降低，從而對(duì)OP的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響[23-24]。上述基因都有可靠的證據(jù)支持其參與調(diào)控銅死亡，但關(guān)于NFE2L2、GLS、GCSH、FDX1和DBT調(diào)控銅死亡在OP中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。綜合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銅和銅死亡相關(guān)基因介導(dǎo)免疫細(xì)胞的功能、代謝和抗氧化反應(yīng)，對(duì)OP免疫浸潤(rùn)產(chǎn)生影響，進(jìn)一步提示銅死亡與OP發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)OP病名，根據(jù)其臨床癥狀及病因病機(jī)特點(diǎn)，可將其歸屬于“骨痿”的范疇。目前，臨床上將OP分為腎虛血瘀證、肝腎陰虛證、脾腎陽(yáng)虛證、氣滯血瘀證和脾腎陽(yáng)虛兼血瘀證[25]。本研究對(duì)銅死亡基因進(jìn)行相應(yīng)的中藥預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，篩選出的藥物藥性主要為溫，藥味主要為平、甘，歸經(jīng)主要為腎、脾、肺經(jīng)，功效主要為補(bǔ)腎、健脾、補(bǔ)氣等，這與上述病機(jī)相對(duì)應(yīng)，并且有中醫(yī)學(xué)者[26]認(rèn)為“以補(bǔ)腎壯骨、益精填髓為主，健脾益氣、和胃助運(yùn)為輔”是治療OP的主要方法，由此可見(jiàn)本次通過(guò)基因篩選出的藥物具有一定的準(zhǔn)確性。

目前，尚未見(jiàn)生物信息學(xué)結(jié)合預(yù)測(cè)中藥技術(shù)與證候?qū)嵸|(zhì)相關(guān)的研究報(bào)道。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)篩選OP銅死亡基因、預(yù)測(cè)中藥，將有望為其證候?qū)嵸|(zhì)研究提供前期理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] LI Z C， LI D D， CHEN R C， et al. Cell death regulation： A new way for natural products to treat osteoporosis[J]. Pharmacological Research， 2023， 187： 106635.

[2] FISCHER V， HAFFNER-LUNTZER M. Interaction between bone and immune cells： Implications for postmenopausal osteoporosis[J]. Seminars in Cell amp; Developmental Biology， 2022， 123： 14-21.

[3] LI D， GAO Z， LI Q， et al. Cuproptosis-a potential target for the treatment of osteoporosis[J]. Frontiers in Endocrinology， 2023， 5（14）： 1135181.

[4] TSVETKOV P， COY S， PETROVA B， et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins[J]. Science， 2022， 375（6586）： 1254-1261.

[5] CHANG B， HU Z， CHEN L， et al. Development and validation of cuproptosis-related genes in synovitis during osteoarthritis progress[J]. Frontiers in Immunology， 2023， 14： 1090596.

[6] 卓桂鋒， 陳" 煒， 朱健敏， 等. 血管性癡呆銅死亡關(guān)鍵差異基因的生物信息學(xué)分析及防治中藥篩選[J]. 中草藥， 2023， 54（21）： 7120-7129.

[7] SONG Q， ZHOU R， SHU F， et al. Cuproptosis scoring system to predict the clinical outcome and immune response in bladder cancer[J]. Frontiers in Immunology， 2022， 4 （13）： 958368.

[8] YUAN Y F， FU M Y， LI N， et al. Identification of immune infiltration and cuproptosis-related subgroups in Crohn's disease[J]. Frontiers in Immunology， 2022， 13： 1074271.

[9] 楊會(huì)軍， 郭" 響， 李偉青， 等. 靶向銅死亡相關(guān)基因治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎生物信息學(xué)分析及干預(yù)中藥的預(yù)測(cè)[J]. 中草藥， 2023， 54（13）： 4253-4265.

[10] 郭曹培， 程飄濤， 楊成兵， 等. 骨免疫與骨代謝[J]. 中國(guó)組織工程研究， 2024， 28（14）： 2261-2266.

[11] AHMAD S S， AHMED F， ALI R， et al. Immunology of osteoporosis： Relevance of inflammatory targets for the development of novel interventions[J]. Immunotherapy， 2022， 14（10）： 815-831.

[12] 何姣姣， 陳以發(fā)， 陳玉林， 等. 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨免疫學(xué)機(jī)制[J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志， 2023， 29（7）： 1032-1036.

[13] SRIVASTAVA R K， DAR H Y， MISHRA P K. Immunoporosis： Immunology of osteoporosis-role of T cells[J]. Frontiers in Immunology， 2018， 9： 657.

[14] D'ABRAMO A， ZINGAROPOLI M A， OLIVA A， et al. Higher levels of osteoprotegerin and immune activation/immunosenes？鄄cence markers are correlated with concomitant bone and endovascular damage in HIV-suppressed patients[J]. PLoS One， 2016， 11（2）： e0149601.

[15] CRON R Q， GOYAL G， CHATHAM W W. Cytokine storm syndrome[J]. Annual Review of Medicine， 2023， 74： 321-337.

[16] ZHENG D， WEI Z， GUO W C. Identification of a solute carrier family-based signature for predicting overall survival in osteosarcoma[J]. Frontiers in Genetics， 2022， 13： 849789.

[17] LIU Y C G， TENG A Y T. Potential contribution of immature myeloid CD11c+dendritic cells-derived osteoclast precursor to inflammation-induced bone loss in the TRAF6-1 chimeras in-vivo[J]. Journal of Dental Sciences， 2023， 18（3）： 1372-1377.

[18] VERONESE N， REGINSTER J Y. The effects of calorie restriction， intermittent fasting and vegetarian diets on bone health[J]. Aging Clinical and Experimental Research， 2019， 31（6）： 753-758.

[19] ZHANG W J， DANG K， HUAI Y， et al. Osteoimmunology： The regulatory roles of T lymphocytes in osteoporosis[J]. Frontiers in Endocrinology， 2020， 11： 465.

[20] QI Y， YAO Q Q， LI X Y， et al. Cuproptosis-related gene SLC31A1： Prognosis values and potential biological functions in cancer[J]. Scientific Reports， 2023， 13（1）： 17790.

[21] TANG S， LIANG C， HOU W， et al. ATP7B R778L mutant hepatocytes resist copper toxicity by activating autophagy and inhibiting necroptosis[J]. Cell Death Discovery， 2023， 9（1）： 344.

[22] CIPRIANI C， COLANGELO L， SANTORI R， et al. The interplay between bone and glucose metabolism[J]. Frontiers in Endocrinology， 2020， 11： 122.

[23] NI M， SOLMONSON A， PAN C X， et al. Functional assessment of lipoyltransferase-1 deficiency in cells， mice， and humans[J]. Cell Reports， 2019， 27（5）： 1376-1386.

[24] HATZISTERGOS K E， WILLIAMS A R， DYKXHOORN D， et al. Tumor suppressors RB1 and CDKN2a cooperatively regulate cell-cycle progression and differentiation during cardiomyocyte development and repair[J]. Circulation Research， 2019， 124（8）： 1184-1197.

[25] 中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì). 骨質(zhì)疏松性骨折中醫(yī)診療指南[J]. 中醫(yī)正骨， 2023， 35（1）： 1-9.

[26] 張" 遼， 葉有駿， 鄧穎萍， 等. 葉海從肝脾腎論治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗(yàn)擷菁[J]. 浙江中醫(yī)雜志， 2023， 58（11）： 803-804.