款冬花多糖通過調控miR-4282表達抑制宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲的機制研究

〔摘要〕 目的 探討款冬花多糖通過調控miR-4282表達抑制宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲的機制。方法 體外培養人宮頸癌細胞株HeLa和C-33A并以10、20、40、80、120 mg·L-1的款冬花多糖處理，然后通過CCK-8實驗測定各組細胞存活率并篩選款冬花多糖最佳作用濃度。將HeLa和C-33A細胞隨機分為對照組、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組、陰性對照組、款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組，分組處理后通過RT-PCR檢測各組細胞miR-4282表達；通過CCK-8實驗、EDU實驗、流式細胞實驗分別檢測各組細胞增殖、凋亡；通過劃痕實驗、Transwell實驗檢測各組細胞遷移、侵襲情況；通過Western blot法檢測各組細胞增殖相關蛋白（Cyclin D1）、凋亡相關蛋白[B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（B-cell lymphoma-2 related X protein， Bax）]、上皮-間質轉化相關蛋白[Vimentin、基質金屬蛋白酶2（matrix metallo-proteinases 2， MMP-2）、E-cadherin]表達。結果 與對照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細胞存活率、EDU陽性率、遷移率、遷移數、侵襲數、Cyclin D1與Bcl-2、Vimentin、MMP-2蛋白表達降低（P＜0.05），miR-4282表達、凋亡率、Bax與E-cadherin蛋白表達升高（P＜0.05）；陰性對照組細胞各指標無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細胞存活率、EDU陽性率、遷移率、遷移數、侵襲數、Cyclin D1與Bcl-2、Vimentin、MMP-2蛋白表達升高（P＜0.05），miR-4282表達、凋亡率、Bax與E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.05）。結論 款冬花多糖可通過上調miR-4282表達而抑制宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲并促使其凋亡，最終對其起到明顯抑癌作用。

〔關鍵詞〕 款冬花多糖；miR-4282表達；宮頸癌；增殖；遷移；侵襲

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.009

Mechanism of polysaccharide of Farfarae Flos in inhibiting proliferation， migration， and invasion of cervical cancer cells by regulating miR-4282 expression

YUAN Xiaobo1， XIAO Guixiang1*， TANG Jing1*， LI Lijuan2， LI Yujing1

1. School of Nursing and Medical Technology， Hunan Institute of Traffic Engineering， Hengyang， Hunan 421219， China;

2. Obstetrics Department of the First People's Hospital of Chenzhou， Chenzhou， Hunan 423000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of polysaccharide of Farfarae Flos in inhibiting the proliferation， migration， and invasion of cervical cancer cells by regulating miR-4282 expression. Methods Human cervical cancer cell lines HeLa and C-33A were cultured in vitro and treated with 10， 20， 40， 80， and 120 mg·L-1 of polysaccharide of Farfarae Flos. CCK-8 assay was used to determine the survival rate of each group of cells and screen the optimal concentration of polysaccharide of Farfarae Flos. HeLa and C-33A cells were randomly grouped into control group， fluorouracil （5-FU） group， polysaccharide of Farfarae Flos group， miR-4282 mimics group， negative control group， and polysaccharide of Farfarae Flos+miR-4282 inhibitor group. The miR-4282 expression was examined by RT-PCR; the cell proliferation and apoptosis were deterrmined by CCK-8 assay， EDU assay， and flow cytometry; the cell migration and invasion were checked by scratch and transwell assays; immunoblotting was used to examine the expression of cell proliferation related proteins （Cyclin D1）， apoptosis related proteins （Bax， Bcl-2）， epithelial mesenchymal transition-related proteins [Vimentin， Matrix Metallo-proteinases 2 （MMP2）， E-cadherin]. Results Compared with the control group， the cell survival rate， EDU positivity rate， migration rate， migration number， invasion number， the Cyclin D1 protein expression as well as protein expressions of Bcl-2， Vimentin， and MMP-2 in 5-FU group， polysaccharide of Farfarae Flos group， and miR-4282 mimics group decreased （Plt;0.05）， while the miR-4282 expression， apoptosis rate， and protein expressions of Bax and E-cadherin increased （Plt;0.05）. There was no significant change in various indicators of cells in the negative control group （Pgt;0.05）. Compared with the polysaccharide of Farfarae Flos group， the cell survival rate， EDU positivity rate， migration rate， migration number， invasion number， the Cyclin D1 protein expression as well as protein expressions of Bcl-2， Vimentin， and MMP-2 in the polysaccharide of Farfarae Flos+miR-4282 inhibitor group were higher （Plt;0.05）， while the miR-4282 expression， apoptosis rate， and protein expressions of Bax and E-cadherin were lower （Plt;0.05）. Conclusion The polysaccharide of Farfarae Flos can inhibit the proliferation， migration， invasion， and apoptosis of cervical cancer cells by up-regulating the miR-4282 expression， ultimately playing a significant role in cancer suppression.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 polysaccharide of Farfarae Flos; miR-4282 expression; cervical cancer; proliferation; migration; invasion

宮頸癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，具有早期診斷困難、惡性程度高、預后差等特點，給女性生殖健康和生命安全造成嚴重威脅，已成為導致女性癌癥死亡的重要原因[1-2]。癌癥的發生發展是由多基因參與、多因素影響的多階段過程，miR-4282作為一種具有抑癌活性的微小RNA在其中起到關鍵作用，研究顯示，miR-4282在胰腺癌中低表達并可預測胰腺癌患者不良預后，miR-4282的過表達可顯著降低胰腺癌細胞的遷移能力并抑制其惡性進展[3]。miR-4282低表達的上皮性卵巢癌患者的淋巴轉移和遠處轉移發生率較高，而miR-4282的過表達可削弱上皮性卵巢癌細胞轉移能力[4]。此外miR-4282在乳腺癌組織中表達下調且與其患者癌細胞轉移的發生和臨床分級有關，恢復miR-4282的表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、上皮-間質轉化（epithelial to mesenchymal transition， EMT）、遷移和侵襲并促進其凋亡[5]。因而，miR-4282可作為宮頸癌的潛在治療靶點。款冬花具有抗炎、抗腫瘤、鎮咳祛痰等藥理作用，其提取物對肺癌細胞可起到增殖抑制作用[6-8]，其花蕾提取物中的款冬花多糖可體外抑制肺癌細胞增殖并誘導其凋亡[9]。劉宜峰等[10]研究表明，款冬花多糖可通過上調miR-99a而抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此，推測款冬花多糖可能通過調控miR-4282而對宮頸癌發揮抗癌作用，本文通過體外培養人宮頸癌細胞株HeLa和C-33A，探究款冬花多糖通過調控miR-4282表達抑制宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲的機制。

1 材料與方法

1.1" 細胞株

人宮頸癌細胞株HeLa、C-33A（貨號TCH-C193、TCH-C143），購自上海慧穎生物科技有限公司。

1.2" 主要試劑

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）（貨號LM1066，純度98%，上海聯邁生物工程有限公司）；款冬花多糖（貨號121449，純度≥98%，扶風斯諾特生物科技有限公司）；miR-4282 mimics、inhibitor及其陰性對照（貨號HY- R00961，江蘇賽索飛生物科技有限公司）；一步法RT-PCR檢測試劑盒（貨號FG2210，北京凡知醫學科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（貨號E-CK-A211）、EdU細胞增殖成像檢測試劑盒（貨號E-CK-A378）、增強型CCK-8細胞活力檢測試劑盒（貨號E-CK-A362）、山羊抗兔二抗（批號E-AB-1114），均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔源抗人Cyclin D1、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（B-cell lymphoma-2 related X protein， Bax）、上皮-間質轉化相關蛋白[Vimentin、基質金屬蛋白酶2（matrix metallo-proteinases 2， MMP-2）、E-cadherin]一抗（貨號ab134175、ab32503、ab227639、ab32124、ab9485、ab16700、ab92536）、結晶紫染色液（貨號ab246820）均購自英國Abcam公司。

1.3" 主要儀器

WEF-2008型全自動多功能酶標儀（上海沃爾福實業有限公司）；FACSMelody流式細胞儀（美國BD公司）；LB102生物顯微鏡（廣州市萊特光電技術有限公司）；FluorChem Q蛋白印跡成像和定量分析系統（英國SYGENE公司）；PowerEase Touch 350W觸屏電源、iblot 3 Western Blot轉印系統、XCellSureLock Mini-Cell電泳槽（中國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4" 人宮頸癌細胞株HeLa和C-33A體外培養及款冬花多糖在細胞中最佳作用濃度篩選

快速解凍HeLa、C-33A細胞，用MEM培養液（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗）復蘇培養，傳代2次后以每孔1×104個的密度將HeLa和C-33A細胞分別接種在96孔板中培養，分別以終濃度0（設為對照組）、10、20、40、80、120 mg·L-1的款冬花多糖處理HeLa和C-33A細胞[10]24 h，每組6個復孔并設置不接種細胞的空白對照組，每孔加入10 ？滋L CCK-8試劑孵育90 min后測量各組細胞吸光度（optical density， OD）值，重復操作3遍，根據公式算出各組細胞存活率，細胞存活率=（OD值藥物處理組-OD值空白對照組）/（OD值對照組-OD值空白對照組）×100%。

1.5" HeLa和C-33A細胞分組和處理

HeLa和C-33A細胞傳代2次后以每孔1×105個的密度分別接種在24孔板中，隨機分為對照組、5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組、陰性對照組、款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組。對照組正常培養不做處理，此外其余各組進行分組處理：5-FU組以終濃度20 μg·mL-1的5-FU處理[11]，款冬花多糖組以終濃度80 mg·L-1的款冬花多糖（根據CCK-8實驗得到的半數抑制濃度確定款冬花多糖干預濃度）處理，miR-4282 mimics組以脂質體2000轉染100 nmol·L-1的miR-4282 mimics，陰性對照組以脂質體2000轉染100 nmol·L-1的miR-4282陰性對照，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組以終濃度80 mg·L-1的款冬花多糖+以脂質體2000轉染100 nmol·L-1的miR-4282 inhibitor同時處理，miR-4282 mimics及其陰性對照濃度參考各自說明書設定，轉染方法見脂質體2000說明書，各組細胞均于處理24 h后做后續檢測。

1.6" 指標檢測

1.6.1" RT-PCR實驗檢測各組HeLa和C-33A細胞miR-4282表達水平" 用TRIzol試劑提取處理后的各組細胞總RNA，按照一步法RT-PCR檢測試劑盒操作步驟進行RT-PCR反應，得到的各基因循環閾值采用2-ΔΔCt算法進行分析，并選擇U6作為miR-4282內參基因，重復操作3遍，引物序列見表1。

1.6.2" CCK-8實驗、EDU實驗、流式細胞實驗分別檢測各組細胞增殖、凋亡情況" CCK-8實驗：HeLa和C-33A細胞傳代2次后以1×104個/孔的密度分別接種在96孔板中，按1.5中方法分組處理24 h后進行CCK-8實驗檢測各組細胞存活率，重復操作3遍，實驗方法如1.4中所示。

EDU實驗：HeLa和C-33A細胞傳代2次后以每孔1×105個的密度分別接種在24孔板中，按1.5中方法分組處理24 h，加入EDU試劑處理2.5 h后按EdU細胞增殖成像檢測試劑盒操作步驟進行EDU染色，熒光顯微鏡下拍攝各組圖像，重復操作3遍，用Image J圖像分析軟件對其中EDU陽性細胞數目和細胞總數目進行定量，計算各組細胞EDU陽性率，EDU陽性率=EDU陽性細胞數目/細胞總數目×100%。

流式細胞實驗：取“1.5”項中藥物干預后的各組HeLa和C-33A細胞，經胰酶消化后分別收集，使用PBS洗滌、重懸后測出細胞密度，每組取約1×105個HeLa和C-33A細胞，按Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟進行FITC、PI雙染，用流式細胞儀檢查各組細胞凋亡率，重復操作3遍。

1.6.3" 劃痕實驗、Transwell實驗分別檢測各組細胞遷移、侵襲情況" 取“1.5”項中藥物干預后的各組HeLa和C-33A細胞，經胰酶消化后分別收集，使用PBS洗滌、不含血清的MEM基礎培養基重懸后測出細胞懸浮液中細胞密度，根據測定結果將各組HeLa和C-33A細胞制為1×106個·mL-1的細胞懸液，然后進行遷移與侵襲檢測。

劃痕實驗檢測遷移：每組分別取2×105個HeLa和C-33A細胞（細胞懸液各200 μL）接種在24孔板，等細胞貼壁生長4 h后在每個細胞孔底部劃一條直線，用PBS清洗掉劃痕中的細胞，在生物顯微鏡下拍攝各組圖像，用Image J圖像分析軟件對各組劃痕面積數量進行定量，病記為S1，等細胞生長24 h后再次拍攝其圖像并定量各組劃痕面積數量，記為S2，重復操作3遍，計算各組細胞遷移率，遷移率=（S1-S2）/S1×100%。

Transwell實驗檢測遷移：每組分別取2×105個HeLa和C-33A細胞（細胞懸液各200 μL）接種在24孔Transwell板上室，等細胞貼壁生長4 h后向Transwell板下室加入含10%血清的MEM基礎培養基，培養24 h后以PBS清洗、4%多聚甲醛固定遷移到下室的細胞，以結晶紫染色液染色、PBS清洗后在生物顯微鏡下拍攝各組下室內細胞圖像，重復操作3遍，采用Image J圖像分析軟件對其數量進行定量，即得到各組HeLa和C-33A細胞遷移數。

Transwell實驗檢測侵襲：取24孔Transwell板，使用基質膠對其上室進行包被，分別加入HeLa和C-33A細胞懸液各200 μL，后續操作與遷移檢測相同，重復操作3遍，最終得到各組HeLa和C-33A細胞侵襲數。

1.6.4" Western blot檢測各組細胞增殖、凋亡、EMT相關蛋白表達收集1.5中分組處理后的各組HeLa和C-33A細胞，采用RAPI試劑在4 ℃下裂解后離心，從而提取各組HeLa和C-33A細胞總蛋白，采用BCA法分別測出每組細胞總蛋白濃度，然后在沸水浴內加熱變性各組細胞蛋白，每組取35 ？滋g，各組HeLa和C-33A細胞總蛋白樣本，上樣進行電泳、轉印，于PVDF膜上獲得按分子量大小分離開的各組蛋白，以5%脫脂奶粉溶液進行封閉后剪下GAPDH、Vimentin、MMP-2、Cyclin D1、Bax、E-cadherin及Bcl-2蛋白條帶，分別孵育相對應的兔源抗人一抗，然后孵育HRP偶聯山羊抗兔二抗，進行抗原抗體反應，以化學發光試劑顯色各組蛋白條帶，重復操作3遍，采集其圖像后運用Image pro軟件定量其灰度值，最后以GAPDH作為內參量化各組Vimentin、MMP-2、Cyclin-D1、Bax、E-cadherin及Bcl-2蛋白相對表達。

1.7" 統計學分析

本文數據采用“ｘ±s”描述，并運用Graph Pad Prism 8.0軟件做統計學分析，多組間差異比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較進行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 款冬花多糖對HeLa和C-33A細胞存活率的影響

與0 mg/L款冬花多糖相比，10、20、40、80、120 mg·L-1的款冬花多糖均可降低HeLa和C-33A細胞存活率（P＜0.05），選擇半數抑制濃度附近的80 mg·L-1的款冬花多糖進行后續實驗。詳見圖1。

2.2" 款冬花多糖對HeLa和C-33A細胞miR-4282表達的影響

與對照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細胞miR-4282表達升高（P＜0.05），陰性對照組細胞miR-4282表達無明顯變化（P＞0.05）；與5-FU組相比，款冬花多糖組細胞miR-4282表達無明顯變化（P＞0.05）；與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細胞miR-4282表達降低（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3" 款冬花多糖對HeLa和C-33A細胞增殖、凋亡的影響

與對照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細胞存活率、EDU陽性率降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）；陰性對照組細胞存活率、EDU陽性率、凋亡率無明顯變化（P＞0.05）。與5-FU組相比，款冬花多糖組細胞存活率、EDU陽性率、凋亡率無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細胞存活率、EDU陽性率升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05）。詳見圖3—5。

2.4" 款冬花多糖對HeLa和C-33A細胞遷移與侵襲的影響

與對照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細胞遷移率、遷移數與侵襲數降低（P＜0.05），陰性對照組細胞遷移率、遷移數與侵襲數無明顯變化（P＞0.05）；與5-FU組相比，款冬花多糖組細胞遷移率、遷移數與侵襲數無明顯變化（P＞0.05）；與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細胞遷移率、遷移數與侵襲數升高（P＜0.05）。詳見圖6—9。

2.5" 款冬花多糖對HeLa和C-33A細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05），Bax蛋白表達升高（P＜0.05）；陰性對照組細胞Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。與5-FU組相比，款冬花多糖組細胞Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05），Bax蛋白表達降低（P＜0.05）。詳見圖10、圖11。

2.6" 款冬花多糖對HeLa和C-33A細胞EMT相關蛋白表達的影響

與對照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL蛋白表達降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達升高（P＜0.05）；陰性對照組細胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL、E-cadherin蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。與5-FU組相比，款冬花多糖組細胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL、E-cadherin蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL蛋白表達升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.05）。詳見圖12、圖13。

3 討論

宮頸癌的致病因素包括遺傳、病毒感染和環境等，但其致病機制目前還未得到明確闡釋，如今手術切除、放化療等宮頸癌治療技術在不斷發展和進步，雖然取得了一定成果，但患者生存率仍然較低。因此，積極開發更有效的新型治療方法是提升患者預后的關鍵[12-13]。現代藥理學研究顯示，款冬花具有明顯的抗癌功效，從款冬花中分離出的一種半萜類化合物可有效抑制三陰性乳腺癌細胞增殖和體內生長[7，14]。另外很多研究證實，中藥多糖具有多角度、多機制協同的抗腫瘤作用，還可避免耐藥性的產生，在人類惡性腫瘤治療中具有極大研究價值和開發潛力[15]。CAO等[16]的研究顯示，款冬花多糖能顯著降低結直腸癌細胞的增殖、遷移能力并促進其凋亡。QU等[9]研究顯示，款冬花多糖對肺癌細胞表現出抗增殖和促凋亡的作用，因而預測款冬花多糖可能對宮頸癌起到抑癌功效。本文結果顯示，以款冬花多糖處理人宮頸癌細胞HeLa和C-33A，可降低其細胞存活率、EDU陽性率、遷移率、遷移數、侵襲數、Cyclin-D1與Bcl-2蛋白表達，升高其凋亡率、Bax蛋白表達，表明款冬花多糖可降低宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力并促進其凋亡，作用與陽性對照藥5-FU相似。EMT是癌癥侵襲轉移的必要生理過程，調控EMT標志蛋白Vimentin、MMP-2、E-cadherin表達，可通過調控EMT介導宮頸癌的遷移侵襲[17]，以款冬花多糖處理人宮頸癌細胞HeLa和C-33A，可降低其細胞Vimentin、MMP-2蛋白表達并升高E-cadherin蛋白表達，表明款冬花多糖可通過減輕EMT而抑制宮頸癌遷移侵襲，作用與陽性對照藥5-FU相似，最終揭示款冬花多糖可對宮頸癌發揮顯著抗癌作用。

miR-4282是在癌癥發生發展中起到關鍵調控作用的微小RNA，可成為潛在的抗腫瘤藥物靶點[18]。ZHOU等[19]的研究顯示miR-4282在乳腺癌中表達下調，對其過表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。ZHANG等[20]的研究顯示miR-4282微微一種腫瘤抑制因子在口腔鱗狀細胞癌中表達降低，上調其表達可顯著減輕口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移、EMT并增強其細胞凋亡，由此可知，miR-4282能成為的潛在治療靶點。本文結果顯示，以款冬花多糖處理人宮頸癌細胞HeLa和C-33A，可升高其miR-4282表達，另外以模擬物上調HeLa和C-33A細胞miR-4282表達，可對宮頸癌起到與款冬花多糖相似的抗癌作用，表明miR-4282是宮頸癌的潛在治療靶點，并可參與介導款冬花多糖對宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲的抑制作用。然而，本研究結果表明，抑制miR-4282表達將削弱款冬花多糖對宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲的抑制作用，同時降低款冬花多糖的促凋亡能力，削弱其對宮頸癌細胞凋亡的增強作用，最終逆轉其對宮頸癌的抗癌作用，揭示款冬花多糖抑制宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲是通過上調控miR-4282表達實現的。

綜上所述，款冬花多糖可通過提高miR-4282表達而降低宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，促進其凋亡，最終對宮頸癌發揮顯著抗癌功效，本文為宮頸癌的臨床治療提供了新的候選藥物，并對其臨床治療技術的開發改進起到一定積極意義。

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