骨質疏松癥銅死亡基因的免疫浸潤分析及潛在中藥預測

〔摘要〕 目的 通過分析銅死亡基因在骨質疏松癥（osteoporosis，OP）免疫浸潤中的作用，探索與OP相關的免疫細胞、免疫功能、生物標志物和潛在治療中藥。方法 從GEO數據庫檢索下載OP數據集，對其進行標準化處理和消除批次效應后合并。提取數據集中銅死亡的相關基因后，進行免疫浸潤分析并構建風險模型，對銅死亡基因進行富集分析和中藥預測。結果 （1）對GSE13850、GSE56116、GSE56815、GSE230665數據集合并后篩選出18個銅死亡基因；（2）樹突狀細胞、B細胞、CD8+T細胞等在細胞浸潤中占比較高，免疫細胞功能主要表現為抗原呈遞共抑制、Ⅰ型干擾素反應、Ⅱ型干擾素反應等；（3）與健康對照組相比，巨噬細胞與未成熟樹突狀細胞在OP患者組中呈現高表達，而濾泡輔助性T細胞在健康對照組中顯著表達；（4）SLC31A1等13個銅死亡基因與OP免疫浸潤相關，其中，SLC31A1最有可能是導致OP的風險因子；（5）OP的進展涉及乙酰輔酶A生物合成與代謝等生物過程，與脂肪酸代謝、三羧酸循環等通路相關；（6）共篩選出魚鰾膠等10味重要中藥，四氣多屬溫、平，五味多屬甘，歸腎、脾經，功效多為補氣、健脾、補腎、活血、行氣和止痛。結論 銅死亡基因可能通過干預免疫細胞和功能參與OP的進展。SLC31A1等銅死亡基因可能有助于闡釋OP的發病機制，并成為潛在的生物學標志物及治療靶點，魚鰾膠等中藥可能是防治OP潛在分子藥物的來源。

〔關鍵詞〕 銅死亡；骨質疏松癥；免疫浸潤；單樣本基因集富集分析；中藥預測

〔中圖分類號〕R274.9" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.025

Immune infiltration analysis of cuproptosis-related genes in osteoporosis and prediction of potential Chinese medicines

SONG ShiLei1， CHEN Yueping2*

1. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200， China; 2. Ruikang Hospital of

Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530011， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To analyze the role of cuproptosis-related genes in immune infiltration of osteoporosis （OP）， so as to explore the immune cells， immune function， biomarkers， and potential therapeutic Chinese medicines related to OP. Methods The OP datasets were retrieved and downloaded from the GEO database， and they were standardized and merged after eliminating batch effects. After extracting the relevant cuproptosis-related genes from the datasets， the immune infiltration analysis was carried out and the risk model was constructed to perform enrichment analysis on the cuproptosis-related genes and to predict Chinese medicines with potential therapeutic effects. Results （1） Eighteen cuproptosis-related genes were screened from the merged datasets of GSE13850， GSE56116， GSE56815， and GSE230665; （2） dendritic cells， B cells， CD8+T cells， and other cells accounted for a relatively high proportion in cell infiltration， and immune cell functions mainly manifested as antigen presentation co-suppression， type I interferon response， type II interferon response， and others; （3） compared with the healthy control group， macrophages and immature dendritic cells were highly expressed in the OP group， while follicular helper T cells were significantly expressed in the healthy control group; （4） thirteen cuproptosis-related genes including SLC31A1 were associated with OP immune infiltration， among which SLC31A1 was the most likely risk factor for OP; （5） the progress of OP involved biological processes such as acetyl-CoA biosynthesis and metabolism， which were related to fatty acid metabolism， tricarboxylic acid cycle， and other pathways; （6） a total of ten important Chinese medicines， including fish bladder glue， were screened out. Most of them are warm and neutral in property， sweet in flavour， and access the kidney and spleen meridians. And their effects are mostly supplementing qi， strengthening the spleen， tonifying the kidney， circulating blood， moving qi， and alleviating pain. Conclusion Cuproptosis-related genes may be involved in the progression of OP by intervening with immune cells and functions. Those such as SLC31A1 may help elucidate the pathogenesis of OP and become potential biological markers and therapeutic targets. Moreover， Chinese medicines such as fish bladder glue may be the source of potential molecular drugs for OP prevention and treatment.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 cuproptosis; osteoporosis; immune infiltration; single-sample gene set enrichment analysis; Chinese medicines prediction

骨質疏松癥（osteoporosis， OP）作為一種骨科代謝性疾病，病理改變通常表現為骨密度與骨強度的降低，這極大增加了骨折的發生風險。隨著醫療衛生的不斷改善，人口老齡化日趨加重，OP的患病率逐年升高[1]。目前認為骨代謝紊亂、免疫系統失衡、激素水平改變、遺傳因素等是OP重要的致病因素[2]。隨著對骨免疫的深入研究，研究者發現，B細胞和T細胞等免疫細胞在維持骨骼健康方面發揮重要作用，受T細胞調節的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）被證明可以加速成骨細胞的凋亡；B細胞產生的破骨細胞分化因子可刺激破骨細胞生成，從而加速骨丟失[2]。此外，有研究發現，骨相關炎性疾病如類風濕關節炎、骨關節炎、牙周炎等均存在骨丟失，骨代謝失衡導致的骨丟失與免疫細胞具有一定的關聯[3]。因此，通過對OP的免疫浸潤機制研究，可以發現致病性的免疫細胞和免疫功能，并尋找方法對其進行消除或抑制，對治療OP具有重要意義。

銅在生命過程中是一種不可或缺的元素，它作為酶的輔助因子參與線粒體三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle， TCA）等多種生理途徑。研究發現，銅離子與TCA中的脂酰化成分結合，可導致脂酰化蛋白的異常聚集和鐵-硫簇蛋白的丟失，從而引發蛋白負荷應激，最終導致細胞死亡[4]。同時，銅也參與免疫系統的多種功能，包括調節先天性免疫細胞的激活，影響組織中免疫細胞的分布等[5]。目前，多個研究發現，銅死亡基因對免疫細胞在組織中的表達具有一定影響，比如對正常膀胱組織與膀胱癌組織的免疫浸潤數據分析發現，銅死亡基因的高表達促使T細胞與B細胞等出現高表達[6]；另一項銅死亡基因對克羅恩病的免疫浸潤影響機制研究也得到類似的結果[7]。上述研究說明銅死亡可能與免疫系統的調控和炎癥反應等過程密切相關。目前，銅死亡引起OP的機制研究雖并不完善，但結合銅死亡基因對免疫細胞的影響以及免疫細胞對骨代謝的影響，可得出銅死亡基因可能通過介導免疫細胞從而對骨代謝平衡產生影響。深入了解銅死亡在免疫浸潤中的作用機制，有助于揭示細胞死亡與免疫調節之間的相互關系，為OP的治療提供新的思路。因此，本研究旨在通過生物信息學方法，深入研究銅死亡基因在OP免疫浸潤中的作用。

本研究通過對OP銅死亡基因的篩選，將篩選出的銅死亡基因與免疫細胞及功能之間進行相關分析，同時，分析銅死亡基因與免疫浸潤之間的相關性。此外，通過構建風險預測模型，篩選出關鍵基因并對其進行富集分析和中藥預測。通過解析銅死亡基因的潛在功能和與其相互作用的免疫浸潤網絡，分析中藥治療OP的生物標志物與藥物靶點，為中醫治療OP提供理論依據。

1 資料與方法

1.1" 相關軟件及數據庫信息

本次研究使用的軟件及數據庫的相關信息如下。GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；Perl語言5.38.0；R語言4.3.1；分子特征數據庫（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）；miRBase數據庫（https：//www.mirbase.org/）；miRDB數據庫（http：//mirdb.org/）；miRWalk數據庫（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）；TargetScan數據庫（https：//www.targetscan.org/vert_80/）；spongeScan數據庫（http：//spongescan.rc.ufl.edu）；Coremine Medical數據庫（https：//www.coremine.com/）；Cytoscape軟件3.10.1。

1.2" OP原始數據及銅死亡基因獲取

以“Osteoporosis”“Gene expression”為關鍵詞，以“Expre-ssion profiling by array”“Homo sapiens”“Series”為限定標準，從GEO數據庫下載OP基因表達探針矩陣文件及平臺文件。通過對檢索結果進一步篩選，最后納入4個數據集，包括GSE13850、GSE56116、GSE56815和GSE230665，共包含82例OP患者（OP患者組）與66例健康者（健康對照組），數據集分別由GPL570平臺、GPL4133平臺、GPL570平臺、GPL10332平臺生成。

檢索國內、外文獻相關網站，如中國知網、中國生物醫學文獻數據庫，Embase、PubMed等。以“銅死亡”為中文檢索詞，以“Cuproptosis”為英文檢索詞，同時追蹤納入研究的參考文獻，檢索時限均為建庫至2023年10月30日。

1.3" 數據處理

利用Perl語言對下載的4個數據集進行標準化處理，獲得含有基因名的OP矩陣文件，利用R語言的“limma”包（版本3.2）和“SVA”包（版本3.8）對基因表達水平進行標準化處理，并對合并后的矩陣進行批次校正。根據結果繪制批次校正前和批次校正后的主成分分析（principal components analysis，PCA）圖，同時輸出合并后的基因表達矩陣，對合并輸出后的基因進行銅死亡基因篩選，最終獲得銅死亡基因表達矩陣。

1.4" 免疫細胞和功能的提取與量化

在分子特征數據庫中搜索關鍵詞“Immunity”，下載相關數據文件“gmt”，使用R語言中的“GSVA”數據處理包對4個數據集進行合并處理分析，使用單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）對合并后的基因表達矩陣進行分析。最后，使用R語言的“pheatmap”包繪制熱圖。

1.5" 免疫浸潤的相關性分析

為探索不同免疫細胞間的關聯以及不同免疫功能間的關聯，運用R語言中的“corrplo”數據處理包進行相關性分析，并聯合ssGSEA得出的結果，最終獲得免疫細胞間以及免疫功能間的相關性信息。

1.6" 免疫浸潤的差異性分析

為比較OP患者組和健康對照組中免疫細胞以及免疫功能的差異，將樣本的分組信息與ssGSEA表達矩陣結果進行整合。隨后，運用R語言的“ggpubr”包進行秩和檢驗，并以箱線圖的形式展示結果，以便篩選出在兩組之間存在顯著差異的免疫細胞和免疫功能。

1.7" 銅死亡基因與免疫浸潤及免疫功能的相關性分析

將“1.4”獲得的ssGSEA表達矩陣與篩選出的銅死亡基因進行整合，并運用R語言中的“psych”數據包對兩者進行相關性分析，使用R語言的“ggcorrplot”包對相關系數進行可視化處理，繪制相關性熱圖。最后，篩選出與免疫浸潤結果具有強相關性的銅死亡基因。

1.8" 預測模型的構建與驗證

運用銅死亡關鍵基因表達矩陣中的健康對照組樣本和OP患者組樣本的分組數據構建Logistic回歸風險模型，得到相關風險評分，以風險評分的中位數作為分割點，高于中位數代表高風險，低于中位數代表低風險。再利用R語言的“rms”包，構建風險預測圖。并通過校準曲線和受試者工作曲線（receiver operating characteristic，ROC）進行驗證，評估模型的準確性。

1.9" GO與KEGG富集分析

運用R語言的“clusterProfiler”包對篩選獲得的銅死亡關鍵基因表達矩陣進行基因本體論（gene ontology， GO）與京都基因與基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析，將獲得的結果再利用R語言的“ggplot2”包進行可視化處理。

1.10" 潛在中藥的篩選預測

在Coremine Medical數據庫中逐個檢索關鍵基因和GO富集分析中與免疫浸潤相關的生物過程，包括乙酰輔酶A生物合成與代謝、核苷二磷酸生物合成、巨噬細胞凋亡過程、白細胞凋亡過程、干細胞分化、白細胞遷移和白細胞介素-1（interleukin-1， IL-1）的產生等，篩選“Traditional Chinese Medicine”模塊中的信息，以確定其中具有潛在治療作用的中藥。隨后采用秩和檢驗統計分析，并以Plt;0.01為篩選條件，篩選對各預測靶標具有生物學效應的前10味中藥，對中藥的四氣五味、歸經和功效進行統計分析。

2 結果

2.1" 銅死亡基因檢索結果

通過檢索相關文獻（4篇[3-6]）以及相關數據庫，共獲得19個與銅死亡相關的基因，包括NFE2L2、NLRP3、ATP7B、ATP7A、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、LIPT2、DLD、GLS、CDKN2A、DBT、GCSH、DLST。

2.2" PCA分析和銅死亡基因提取

對4個數據集的基因表達水平進行標準化處理后，去除數據集間的批次效應并進行合并，輸出合并后的數據集。再根據結果繪制批次校正前和批次校正后的PCA圖（圖1A）。在批次校正前的PCA圖中，不同批次之間存在明顯的分離現象。而在批次校正后，批次之間發生重疊，表明批次校正成功地消除了批次效應。再提取該矩陣中的銅死亡基因，共得到18個銅死亡基因組成的表達矩陣（圖1B）。

2.3" 免疫細胞和免疫功能的浸潤情況

本研究共涉及29種免疫細胞和免疫功能的類型，免疫細胞包括活化樹突狀細胞（activated dendritic cells， aDCs）、B細胞、CD8+T細胞等；免疫功能則包括抗原呈遞共抑制、Ⅰ型干擾素反應、Ⅱ型干擾素反應等。使用ssGSEA算法計算合并后的數據集中免疫細胞及免疫功能在各個樣本中的表達水平。詳見圖2。

2.4" 免疫細胞間、免疫功能間的相關性

本研究通過分析OP中免疫細胞間的相關性發現，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）與輔助性T淋巴細胞呈強正相關性（r=0.77）、TIL與CD8+T細胞呈強正相關性（r=0.67）。通過分析OP中免疫功能間的相關性發現，細胞溶解活性與促進炎癥活動呈強正相關性（r=0.78）、T細胞共刺激與免疫細胞檢查點呈強正相關性（r=0.76）。詳見圖3。

2.5" 差異性免疫細胞和免疫功能

對OP患者組與健康對照組進行組間免疫細胞差異分析，Plt;0.05則代表差異具有顯著性。結果顯示，未成熟樹突狀細胞、巨噬細胞在OP患者組中顯著表達（Plt;0.01），而濾泡輔助T細胞在健康對照組中顯著表達（Plt;0.01）。對OP患者組與健康對照組進行組間免疫功能差異分析，Plt;0.05則代表差異具有顯著性。結果顯示，趨化因子受體、組織相容性復合體Ⅰ在OP患者組中顯著表達（Plt;0.01）。詳見圖4。

2.6" 銅死亡基因與免疫浸潤的相關性

對OP銅死亡相關基因與免疫浸潤結果進行相關性分析，見圖5。結果顯示，多個銅死亡基因如SLC31A1、PDHB、PDHA1、NFE2L2等與多個免疫細胞及功能之間存在顯著的相關性。將上述基因作為本次研究的關鍵基因，用于后續的風險預測模型、KEGG和GO富集分析等。

2.7" 預測模型的構建

從構建的風險預測模型中可看出銅死亡基因SLC31A1最有可能是導致OP的風險因子。ROC曲線評估可見AUC值為0.72，大于0.6，說明預測模型的列線圖具有較高的準確性，具有高度的診斷效能。校正曲線顯示，其與理想曲線擬合較好，說明預測模型在預測準確性方面表現出了很高的可信度。詳見圖6。

2.8" GO與KEGG富集分析

對13個關鍵基因進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結果表明，關鍵基因主要富集在乙酰輔酶A生物合成與代謝、核苷二磷酸生物合成、巨噬細胞凋亡過程、白細胞凋亡過程、干細胞分化、白細胞遷移和IL-1的產生等生物過程中；在細胞成分上，主要有線粒體基質、氧化還原酶復合體和TCA酶復合體；分子功能方面，主要在氧化還原酶活性、過渡金屬離子跨膜轉運體活性和酰基轉移酶活性中發揮作用（圖7）。分析結果顯示，在所有生物過程中，巨噬細胞凋亡過程、白細胞凋亡過程、干細胞分化、白細胞遷移和IL-1的產生與免疫浸潤關系密切。KEGG富集分析結果表明，OP的關鍵基因主要在脂肪酸代謝、TCA、2-酮羧酸代謝和丙酮酸代謝中被激活（圖8）。

2.9" 中藥預測結果

通過Coremine Medical數據庫，以Plt;0.01作為篩選標準，對關鍵基因和免疫浸潤相關的生物過程進行中藥預測，共得到156種中藥。為了更好地展示預測結果，將結果導入Cytoscape軟件，創建可視化網絡圖。該網絡中排名前10位的中藥為魚鰾膠、魚腦石、柴胡、姜黃、郁金、靈芝、人參、甘草、黃芪和白術（圖9），表明它們是治療OP的主要藥物。四氣五味、歸經與功效分析結果顯示，藥物四氣多屬溫、平，五味多屬甘，歸經主要集中在腎、脾經，功效多為補氣、健脾、補腎、活血、行氣和止痛（圖10）。

3 討論

OP為一種全身性代謝性疾病，其主要特征在于骨骼系統的不平衡狀態。骨骼系統與免疫系統之間存在緊密的關聯，免疫細胞在調節骨代謝中扮演著重要角色，如B細胞參與骨吸收和骨形成的調節、T細胞則通過調控炎癥反應和細胞信號傳導對骨骼健康產生影響[8-9]。此外，與免疫系統相關的因素也可能在OP的預防和管理中扮演關鍵角色[10]。因此，識別和探討OP免疫相關的分子機制對其治療具有重要意義。

本研究通過分析免疫細胞間和免疫功能間的相關性發現，OP與免疫系統之間存在緊密關聯。我們發現TIL與輔助性T細胞、TIL與CD8+T細胞之間存在強正相關性，表明它們在OP中的協同作用可能有助于維持骨質的穩定性。輔助性T細胞可通過調節TIL的免疫反應，發揮維持骨骼健康的作用，而CD8+T細胞則在清除受損細胞方面發揮關鍵作用[11-12]。對于免疫功能的相關性分析發現，細胞溶解活性與炎癥促進活動之間存在強正相關性，表明免疫系統的活性和免疫調控之間存在密切的互動。細胞溶解活性代表免疫系統清除異常細胞的潛力，而炎癥促進活動則涵蓋了免疫系統引發炎癥的功能。這種正相關性提示，細胞的溶解和炎癥過程可能存在相互促進作用[13]。另外，T細胞共刺激與免疫細胞檢查點也呈強正相關性，表明T細胞的激活和免疫調節之間存在動態平衡。T細胞共刺激代表T細胞相互協作的過程，而免疫細胞檢查點則代表免疫系統中的一種負性調控機制，這種相關性對于維持免疫平衡和骨骼健康至關重要[14]。

通過分析免疫細胞和免疫功能的差異性發現，免疫系統的異常活躍狀態可能是導致OP發生發展的重要原因。在OP患者中，樹突狀細胞、巨噬細胞、趨化因子受體、組織相容性復合體Ⅰ表達顯著增加。其中樹突狀細胞可以通過呈遞抗原和激活T細胞的方式引發免疫反應，然而在OP病理情況下，樹突狀細胞可能異常激活T細胞，誘發T細胞產生炎癥因子，進而導致骨質吸收增加[15]。巨噬細胞在炎癥條件下，會分泌腫瘤壞死因子和IL-1等炎癥介質，進而促進成骨細胞的凋亡和骨吸收[16]。本研究結果發現，趨化因子受體和組織相容性復合體Ⅰ顯著表達，說明OP患者的免疫系統處于高度活躍狀態，可能導致免疫細胞進入骨組織并產生細胞毒性效應。這些細胞會攻擊健康的骨組織并引發骨骼中的細胞凋亡和溶解，導致骨質丟失[17]。在健康對照組中，濾泡輔助T細胞的顯著表達反映了其在維持正常骨骼健康中的重要作用。濾泡輔助T細胞通常參與抗體產生和細胞免疫應答，在淋巴組織中的定位使其能夠調控局部免疫應答并產生抗體，有助于維持骨骼的免疫平衡，確保不會發生過度的骨質吸收或不適當的免疫反應[12]。

為進一步探究銅死亡在OP免疫浸潤方面的機制，運用風險模型篩選出與OP免疫浸潤相關的13個銅死亡基因，包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、NFE2L2、LIPT1等，其中SLC31A1最有可能是導致OP的風險因子。研究發現[18-20]，SLC31A1和ATP7B編碼銅轉運蛋白，有助于維持免疫細胞內的銅平衡，進而維持其抗氧化和免疫功能；在OP中，SLC31A1和ATP7B的異常表達會導致免疫細胞內銅供應不足，降低其抗氧化能力，導致細胞更容易受到氧化應激的損害，并影響免疫細胞的相互作用和信號傳導。PDHB、PDHA1、DLD和DLAT編碼的線粒體脫氫酶在免疫細胞中參與葡萄糖代謝和線粒體呼吸，并提供所需的能量和功能，而免疫細胞在激活狀態下具有高能量需求，因此，異常的葡萄糖代謝和線粒體功能會對免疫細胞的活性和功能產生不利影響，繼而影響骨代謝[3，21]。LIPT1與脂質代謝和細胞膜組成緊密相關，細胞膜的組成對于免疫細胞的功能和信號傳導至關重要，而異常的脂質代謝會導致細胞膜受損、信號傳導異常以及免疫平衡紊亂，進而干擾免疫細胞對骨組織的免疫反應[22]。CDKN2A編碼細胞周期抑制蛋白，對細胞的增殖和生存起調控作用，然而，CDKN2A的過表達會導致免疫細胞的數量減少、功能降低，從而對OP的免疫反應產生影響[23-24]。上述基因都有可靠的證據支持其參與調控銅死亡，但關于NFE2L2、GLS、GCSH、FDX1和DBT調控銅死亡在OP中的作用研究尚未見報道。綜合本研究結果發現，銅和銅死亡相關基因介導免疫細胞的功能、代謝和抗氧化反應，對OP免疫浸潤產生影響，進一步提示銅死亡與OP發病機制密切相關。

中醫學并無OP病名，根據其臨床癥狀及病因病機特點，可將其歸屬于“骨痿”的范疇。目前，臨床上將OP分為腎虛血瘀證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、氣滯血瘀證和脾腎陽虛兼血瘀證[25]。本研究對銅死亡基因進行相應的中藥預測發現，篩選出的藥物藥性主要為溫，藥味主要為平、甘，歸經主要為腎、脾、肺經，功效主要為補腎、健脾、補氣等，這與上述病機相對應，并且有中醫學者[26]認為“以補腎壯骨、益精填髓為主，健脾益氣、和胃助運為輔”是治療OP的主要方法，由此可見本次通過基因篩選出的藥物具有一定的準確性。

目前，尚未見生物信息學結合預測中藥技術與證候實質相關的研究報道。本研究運用生物信息學篩選OP銅死亡基因、預測中藥，將有望為其證候實質研究提供前期理論基礎。

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