歸脾丸對糞菌移植造模的孤獨癥譜系障礙大鼠行為學及腦5-HT含量的影響

〔摘要〕 目的 驗證歸脾丸改善孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）子代大鼠核心癥狀的療效，觀察其對腦5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量的影響，并探討其療效與腦5-HT水平的相關性。方法 將10只SPF級SD孕鼠隨機分為正常孕鼠組（3只）和糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）孕鼠組（7只），FMT孕鼠組通過FMT法進行造模。子代鼠出生第28天時，通過行為學檢測篩選符合ASD疾病模型的雄鼠30只，隨機分為模型組（等體積生理鹽水）、歸脾丸低劑量組（0.75 g/kg）、歸脾丸中劑量組（1.5 g/kg）、歸脾丸高劑量組（3 g/kg）、雙歧桿菌組（0.5 g/kg），每組6只；正常雄鼠6只，設置為正常組（等體積生理鹽水）。各組連續灌胃14 d，1次/d。記錄大鼠體質量；采用行為學檢測評估療效；采用ELISA法測定大鼠前額5-HT含量；等級相關分析法分析子代大鼠社交能力及社交新穎性與5-HT的相關性。結果 與正常孕鼠組比較，FMT孕鼠組子代鼠睜眼時間延長（P＜0.05）、體質量下降（P＜0.05）。用藥前，與正常組比較，模型組社交能力降低（P＜0.05）、社交新穎性降低（P＜0.05）、焦慮程度增加（P＜0.05）。用藥2周后，與正常組比較，模型組社交能力降低（P＜0.05）、社交新穎性降低（P＜0.05）、焦慮程度加重（P＜0.05）、體質量及5-HT含量下降（P＜0.05）。與模型組比較，各用藥組社交能力增強（P＜0.05）、社交新穎性增強（P＜0.05）、焦慮狀態減輕（P＜0.05）、5-HT含量增加（P＜0.05）；歸脾丸中、高劑量組，雙歧桿菌組體質量增加（P＜0.05）。與歸脾丸高劑量組比較，歸脾丸低劑量組社交能力降低（P＜0.05）、社交新穎性降低（P＜0.05），體質量及5-HT含量下降（P＜0.05），歸脾丸中劑量組5-HT含量下降（P＜0.05），雙歧桿菌組社交新穎性降低（P＜0.05）。相關新分析顯示，ASD大鼠社交偏好系數及新穎偏好系數與5-HT含量呈顯著正相關（P＜0.05）。結論 歸脾丸可顯著改善FMT子代大鼠的ASD樣行為，其機制可能與上調腦內5-HT含量有關。

〔關鍵詞〕 孤獨癥譜系障礙；歸脾丸；5-羥色胺；糞菌移植法；社交能力；社交新穎性

〔中圖分類號〕R272" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.002

Effects of Guipi Pill on behavior and brain 5-HT content in rats with autism spectrum disorder modeled by fecal microbiota transplantation

HAO Xingyu1， XIE Ying2， WU Ji1， ZHU Qinquan2， ZHANG Di2， JIANG Ping2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To verify the efficacy of Guipi Pill in alleviating core symptoms in offspring rats with autism spectrum disorder （ASD）， to observe its effects on the content of 5-hydroxytryptamine （5-HT） in the brain， and to explore the correlation between its efficacy and the level of 5-HT in the brain. Methods Ten SPF SD pregnant rats were randomized into normal pregnant group （n=3） and fecal microbiota transplantation （FMT） pregnant group （n=7）. The FMT pregnant group was modeled by FMT method. On the 28th day of birth， 30 male rats were screened by behavioral test to meet the ASD disease model. Then they were randomly subdivided into model group （an equal volume of normal saline）， the low-， medium-， and high-dose （0.75 g/kg， 1.5 g/kg， 3 g/kg） Guipi Pill groups， and the Bifidobacterium （0.5 g/kg） group， with six rats in each group. In addition， six normal male rats were set as normal group （an equal volume of normal saline）. Each group was given intragastric administration for 14 d， once a day. The body weight of rats was recorded， the efficacy was evaluated by behavioral test， the content of 5-HT in the forehead of rats was determined by ELISA， and the correlation between sociability， social novelty and 5-HT in offspring rats was analyzed by rank correlation analysis. Results Compared with the normal pregnant group， the offspring rats in the FMT pregnant group showed longer eye opening time （Plt;0.05） and lower body weight （Plt;0.05）. Before treatment， compared with the normal group， the model group showed lower sociability （Plt;0.05） and social novelty （Plt;0.05） but higher degree of anxiety （Plt;0.05）. After two weeks of medication， compared with the normal group， the model group showed lower sociability （Plt;0.05）， lower social novelty （Plt;0.05）， higher degree of anxiety （Plt;0.05）， and lower body weight and 5-HT content （Plt;0.05）. Compared with the model group， each treatment group showed higher sociability （Plt;0.05）， higher social novelty （Plt;0.05）， lower degree of anxiety （Plt;0.05）， and higher 5-HT content （Plt;0.05）. The body weight of the medium- and high-dose Guipi Pill groups and the Bifidobacterium group increased （Plt;0.05）. Compared with the high-dose Guipi Pill group， the low-dose Guipi Pill group had lower sociability （Plt;0.05）， lower social novelty （Plt;0.05）， and lower body weight and content 5-HT （Plt;0.05）， meanwhile， the medium-dose Guipi Pill group had lower 5-HT content （Plt;0.05） and the Bifidobacterium group had lower social novelty （Plt;0.05）. Correlation analysis showed that the social preference coefficient and novelty preference coefficient of ASD rats were significantly and positively correlated with 5-HT content （Plt;0.05）. Conclusion Guipi Pill can significantly alleviate ASD-like behavior in FMT offspring rats， and its mechanism may be related to the up-regulation of 5-HT content in the brain.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 autism spectrum disorder; Guipi Pill; 5-hydroxytryptamine; fecal microbiota transplantation; sociability; social novelty

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）是一種復雜的廣泛發育障礙性疾病，其核心癥狀是社會障礙和重復的、異常的感覺運動行為及狹隘興趣[1]。流行病學調查研究顯示，目前，在我國兒童中ASD的患病率逐年升高[2]。自2001年起，ASD已成為我國0～6歲精神障礙兒童致殘的首位原因[3]。男性ASD的患病率更高，男女患病比例接近2∶1或3∶1[4-5]。ASD的發病機制較為復雜，與遺傳[6]、炎癥反應[7]、氧化應激和缺氧損傷[8]、腸道菌群紊亂[9]等多種因素相關。目前，治療ASD的藥物存在不良反應多、停藥易復發等問題[10]。因此，尋求既能改善ASD核心癥狀，且療效持久、不良反應少的藥物具有重要臨床意義。近年研究發現，在雌鼠孕期改變其腸道菌群，其部分子代鼠可出現ASD樣表現，這種造模方法被稱為糞菌移植（fecal microbiota transplantation， FMT）法[11]。

歸脾丸出自《嚴氏濟生方·驚悸怔忡健忘門》，具有益氣補血、健脾養心的功效。汪受傳教授研究發現，用歸脾丸加減可有效改善ASD兒童核心癥狀[12]，且歸脾丸可以改變血清5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）含量[13]。5-HT在中樞神經系統中可以影響學習、記憶、認知等生理功能[14]。雙歧桿菌既可改善ASD患兒癥狀[15]，又可以調節血5-HT含量[16]，在所有腦區中，前額葉皮質與社交、情緒、認知控制、記憶等高級功能關系密切[17]。多個研究發現，ASD患者前額葉結構的改變可能是導致其出現核心癥狀的病理基礎[18-19]。因此，本研究提出歸脾丸可能通過影響前額5-HT含量，從而改善ASD臨床癥狀的假說，并以FMT法建立ASD大鼠模型，以雙歧桿菌為陽性對照藥，通過行為學、分子生物學等方面驗證假說，為ASD的防治提供一定的理論依據。

1 材料

1.1" 動物

SD孕鼠10只，孕期12～14 d，體質量330～400 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。實驗動物質量合格證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心SPF級動物房，相對濕度45%～65%，光照/黑暗循環周期12 h，自由飲水、飲食。本研究已通過湖南中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號：ZYFY20220504-01）。

1.2" 主要藥物和試劑

歸脾丸（湖南九芝堂股份有限公司，國藥批號：Z4302046，批號：2021111177，組成：白術、黨參、黃芪、當歸、甘草、茯苓、遠志、酸棗仁、木香、龍眼肉、大棗，規格：200丸/瓶）；雙歧桿菌四聯活菌片（杭州遠大生物制藥有限公司，國藥批號：S2006010，批號：2021050398，規格：0.5 g×36片）；5-HT試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：FU080 F026876）。ASD兒童糞便（糞便來自湖南中醫藥大學第一附屬醫院兒童康復科的ASD患兒，用于造模）。

菌液制備：加入無菌生理鹽水稀釋糞便，充分攪拌溶液，用篩網過濾，保留上清液，用于灌腸。

1.3" 主要儀器

高速組織研磨儀（上海凈信實業發展有限公司，型號：JXFSTPRP-48）；高速離心機（江蘇科析儀器有限公司，型號：TGL-16）；臺式冷凍離心機、掌上離心機（美國賽洛捷克儀器，型號：CF1524R、S1010E）；雪花制冰機（杭州海康威視數字技術股份有限公司，型號：XHJ-300）；磁力攪拌器（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：MS-150）；精密pH計（上海雷磁傳感器科技有限公司，型號：PHS-3C）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號：Rt-6100）；動物行為學分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號：Tracking MasterV3.0）。

2 方法

2.1" ASD模型建立

造模方法參照QI等的方法[11]，將10只SD孕鼠隨機分為正常孕鼠組（3只）、FMT孕鼠組（7只），適應性喂養孕鼠1 d后，FMT孕鼠組以0.2 mL/100 g的5 g/mL菌液灌腸至孕鼠體內，每2天1次，正常孕鼠組予等體積生理鹽水灌腸，持續至子代鼠出生后21 d。在子代鼠出生第21天時，FMT孕鼠組共產出子代鼠107只，其中雄鼠58只、雌鼠49只；正常孕鼠組產出子代鼠47只，其中雄鼠26只、雌鼠21只。因ASD男性患病率高于女性[20]，故于第21天剔除子代雌鼠，并將子代雄鼠與孕鼠分籠飼養。

參照王劍飛等[21]總結的模型評價方法，分別記錄FMT孕鼠組和正常孕鼠組子代鼠出生后12～16 d睜眼情況以及出生第28天時的體質量，用于評估兩組子代鼠生長發育情況（從FMT孕鼠組隨機選擇3組與正常孕鼠組比較）。在子代鼠出生第28天時，通過三箱社交實驗[22]及曠場實驗[23]測試FMT孕鼠組子代雄鼠的社交能力、社交新穎性及焦慮程度。篩選出造模成功的ASD子代雄鼠（在三箱社交實驗中子代大鼠出現社交障礙和/或社交新穎性障礙，判定為造模成功[22]）32只和正常孕鼠組子代雄鼠22只。

2.2" 分組及給藥

從造模成功的FMT子代ASD大鼠中隨機挑選出30只，隨機分為模型組、歸脾丸低劑量組、歸脾丸中劑量組、歸脾丸高劑量組、雙歧桿菌組，每組6只；從正常孕鼠組中隨機選取6只雄性子代大鼠為正常組。按照人與動物的體表面積計算法[24]，歸脾丸低、中、高劑量分別為0.75、1.5、3 g/kg，雙歧桿菌組予雙歧桿菌0.5 g/kg，將丸劑或片劑溶于1 mL生理鹽水中配制成混懸液灌胃，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，各組大鼠每天給藥1次，連續灌胃14 d，并再次進行行為學檢測，評估療效。

2.3" 行為學檢測

2.3.1" 三箱社交實驗" 本實驗可用于測試動物的社交能力及社交新穎性。三室社交箱大小為60 cm×40 cm×20 cm，通過開口的擋板將其均分為三室（左室、中央室、右室）。左、右室各放置一個直徑為6 cm×6 cm的籠子，用于放置陌生鼠。參考KAIDANOVICH[25]團隊測試方法：用動物行為學分析系統記錄待測鼠在左、右室的活動時間，共分為3個階段，每個階段10 min。第1階段為空籠，讓待測鼠適應環境。第2階段1籠放置陌生鼠1，另1籠空置，檢測子代鼠社交能力，記錄被測鼠嗅探陌生鼠1及嗅探空籠的時間，并計算社交偏好系數=（嗅探陌生鼠1時間-嗅探空籠時間）/（嗅探陌生鼠1時間+嗅探空籠時間）×100%。第3階段兩籠分別放置陌生鼠1、陌生鼠2，檢測子代鼠社交新穎性，記錄待測鼠嗅探陌生鼠1及嗅探陌生鼠2時間，并計算新穎偏好系數=（嗅探陌生鼠1時間-嗅探陌生鼠2時間）/（嗅探陌生鼠1時間+嗅探陌生鼠2時間）×100%。

在第2階段，被測鼠與空籠接觸時間大于與陌生鼠1接觸時間，則認為被測鼠社交能力障礙；在第3階段，被測鼠與陌生鼠1接觸時間大于與陌生鼠2接觸時間，則認為被測鼠社交新穎性障礙。每一階段開始前，都將待測鼠背朝實驗人員放入中央室的正中心。

2.3.2" 曠場實驗" 本實驗用于評估大鼠的焦慮程度。使用攝像頭及自動跟蹤系統，記錄子代大鼠15 min內在礦場箱（大小約50 cm×50 cm×50 cm）中的移動時間，同時用軟件繪制一中心區域（大小約12 cm×12 cm的正方形）。實驗時，將子代大鼠背朝實驗人員放入曠場箱的正中心，讓其自由探索10 min；之后取出待測鼠，用75%乙醇消毒后，再次將待測鼠放入曠場中央，立即打開攝像頭，記錄15 min內子代大鼠在曠場內自由活動數據，其在中心運動時間越少提示其焦慮程度越高。

2.4" ELISA法測定5-HT含量

行為學檢測結束后，處死各組大鼠，留取前額組織，用PBS液沖洗前額，去除殘留血液，并按1∶49的比例加入PBS液，將前額組織在冰上充分研磨，最后將勻漿液體在8 ℃下，以5 000 r/min離心8 min（離心半徑10 cm），取上清液用于檢測。余步驟按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2.5" 統計學分析

采用GraphPad 9.4.0軟件進行數據處理、統計分析和繪圖，計量資料均符合正態分布，以“ｘ±s”表示，兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；若不符合正態分布，則采用非參數檢驗。若兩個變量均符合正態分布則采用積差分析，若一變量符合正態分布，另一變量不符合正態分布，則采用等級相關分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" FMT對兩組孕鼠子代鼠生長發育的影響

FMT孕鼠組子代大鼠的平均睜眼時間晚于正常孕鼠組（P＜0.05）；出生第28天時（記為D28），FMT孕鼠組子代大鼠平均體質量低于正常孕鼠組（P＜0.05）。詳見表1。

3.2" FMT孤獨癥模型鼠行為學鑒定

與正常組比較，模型組在中心區運動時間降低（P＜0.05），社交能力檢測中與陌生鼠1接觸時間降低（P＜0.05）、與空籠接觸時間增加（P＜0.05），社交新穎性檢測中與陌生鼠1接觸時間增加（P＜0.05）、與陌生鼠2接觸時間降低（P＜0.05）。社交能力檢測中，與接觸空籠時間比較，正常組接觸陌生鼠1時間增加（P＜0.05），模型組接觸陌生鼠1時間降低（P＜0.05）。社交新穎性檢測中，與接觸陌生鼠2時間比較，正常組接觸陌生鼠1時間降低（P＜0.05），模型組接觸陌生鼠1時間增加（P＜0.05）。詳見表2、圖1。

3.3" 用藥后各組子代鼠體質量情況

與正常組比較，其余各組體質量降低（P＜0.05）；與模型組比較，雙歧桿菌組，歸脾丸中、高劑量組體質量升高（P＜0.05）；與雙歧桿菌組比較，歸脾丸高劑量組體質量升高（P＜0.05）；與歸脾丸高劑量組比較，歸脾丸低、中劑量組體質量降低（P＜0.05）。詳見表3。

3.4" 用藥后各組大鼠行為學變化

與正常組比較，其余各組在中心區運動時間降低（P＜0.05）；在社交能力檢測中，模型組和歸脾丸各劑量組與空籠接觸時間升高（P＜0.05），其余各組與陌生鼠1接觸時間降低（P＜0.05）；在社交新穎性檢測中，其余各組與陌生鼠2接觸時間降低（P＜0.05），模型組與陌生鼠1接觸時間升高（P＜0.05），歸脾丸低劑量組與陌生鼠1接觸時間降低（P＜0.05）。與模型組比較，用藥組在中心區運動時間增加（P＜0.05）；在社交能力檢測中，用藥組與空籠接觸時間降低（P＜0.05），用藥組與陌生鼠1接觸時間升高（P＜0.05）；在社交新穎性檢測中，用藥組與陌生鼠1接觸時間降低（P＜0.05），用藥組與陌生鼠2接觸時間升高（P＜0.05）。與雙歧桿菌組比較，在社交新穎性檢測中，歸脾丸高劑量組接觸陌生鼠2時間增加（P＜0.05）。與歸脾丸高劑量組比較，在社交能力檢測中，歸脾丸低劑量組與陌生鼠1接觸時間降低（P＜0.05）；在社交新穎性檢測中，歸脾丸低劑量組與陌生鼠2接觸時間降低（P＜0.05）。

在社交能力檢測中，與接觸空籠時間比較，模型組與接觸陌生鼠1時間降低（P＜0.05），其余各組接觸與陌生鼠1時間均升高（P＜0.05）。在社交新穎性檢測中，與接觸陌生鼠2時間比較，模型組接觸陌生鼠1時間升高（P＜0.05），其余各組接觸陌生鼠1時間均降低（P＜0.05）。詳見表4。

3.5" 用藥后各組大鼠前額組織5-HT含量情況

與正常組比較，其余各組前額5-HT含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組前額組織5-HT含量升高（P＜0.05）；與歸脾丸高劑量組比較，歸脾丸低、中劑量組前額組織5-HT含量降低（P＜0.05）。詳見表5。

3.6" 嗅探偏好系數與5-HT含量相關性分析

繪制社交嗅探系數及新穎嗅探系數與5-HT含量之間的散點圖，結果顯示社交嗅探系數及新穎嗅探系數與5-HT有直線相關關系（社交：r=0.676，P＜0.05，新穎：r=0.862，P＜0.05），且5-HT含量越高，其社交嗅探系數及新穎嗅探系數越高。詳見圖2。

4 討論

ASD是一種復雜的腦神經發育障礙性疾病。FMT誘導的ASD模型鼠與人類ASD行為學表現、腸道菌群改變相似，是一種較為新穎的ASD動物模型[11]。腸道通過神經、內分泌、免疫系統和腸道微生物及其代謝物共同參與腸腦雙向交流，這種交流方式被稱為“腸腦軸”，而ASD的發生與“腸腦軸”功能紊亂密切相關[26]，腸道菌群在腸腦軸的信號傳遞中發揮著重要作用。腸道菌群的平衡是脾胃發揮正常生理作用的重要因素[27]。因此，腸道菌群改變可能使子代大鼠脾胃功能減弱。脾為后天之本，后天之精不足，易致腦髓失充，腦髓失養，引起ASD發病[28]。因此，當孕鼠及子代鼠腸道菌群紊亂時，可使“腸腦軸”功能異常[29]，最終使子代大鼠出現ASD樣改變。本實驗結果顯示，FMT孕鼠組子代大鼠生長發育遲緩，同時，部分子代大鼠出現社交障礙、社交新穎性減弱、焦慮加重等情志異常的表現，提示FMT可使子代鼠出現ASD樣改變，同時出現體質量下降、睜眼時間延長等伴隨癥狀。

ASD無中醫病名，根據其臨床表現，可歸屬于中醫學“童昏”“語遲”“清狂”“無慧”“胎弱”“視無情”“目無情”等范疇。中醫學認為，ASD病位在腦，與心、肝、脾、腎密切相關，其基本病機為腦髓不足、腦神失養[30]。腦為元神之府，主精神活動，人的各種精神活動如情志、意識等都是由腦所調控。《靈樞·海論》云“腦為髓之海”，《素問·五藏生成篇》云：“諸髓者，皆屬于腦”，故腦髓滿則腦功能正常。脾為后天之本，為氣血生化之源，是維持后天生命活動的根本；脾主運化，可將飲食水谷化為水谷精微，脾氣虛，則運化功能異常，后天之精不足，易致腦髓失充，腦髓失養。ASD的病因為心脾虧虛、氣機郁滯，而心主血氣，心血虛失于濡養則心神失養；脾氣虛則生津不足，無法營養四肢經絡，加重情志失常、意識紊亂，故治療應以補心安神、益氣健脾、調理臟腑為主要原則[31]。

歸脾丸由白術、茯苓、黃芪、龍眼肉、黨參、酸棗仁、當歸、遠志、木香、甘草、大棗11味藥物組成。黃芪、黨參甘溫，兩藥合用可補氣生血，為君；龍眼肉甘平、當歸甘溫，以補血為主，龍眼肉亦可養血安神，酸棗仁酸甘性平，可養肝血，與遠志合用增強安神定志之功，上4味中藥以養血安神定志為主，為臣；白術可燥濕利水、健脾益氣，茯苓具有健脾寧心之功；佐木香疏通氣機，使全方補而不滯；大棗調和氣血，炙甘草可和中緩急，調和諸藥，為使。本方藥物多歸心、脾經，共奏益氣補血、健脾養心之功。現代研究表明，歸脾丸具有增加免疫、減輕炎性反應、調節中樞神經、改善胃腸功能、調節腸道菌群等藥理作用[32]，還可用于治療兒童ASD[12]等精神相關的疾病，且均有較好的臨床療效。本實驗結果顯示，經歸脾丸治療后，各用藥組大鼠的社交能力、社交新穎性、焦慮狀態及體質量出現不同程度的改善。

5-HT是細胞增殖、分化、遷移、凋亡、突觸形成等神經元發育的關鍵步驟，通過影響神經元和膠質細胞發育而發揮作用[33]。有研究表明，大腦缺乏5-HT的小鼠表現出社交能力下降及高度重復的行為[34]。5-HT是腸道菌群代謝產物之一，作為神經遞質，腦內5-HT的合成、代謝異常時，可能會使細胞增殖、細胞凋亡、突觸生成以及構建神經網絡出現障礙，從而導致大腦整體結構組織異常[35]。本次相關性分析結果提示，前額5-HT的含量與子代大鼠社交嗅探系數及新穎嗅探系數呈現正相關，提示前額5-HT可能參與了子代大鼠核心癥狀的改善。

綜上所述，歸脾丸可顯著改善FMT子代大鼠的ASD樣行為，機制可能是通過歸脾丸調節腸道菌群，提高腦內5-HT含量，以維持神經網絡功能正常實現的。但本實驗尚未對大鼠腸道菌群進行檢測，今后需繼續研究歸脾丸對維持腸道菌群穩定及5-HT系統在保護神經發育中的具體作用。

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