歸脾丸對(duì)糞菌移植造模的孤獨(dú)癥譜系障礙大鼠行為學(xué)及腦5-HT含量的影響

〔摘要〕 目的 驗(yàn)證歸脾丸改善孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）子代大鼠核心癥狀的療效，觀察其對(duì)腦5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）含量的影響，并探討其療效與腦5-HT水平的相關(guān)性。方法 將10只SPF級(jí)SD孕鼠隨機(jī)分為正常孕鼠組（3只）和糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）孕鼠組（7只），F(xiàn)MT孕鼠組通過(guò)FMT法進(jìn)行造模。子代鼠出生第28天時(shí)，通過(guò)行為學(xué)檢測(cè)篩選符合ASD疾病模型的雄鼠30只，隨機(jī)分為模型組（等體積生理鹽水）、歸脾丸低劑量組（0.75 g/kg）、歸脾丸中劑量組（1.5 g/kg）、歸脾丸高劑量組（3 g/kg）、雙歧桿菌組（0.5 g/kg），每組6只；正常雄鼠6只，設(shè)置為正常組（等體積生理鹽水）。各組連續(xù)灌胃14 d，1次/d。記錄大鼠體質(zhì)量；采用行為學(xué)檢測(cè)評(píng)估療效；采用ELISA法測(cè)定大鼠前額5-HT含量；等級(jí)相關(guān)分析法分析子代大鼠社交能力及社交新穎性與5-HT的相關(guān)性。結(jié)果 與正常孕鼠組比較，F(xiàn)MT孕鼠組子代鼠睜眼時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）、體質(zhì)量下降（P＜0.05）。用藥前，與正常組比較，模型組社交能力降低（P＜0.05）、社交新穎性降低（P＜0.05）、焦慮程度增加（P＜0.05）。用藥2周后，與正常組比較，模型組社交能力降低（P＜0.05）、社交新穎性降低（P＜0.05）、焦慮程度加重（P＜0.05）、體質(zhì)量及5-HT含量下降（P＜0.05）。與模型組比較，各用藥組社交能力增強(qiáng)（P＜0.05）、社交新穎性增強(qiáng)（P＜0.05）、焦慮狀態(tài)減輕（P＜0.05）、5-HT含量增加（P＜0.05）；歸脾丸中、高劑量組，雙歧桿菌組體質(zhì)量增加（P＜0.05）。與歸脾丸高劑量組比較，歸脾丸低劑量組社交能力降低（P＜0.05）、社交新穎性降低（P＜0.05），體質(zhì)量及5-HT含量下降（P＜0.05），歸脾丸中劑量組5-HT含量下降（P＜0.05），雙歧桿菌組社交新穎性降低（P＜0.05）。相關(guān)新分析顯示，ASD大鼠社交偏好系數(shù)及新穎偏好系數(shù)與5-HT含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 歸脾丸可顯著改善FMT子代大鼠的ASD樣行為，其機(jī)制可能與上調(diào)腦內(nèi)5-HT含量有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 孤獨(dú)癥譜系障礙；歸脾丸；5-羥色胺；糞菌移植法；社交能力；社交新穎性

〔中圖分類號(hào)〕R272" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.002

Effects of Guipi Pill on behavior and brain 5-HT content in rats with autism spectrum disorder modeled by fecal microbiota transplantation

HAO Xingyu1， XIE Ying2， WU Ji1， ZHU Qinquan2， ZHANG Di2， JIANG Ping2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To verify the efficacy of Guipi Pill in alleviating core symptoms in offspring rats with autism spectrum disorder （ASD）， to observe its effects on the content of 5-hydroxytryptamine （5-HT） in the brain， and to explore the correlation between its efficacy and the level of 5-HT in the brain. Methods Ten SPF SD pregnant rats were randomized into normal pregnant group （n=3） and fecal microbiota transplantation （FMT） pregnant group （n=7）. The FMT pregnant group was modeled by FMT method. On the 28th day of birth， 30 male rats were screened by behavioral test to meet the ASD disease model. Then they were randomly subdivided into model group （an equal volume of normal saline）， the low-， medium-， and high-dose （0.75 g/kg， 1.5 g/kg， 3 g/kg） Guipi Pill groups， and the Bifidobacterium （0.5 g/kg） group， with six rats in each group. In addition， six normal male rats were set as normal group （an equal volume of normal saline）. Each group was given intragastric administration for 14 d， once a day. The body weight of rats was recorded， the efficacy was evaluated by behavioral test， the content of 5-HT in the forehead of rats was determined by ELISA， and the correlation between sociability， social novelty and 5-HT in offspring rats was analyzed by rank correlation analysis. Results Compared with the normal pregnant group， the offspring rats in the FMT pregnant group showed longer eye opening time （Plt;0.05） and lower body weight （Plt;0.05）. Before treatment， compared with the normal group， the model group showed lower sociability （Plt;0.05） and social novelty （Plt;0.05） but higher degree of anxiety （Plt;0.05）. After two weeks of medication， compared with the normal group， the model group showed lower sociability （Plt;0.05）， lower social novelty （Plt;0.05）， higher degree of anxiety （Plt;0.05）， and lower body weight and 5-HT content （Plt;0.05）. Compared with the model group， each treatment group showed higher sociability （Plt;0.05）， higher social novelty （Plt;0.05）， lower degree of anxiety （Plt;0.05）， and higher 5-HT content （Plt;0.05）. The body weight of the medium- and high-dose Guipi Pill groups and the Bifidobacterium group increased （Plt;0.05）. Compared with the high-dose Guipi Pill group， the low-dose Guipi Pill group had lower sociability （Plt;0.05）， lower social novelty （Plt;0.05）， and lower body weight and content 5-HT （Plt;0.05）， meanwhile， the medium-dose Guipi Pill group had lower 5-HT content （Plt;0.05） and the Bifidobacterium group had lower social novelty （Plt;0.05）. Correlation analysis showed that the social preference coefficient and novelty preference coefficient of ASD rats were significantly and positively correlated with 5-HT content （Plt;0.05）. Conclusion Guipi Pill can significantly alleviate ASD-like behavior in FMT offspring rats， and its mechanism may be related to the up-regulation of 5-HT content in the brain.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 autism spectrum disorder; Guipi Pill; 5-hydroxytryptamine; fecal microbiota transplantation; sociability; social novelty

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）是一種復(fù)雜的廣泛發(fā)育障礙性疾病，其核心癥狀是社會(huì)障礙和重復(fù)的、異常的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)行為及狹隘興趣[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，目前，在我國(guó)兒童中ASD的患病率逐年升高[2]。自2001年起，ASD已成為我國(guó)0～6歲精神障礙兒童致殘的首位原因[3]。男性ASD的患病率更高，男女患病比例接近2∶1或3∶1[4-5]。ASD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與遺傳[6]、炎癥反應(yīng)[7]、氧化應(yīng)激和缺氧損傷[8]、腸道菌群紊亂[9]等多種因素相關(guān)。目前，治療ASD的藥物存在不良反應(yīng)多、停藥易復(fù)發(fā)等問(wèn)題[10]。因此，尋求既能改善ASD核心癥狀，且療效持久、不良反應(yīng)少的藥物具有重要臨床意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，在雌鼠孕期改變其腸道菌群，其部分子代鼠可出現(xiàn)ASD樣表現(xiàn)，這種造模方法被稱為糞菌移植（fecal microbiota transplantation， FMT）法[11]。

歸脾丸出自《嚴(yán)氏濟(jì)生方·驚悸怔忡健忘門》，具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心的功效。汪受傳教授研究發(fā)現(xiàn)，用歸脾丸加減可有效改善ASD兒童核心癥狀[12]，且歸脾丸可以改變血清5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）含量[13]。5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以影響學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知等生理功能[14]。雙歧桿菌既可改善ASD患兒癥狀[15]，又可以調(diào)節(jié)血5-HT含量[16]，在所有腦區(qū)中，前額葉皮質(zhì)與社交、情緒、認(rèn)知控制、記憶等高級(jí)功能關(guān)系密切[17]。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，ASD患者前額葉結(jié)構(gòu)的改變可能是導(dǎo)致其出現(xiàn)核心癥狀的病理基礎(chǔ)[18-19]。因此，本研究提出歸脾丸可能通過(guò)影響前額5-HT含量，從而改善ASD臨床癥狀的假說(shuō)，并以FMT法建立ASD大鼠模型，以雙歧桿菌為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)行為學(xué)、分子生物學(xué)等方面驗(yàn)證假說(shuō)，為ASD的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1" 動(dòng)物

SD孕鼠10只，孕期12～14 d，體質(zhì)量330～400 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，相對(duì)濕度45%～65%，光照/黑暗循環(huán)周期12 h，自由飲水、飲食。本研究已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：ZYFY20220504-01）。

1.2" 主要藥物和試劑

歸脾丸（湖南九芝堂股份有限公司，國(guó)藥批號(hào)：Z4302046，批號(hào)：2021111177，組成：白術(shù)、黨參、黃芪、當(dāng)歸、甘草、茯苓、遠(yuǎn)志、酸棗仁、木香、龍眼肉、大棗，規(guī)格：200丸/瓶）；雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司，國(guó)藥批號(hào)：S2006010，批號(hào)：2021050398，規(guī)格：0.5 g×36片）；5-HT試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：FU080 F026876）。ASD兒童糞便（糞便來(lái)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童康復(fù)科的ASD患兒，用于造模）。

菌液制備：加入無(wú)菌生理鹽水稀釋糞便，充分?jǐn)嚢枞芤海煤Y網(wǎng)過(guò)濾，保留上清液，用于灌腸。

1.3" 主要儀器

高速組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號(hào)：JXFSTPRP-48）；高速離心機(jī)（江蘇科析儀器有限公司，型號(hào)：TGL-16）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)、掌上離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克儀器，型號(hào)：CF1524R、S1010E）；雪花制冰機(jī)（杭州海康威視數(shù)字技術(shù)股份有限公司，型號(hào)：XHJ-300）；磁力攪拌器（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)：MS-150）；精密pH計(jì)（上海雷磁傳感器科技有限公司，型號(hào)：PHS-3C）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號(hào)：Rt-6100）；動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)：Tracking MasterV3.0）。

2 方法

2.1" ASD模型建立

造模方法參照QI等的方法[11]，將10只SD孕鼠隨機(jī)分為正常孕鼠組（3只）、FMT孕鼠組（7只），適應(yīng)性喂養(yǎng)孕鼠1 d后，F(xiàn)MT孕鼠組以0.2 mL/100 g的5 g/mL菌液灌腸至孕鼠體內(nèi)，每2天1次，正常孕鼠組予等體積生理鹽水灌腸，持續(xù)至子代鼠出生后21 d。在子代鼠出生第21天時(shí)，F(xiàn)MT孕鼠組共產(chǎn)出子代鼠107只，其中雄鼠58只、雌鼠49只；正常孕鼠組產(chǎn)出子代鼠47只，其中雄鼠26只、雌鼠21只。因ASD男性患病率高于女性[20]，故于第21天剔除子代雌鼠，并將子代雄鼠與孕鼠分籠飼養(yǎng)。

參照王劍飛等[21]總結(jié)的模型評(píng)價(jià)方法，分別記錄FMT孕鼠組和正常孕鼠組子代鼠出生后12～16 d睜眼情況以及出生第28天時(shí)的體質(zhì)量，用于評(píng)估兩組子代鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況（從FMT孕鼠組隨機(jī)選擇3組與正常孕鼠組比較）。在子代鼠出生第28天時(shí)，通過(guò)三箱社交實(shí)驗(yàn)[22]及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[23]測(cè)試FMT孕鼠組子代雄鼠的社交能力、社交新穎性及焦慮程度。篩選出造模成功的ASD子代雄鼠（在三箱社交實(shí)驗(yàn)中子代大鼠出現(xiàn)社交障礙和/或社交新穎性障礙，判定為造模成功[22]）32只和正常孕鼠組子代雄鼠22只。

2.2" 分組及給藥

從造模成功的FMT子代ASD大鼠中隨機(jī)挑選出30只，隨機(jī)分為模型組、歸脾丸低劑量組、歸脾丸中劑量組、歸脾丸高劑量組、雙歧桿菌組，每組6只；從正常孕鼠組中隨機(jī)選取6只雄性子代大鼠為正常組。按照人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算法[24]，歸脾丸低、中、高劑量分別為0.75、1.5、3 g/kg，雙歧桿菌組予雙歧桿菌0.5 g/kg，將丸劑或片劑溶于1 mL生理鹽水中配制成混懸液灌胃，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，各組大鼠每天給藥1次，連續(xù)灌胃14 d，并再次進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，評(píng)估療效。

2.3" 行為學(xué)檢測(cè)

2.3.1" 三箱社交實(shí)驗(yàn)" 本實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)試動(dòng)物的社交能力及社交新穎性。三室社交箱大小為60 cm×40 cm×20 cm，通過(guò)開(kāi)口的擋板將其均分為三室（左室、中央室、右室）。左、右室各放置一個(gè)直徑為6 cm×6 cm的籠子，用于放置陌生鼠。參考KAIDANOVICH[25]團(tuán)隊(duì)測(cè)試方法：用動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)記錄待測(cè)鼠在左、右室的活動(dòng)時(shí)間，共分為3個(gè)階段，每個(gè)階段10 min。第1階段為空籠，讓待測(cè)鼠適應(yīng)環(huán)境。第2階段1籠放置陌生鼠1，另1籠空置，檢測(cè)子代鼠社交能力，記錄被測(cè)鼠嗅探陌生鼠1及嗅探空籠的時(shí)間，并計(jì)算社交偏好系數(shù)=（嗅探陌生鼠1時(shí)間-嗅探空籠時(shí)間）/（嗅探陌生鼠1時(shí)間+嗅探空籠時(shí)間）×100%。第3階段兩籠分別放置陌生鼠1、陌生鼠2，檢測(cè)子代鼠社交新穎性，記錄待測(cè)鼠嗅探陌生鼠1及嗅探陌生鼠2時(shí)間，并計(jì)算新穎偏好系數(shù)=（嗅探陌生鼠1時(shí)間-嗅探陌生鼠2時(shí)間）/（嗅探陌生鼠1時(shí)間+嗅探陌生鼠2時(shí)間）×100%。

在第2階段，被測(cè)鼠與空籠接觸時(shí)間大于與陌生鼠1接觸時(shí)間，則認(rèn)為被測(cè)鼠社交能力障礙；在第3階段，被測(cè)鼠與陌生鼠1接觸時(shí)間大于與陌生鼠2接觸時(shí)間，則認(rèn)為被測(cè)鼠社交新穎性障礙。每一階段開(kāi)始前，都將待測(cè)鼠背朝實(shí)驗(yàn)人員放入中央室的正中心。

2.3.2" 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)" 本實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估大鼠的焦慮程度。使用攝像頭及自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)，記錄子代大鼠15 min內(nèi)在礦場(chǎng)箱（大小約50 cm×50 cm×50 cm）中的移動(dòng)時(shí)間，同時(shí)用軟件繪制一中心區(qū)域（大小約12 cm×12 cm的正方形）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將子代大鼠背朝實(shí)驗(yàn)人員放入曠場(chǎng)箱的正中心，讓其自由探索10 min；之后取出待測(cè)鼠，用75%乙醇消毒后，再次將待測(cè)鼠放入曠場(chǎng)中央，立即打開(kāi)攝像頭，記錄15 min內(nèi)子代大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)自由活動(dòng)數(shù)據(jù)，其在中心運(yùn)動(dòng)時(shí)間越少提示其焦慮程度越高。

2.4" ELISA法測(cè)定5-HT含量

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，處死各組大鼠，留取前額組織，用PBS液沖洗前額，去除殘留血液，并按1∶49的比例加入PBS液，將前額組織在冰上充分研磨，最后將勻漿液體在8 ℃下，以5 000 r/min離心8 min（離心半徑10 cm），取上清液用于檢測(cè)。余步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.5" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad 9.4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以“ｘ±s”表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。若兩個(gè)變量均符合正態(tài)分布則采用積差分析，若一變量符合正態(tài)分布，另一變量不符合正態(tài)分布，則采用等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" FMT對(duì)兩組孕鼠子代鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

FMT孕鼠組子代大鼠的平均睜眼時(shí)間晚于正常孕鼠組（P＜0.05）；出生第28天時(shí)（記為D28），F(xiàn)MT孕鼠組子代大鼠平均體質(zhì)量低于正常孕鼠組（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

3.2" FMT孤獨(dú)癥模型鼠行為學(xué)鑒定

與正常組比較，模型組在中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低（P＜0.05），社交能力檢測(cè)中與陌生鼠1接觸時(shí)間降低（P＜0.05）、與空籠接觸時(shí)間增加（P＜0.05），社交新穎性檢測(cè)中與陌生鼠1接觸時(shí)間增加（P＜0.05）、與陌生鼠2接觸時(shí)間降低（P＜0.05）。社交能力檢測(cè)中，與接觸空籠時(shí)間比較，正常組接觸陌生鼠1時(shí)間增加（P＜0.05），模型組接觸陌生鼠1時(shí)間降低（P＜0.05）。社交新穎性檢測(cè)中，與接觸陌生鼠2時(shí)間比較，正常組接觸陌生鼠1時(shí)間降低（P＜0.05），模型組接觸陌生鼠1時(shí)間增加（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2、圖1。

3.3" 用藥后各組子代鼠體質(zhì)量情況

與正常組比較，其余各組體質(zhì)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，雙歧桿菌組，歸脾丸中、高劑量組體質(zhì)量升高（P＜0.05）；與雙歧桿菌組比較，歸脾丸高劑量組體質(zhì)量升高（P＜0.05）；與歸脾丸高劑量組比較，歸脾丸低、中劑量組體質(zhì)量降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

3.4" 用藥后各組大鼠行為學(xué)變化

與正常組比較，其余各組在中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低（P＜0.05）；在社交能力檢測(cè)中，模型組和歸脾丸各劑量組與空籠接觸時(shí)間升高（P＜0.05），其余各組與陌生鼠1接觸時(shí)間降低（P＜0.05）；在社交新穎性檢測(cè)中，其余各組與陌生鼠2接觸時(shí)間降低（P＜0.05），模型組與陌生鼠1接觸時(shí)間升高（P＜0.05），歸脾丸低劑量組與陌生鼠1接觸時(shí)間降低（P＜0.05）。與模型組比較，用藥組在中心區(qū)運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加（P＜0.05）；在社交能力檢測(cè)中，用藥組與空籠接觸時(shí)間降低（P＜0.05），用藥組與陌生鼠1接觸時(shí)間升高（P＜0.05）；在社交新穎性檢測(cè)中，用藥組與陌生鼠1接觸時(shí)間降低（P＜0.05），用藥組與陌生鼠2接觸時(shí)間升高（P＜0.05）。與雙歧桿菌組比較，在社交新穎性檢測(cè)中，歸脾丸高劑量組接觸陌生鼠2時(shí)間增加（P＜0.05）。與歸脾丸高劑量組比較，在社交能力檢測(cè)中，歸脾丸低劑量組與陌生鼠1接觸時(shí)間降低（P＜0.05）；在社交新穎性檢測(cè)中，歸脾丸低劑量組與陌生鼠2接觸時(shí)間降低（P＜0.05）。

在社交能力檢測(cè)中，與接觸空籠時(shí)間比較，模型組與接觸陌生鼠1時(shí)間降低（P＜0.05），其余各組接觸與陌生鼠1時(shí)間均升高（P＜0.05）。在社交新穎性檢測(cè)中，與接觸陌生鼠2時(shí)間比較，模型組接觸陌生鼠1時(shí)間升高（P＜0.05），其余各組接觸陌生鼠1時(shí)間均降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

3.5" 用藥后各組大鼠前額組織5-HT含量情況

與正常組比較，其余各組前額5-HT含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組前額組織5-HT含量升高（P＜0.05）；與歸脾丸高劑量組比較，歸脾丸低、中劑量組前額組織5-HT含量降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表5。

3.6" 嗅探偏好系數(shù)與5-HT含量相關(guān)性分析

繪制社交嗅探系數(shù)及新穎嗅探系數(shù)與5-HT含量之間的散點(diǎn)圖，結(jié)果顯示社交嗅探系數(shù)及新穎嗅探系數(shù)與5-HT有直線相關(guān)關(guān)系（社交：r=0.676，P＜0.05，新穎：r=0.862，P＜0.05），且5-HT含量越高，其社交嗅探系數(shù)及新穎嗅探系數(shù)越高。詳見(jiàn)圖2。

4 討論

ASD是一種復(fù)雜的腦神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。FMT誘導(dǎo)的ASD模型鼠與人類ASD行為學(xué)表現(xiàn)、腸道菌群改變相似，是一種較為新穎的ASD動(dòng)物模型[11]。腸道通過(guò)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)和腸道微生物及其代謝物共同參與腸腦雙向交流，這種交流方式被稱為“腸腦軸”，而ASD的發(fā)生與“腸腦軸”功能紊亂密切相關(guān)[26]，腸道菌群在腸腦軸的信號(hào)傳遞中發(fā)揮著重要作用。腸道菌群的平衡是脾胃發(fā)揮正常生理作用的重要因素[27]。因此，腸道菌群改變可能使子代大鼠脾胃功能減弱。脾為后天之本，后天之精不足，易致腦髓失充，腦髓失養(yǎng)，引起ASD發(fā)病[28]。因此，當(dāng)孕鼠及子代鼠腸道菌群紊亂時(shí)，可使“腸腦軸”功能異常[29]，最終使子代大鼠出現(xiàn)ASD樣改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)MT孕鼠組子代大鼠生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，同時(shí)，部分子代大鼠出現(xiàn)社交障礙、社交新穎性減弱、焦慮加重等情志異常的表現(xiàn)，提示FMT可使子代鼠出現(xiàn)ASD樣改變，同時(shí)出現(xiàn)體質(zhì)量下降、睜眼時(shí)間延長(zhǎng)等伴隨癥狀。

ASD無(wú)中醫(yī)病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“童昏”“語(yǔ)遲”“清狂”“無(wú)慧”“胎弱”“視無(wú)情”“目無(wú)情”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ASD病位在腦，與心、肝、脾、腎密切相關(guān)，其基本病機(jī)為腦髓不足、腦神失養(yǎng)[30]。腦為元神之府，主精神活動(dòng)，人的各種精神活動(dòng)如情志、意識(shí)等都是由腦所調(diào)控。《靈樞·海論》云“腦為髓之海”，《素問(wèn)·五藏生成篇》云：“諸髓者，皆屬于腦”，故腦髓滿則腦功能正常。脾為后天之本，為氣血生化之源，是維持后天生命活動(dòng)的根本；脾主運(yùn)化，可將飲食水谷化為水谷精微，脾氣虛，則運(yùn)化功能異常，后天之精不足，易致腦髓失充，腦髓失養(yǎng)。ASD的病因?yàn)樾钠⑻澨摗鈾C(jī)郁滯，而心主血?dú)猓难撌в阱︷B(yǎng)則心神失養(yǎng)；脾氣虛則生津不足，無(wú)法營(yíng)養(yǎng)四肢經(jīng)絡(luò)，加重情志失常、意識(shí)紊亂，故治療應(yīng)以補(bǔ)心安神、益氣健脾、調(diào)理臟腑為主要原則[31]。

歸脾丸由白術(shù)、茯苓、黃芪、龍眼肉、黨參、酸棗仁、當(dāng)歸、遠(yuǎn)志、木香、甘草、大棗11味藥物組成。黃芪、黨參甘溫，兩藥合用可補(bǔ)氣生血，為君；龍眼肉甘平、當(dāng)歸甘溫，以補(bǔ)血為主，龍眼肉亦可養(yǎng)血安神，酸棗仁酸甘性平，可養(yǎng)肝血，與遠(yuǎn)志合用增強(qiáng)安神定志之功，上4味中藥以養(yǎng)血安神定志為主，為臣；白術(shù)可燥濕利水、健脾益氣，茯苓具有健脾寧心之功；佐木香疏通氣機(jī)，使全方補(bǔ)而不滯；大棗調(diào)和氣血，炙甘草可和中緩急，調(diào)和諸藥，為使。本方藥物多歸心、脾經(jīng)，共奏益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心之功。現(xiàn)代研究表明，歸脾丸具有增加免疫、減輕炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、改善胃腸功能、調(diào)節(jié)腸道菌群等藥理作用[32]，還可用于治療兒童ASD[12]等精神相關(guān)的疾病，且均有較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)歸脾丸治療后，各用藥組大鼠的社交能力、社交新穎性、焦慮狀態(tài)及體質(zhì)量出現(xiàn)不同程度的改善。

5-HT是細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、突觸形成等神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵步驟，通過(guò)影響神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育而發(fā)揮作用[33]。有研究表明，大腦缺乏5-HT的小鼠表現(xiàn)出社交能力下降及高度重復(fù)的行為[34]。5-HT是腸道菌群代謝產(chǎn)物之一，作為神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)5-HT的合成、代謝異常時(shí)，可能會(huì)使細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、突觸生成以及構(gòu)建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)障礙，從而導(dǎo)致大腦整體結(jié)構(gòu)組織異常[35]。本次相關(guān)性分析結(jié)果提示，前額5-HT的含量與子代大鼠社交嗅探系數(shù)及新穎嗅探系數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，提示前額5-HT可能參與了子代大鼠核心癥狀的改善。

綜上所述，歸脾丸可顯著改善FMT子代大鼠的ASD樣行為，機(jī)制可能是通過(guò)歸脾丸調(diào)節(jié)腸道菌群，提高腦內(nèi)5-HT含量，以維持神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能正常實(shí)現(xiàn)的。但本實(shí)驗(yàn)尚未對(duì)大鼠腸道菌群進(jìn)行檢測(cè)，今后需繼續(xù)研究歸脾丸對(duì)維持腸道菌群穩(wěn)定及5-HT系統(tǒng)在保護(hù)神經(jīng)發(fā)育中的具體作用。

參考文獻(xiàn)

[1] LORD C， ELSABBAGH M， BAIRD G， et al. Autism spectrum disorder[J]. Lancet， 2018， 392（10146）： 508-520.

[2] 劉" 賢， 林穗方， 陳文雄， 等. 中國(guó)兒童孤獨(dú)癥譜系障礙患病率Meta分析[J]. 中國(guó)兒童保健雜志， 2018， 26（4）： 402-406， 429.

[3] 徐" 秀. 孤獨(dú)癥譜系障礙[J]. 臨床兒科雜志， 2013， 31（11）： 1099-1100.

[4] 趙亞楠， 李智文， 李" 琳， 等. 中國(guó)0～6歲兒童孤獨(dú)癥譜系障礙篩查患病現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)生育健康雜志， 2023， 34（5）： 423-428.

[5] GREEN R M， TRAVERS A M， HOWE Y， et al. Women and autism spectrum disorder： Diagnosis and implications for treatment of adolescents and adults[J]. Current Psychiatry Reports， 2019， 21（4）： 22.

[6] 賀文香， 周豪欽， 陳曉麗. 孤獨(dú)癥譜系障礙遺傳檢測(cè)意義及方法選擇專家建議[J]. 中國(guó)實(shí)用兒科雜志， 2022， 37（11）： 801-803， 832.

[7] THAWLEY A J， VENEZIANI L P， RABELO-DA-PONTE F D， et al. Aberrant IL-17 levels in rodent models of autism spectrum disorder： A systematic review[J]. Frontiers in Immunology， 2022， 13： 874064.

[8] WANG W Y， TANG J H， ZHONG M， et al. HIF-1 α may play a role in late pregnancy hypoxia-induced autism-like behaviors in offspring rats[J]. Behavioural Brain Research， 2021， 411： 113373.

[9] 馬" 燁， 譚李紅. 腸道菌群對(duì)兒童神經(jīng)發(fā)育的影響研究進(jìn)展[J]. 兒科藥學(xué)雜志， 2023， 29（5）： 60-64.

[10] LAMY M， PEDAPATI E V， DOMINICK K L， et al. Recent advances in the pharmacological management of behavioral disturbances associated with autism spectrum disorder in children and adolescents[J]. Paediatric Drugs， 2020， 22（5）： 473-483.

[11] QI Z Y， LYU M K， YANG L P， et al. A novel and reliable rat model of autism[J]. Frontiers in Psychiatry， 2021， 12： 549810.

[12] 孟" 欣， 張曉敏， 韓" 雪， 等. 汪受傳教授治療兒童孤獨(dú)癥臨證經(jīng)驗(yàn)[J]. 中醫(yī)兒科雜志， 2021， 17（5）： 10-13.

[13] 朱吉鵬， 林紅軍， 郭蛟鳳. 歸脾湯聯(lián)合推拿對(duì)中老年心脾兩虛型原發(fā)性失眠患者IL-2、IL-6、5-HT及睡眠質(zhì)量的影響[J]. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與健康研究電子雜志， 2020， 4（12）： 58-60.

[14] TORTORA F， HADIPOUR A L， BATTAGLIA S， et al. The role of serotonin in fear learning and memory： A systematic review of human studies[J]. Brain Sciences， 2023， 13（8）： 1197.

[15] ABUAISH S， AL-OTAIBI N M， AABED K， et al. The efficacy of fecal transplantation and Bifidobacterium supplementation in ameliorating propionic acid-induced behavioral and biochemical autistic features in juvenile male rats[J]. Journal of Molecular Neuroscience， 2022， 72（2）： 372-381.

[16] 唐進(jìn)松， 宋彥麗， 鄭" 潔， 等. 奧曲肽聯(lián)合雙歧桿菌三聯(lián)活菌腸溶膠囊對(duì)老年腦卒中合并消化道出血及血清5-HT、SPY水平的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志， 2023， 43（24）： 5927-5929.

[17] FRIEDMAN N P， ROBBINS T W. The role of prefrontal cortex in cognitive control and executive function[J]. Neuropsychopharmacology， 2022， 47： 72-89.

[18] LI Y， MA S， ZHANG X， et al. ASD and ADHD： Divergent activating patterns of prefrontal cortex in executive function tasks？[J]. Journal of Psychiatric Research， 2024， 172： 187-196.

[19] SATO M， NAKAI N， FUJIMA S， et al. Social circuits and their dysfunction in autism spectrum disorder[J]. Molecular Psychiatry， 2023， 28（8）： 3194-3206.

[20] HUANG Y H， ARNOLD S R， FOLEY K R， et al. Diagnosis of autism in adulthood： A scoping review[J]. Autism， 2020， 24（6）： 1311-1327.

[21] 王劍飛， 韓俊海， 張子超. 孤獨(dú)癥譜系障礙小鼠模型行為學(xué)檢測(cè)方法[J]. 遺傳， 2021， 43（5）： 501-519.

[22] TAKUMI T， TAMADA K， HATANAKA F， et al. Behavioral neuroscience of autism[J]. Neuroscience and Biobehavioral Reviews， 2020， 110： 60-76.

[23] STEIMER T. Animal models of anxiety disorders in rats and mice： Some conceptual issues[J]. Dialogues in Clinical Neuroscience， 2011， 13（4）： 495-506.

[24] 徐叔云， 卞如濂. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3版. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2005： 62.

[25] KAIDANOVICH-BEILIN O， LIPINA T， VUKOBRADOVIC I， et al. Assessment of social interaction behaviors[J]. Journal of Visualized Experiments， 2011（48）： 2473.

[26] 韋金盈， 方曉慧， 陳嘉怡， 等. 微生物—腸—腦軸機(jī)制與孤獨(dú)癥譜系障礙[J]. 臨床與病理雜志， 2023， 43（2）： 400-407.

[27] 聶玉婷， 高" 利. 基于腸道菌群失調(diào)探討腦系疾病從脾胃論治[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2019， 39（11）： 1390-1394.

[28] 周義山， 劉玲佳， 丁一蕓， 等. 王俊宏從脾論治孤獨(dú)癥譜系障礙經(jīng)驗(yàn)[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào)， 2019， 34（10）： 2134-2137.

[29] 卜婉萍， 林" 棟. 從腸道菌群-腸-腦軸調(diào)控角度探討針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴治療孤獨(dú)癥譜系障礙機(jī)制[J]. 福建中醫(yī)藥， 2024， 55（1）： 32-34.

[30] 唐艷鵬， 王曉聰， 張莎莎， 等. 王素梅教授從脾腎不足論治小兒自閉癥經(jīng)驗(yàn)[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2021， 30（23）： 2572-2575.

[31] 王" 雷， 丁玉蓉， 汪受傳. 汪受傳辨治孤獨(dú)癥心脾兩虛證的經(jīng)驗(yàn)[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2018， 33（8）： 3393-3395.

[32] 葉曉濱. 歸脾丸的藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 光明中醫(yī)， 2021， 36（3）： 493-496.

[33] FABBRI E， BALBI T， CANESI L. Neuroendocrine functions of monoamines in invertebrates： Focus on bivalve molluscs[J]. Mol？鄄ecular and Cellular Endocrinology， 2024， 588： 112215.

[34] KANE M J， ANGOA-PER？魪Z M， BRIGGS D I， et al. Mice genetically depleted of brain serotonin display social impairments， communication deficits and repetitive behaviors： Possible relevance to autism[J]. PLoS One， 2012， 7（11）： e48975.

[35] CHEUNG A， KONNO K， IMAMURA Y， et al. Neurexins in serotonergic neurons regulate neuronal survival， serotonin transmission， and complex mouse behaviors[J]. eLife， 2023， 12： e85058.