款冬花多糖通過調(diào)控miR-4282表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的機(jī)制研究

〔摘要〕 目的 探討款冬花多糖通過調(diào)控miR-4282表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和C-33A并以10、20、40、80、120 mg·L-1的款冬花多糖處理，然后通過CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞存活率并篩選款冬花多糖最佳作用濃度。將HeLa和C-33A細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組、陰性對(duì)照組、款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組，分組處理后通過RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-4282表達(dá)；通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、EDU實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、凋亡；通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移、侵襲情況；通過Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白（Cyclin D1）、凋亡相關(guān)蛋白[B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（B-cell lymphoma-2 related X protein， Bax）]、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白[Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallo-proteinases 2， MMP-2）、E-cadherin]表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細(xì)胞存活率、EDU陽性率、遷移率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、Cyclin D1與Bcl-2、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），miR-4282表達(dá)、凋亡率、Bax與E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；陰性對(duì)照組細(xì)胞各指標(biāo)無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細(xì)胞存活率、EDU陽性率、遷移率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、Cyclin D1與Bcl-2、Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），miR-4282表達(dá)、凋亡率、Bax與E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論 款冬花多糖可通過上調(diào)miR-4282表達(dá)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲并促使其凋亡，最終對(duì)其起到明顯抑癌作用。

〔關(guān)鍵詞〕 款冬花多糖；miR-4282表達(dá)；宮頸癌；增殖；遷移；侵襲

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.009

Mechanism of polysaccharide of Farfarae Flos in inhibiting proliferation， migration， and invasion of cervical cancer cells by regulating miR-4282 expression

YUAN Xiaobo1， XIAO Guixiang1*， TANG Jing1*， LI Lijuan2， LI Yujing1

1. School of Nursing and Medical Technology， Hunan Institute of Traffic Engineering， Hengyang， Hunan 421219， China;

2. Obstetrics Department of the First People's Hospital of Chenzhou， Chenzhou， Hunan 423000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the mechanism of polysaccharide of Farfarae Flos in inhibiting the proliferation， migration， and invasion of cervical cancer cells by regulating miR-4282 expression. Methods Human cervical cancer cell lines HeLa and C-33A were cultured in vitro and treated with 10， 20， 40， 80， and 120 mg·L-1 of polysaccharide of Farfarae Flos. CCK-8 assay was used to determine the survival rate of each group of cells and screen the optimal concentration of polysaccharide of Farfarae Flos. HeLa and C-33A cells were randomly grouped into control group， fluorouracil （5-FU） group， polysaccharide of Farfarae Flos group， miR-4282 mimics group， negative control group， and polysaccharide of Farfarae Flos+miR-4282 inhibitor group. The miR-4282 expression was examined by RT-PCR; the cell proliferation and apoptosis were deterrmined by CCK-8 assay， EDU assay， and flow cytometry; the cell migration and invasion were checked by scratch and transwell assays; immunoblotting was used to examine the expression of cell proliferation related proteins （Cyclin D1）， apoptosis related proteins （Bax， Bcl-2）， epithelial mesenchymal transition-related proteins [Vimentin， Matrix Metallo-proteinases 2 （MMP2）， E-cadherin]. Results Compared with the control group， the cell survival rate， EDU positivity rate， migration rate， migration number， invasion number， the Cyclin D1 protein expression as well as protein expressions of Bcl-2， Vimentin， and MMP-2 in 5-FU group， polysaccharide of Farfarae Flos group， and miR-4282 mimics group decreased （Plt;0.05）， while the miR-4282 expression， apoptosis rate， and protein expressions of Bax and E-cadherin increased （Plt;0.05）. There was no significant change in various indicators of cells in the negative control group （Pgt;0.05）. Compared with the polysaccharide of Farfarae Flos group， the cell survival rate， EDU positivity rate， migration rate， migration number， invasion number， the Cyclin D1 protein expression as well as protein expressions of Bcl-2， Vimentin， and MMP-2 in the polysaccharide of Farfarae Flos+miR-4282 inhibitor group were higher （Plt;0.05）， while the miR-4282 expression， apoptosis rate， and protein expressions of Bax and E-cadherin were lower （Plt;0.05）. Conclusion The polysaccharide of Farfarae Flos can inhibit the proliferation， migration， invasion， and apoptosis of cervical cancer cells by up-regulating the miR-4282 expression， ultimately playing a significant role in cancer suppression.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 polysaccharide of Farfarae Flos; miR-4282 expression; cervical cancer; proliferation; migration; invasion

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有早期診斷困難、惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)，給女性生殖健康和生命安全造成嚴(yán)重威脅，已成為導(dǎo)致女性癌癥死亡的重要原因[1-2]。癌癥的發(fā)生發(fā)展是由多基因參與、多因素影響的多階段過程，miR-4282作為一種具有抑癌活性的微小RNA在其中起到關(guān)鍵作用，研究顯示，miR-4282在胰腺癌中低表達(dá)并可預(yù)測(cè)胰腺癌患者不良預(yù)后，miR-4282的過表達(dá)可顯著降低胰腺癌細(xì)胞的遷移能力并抑制其惡性進(jìn)展[3]。miR-4282低表達(dá)的上皮性卵巢癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，而miR-4282的過表達(dá)可削弱上皮性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[4]。此外miR-4282在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)且與其患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生和臨床分級(jí)有關(guān)，恢復(fù)miR-4282的表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition， EMT）、遷移和侵襲并促進(jìn)其凋亡[5]。因而，miR-4282可作為宮頸癌的潛在治療靶點(diǎn)。款冬花具有抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用，其提取物對(duì)肺癌細(xì)胞可起到增殖抑制作用[6-8]，其花蕾提取物中的款冬花多糖可體外抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[9]。劉宜峰等[10]研究表明，款冬花多糖可通過上調(diào)miR-99a而抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，推測(cè)款冬花多糖可能通過調(diào)控miR-4282而對(duì)宮頸癌發(fā)揮抗癌作用，本文通過體外培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和C-33A，探究款冬花多糖通過調(diào)控miR-4282表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1" 細(xì)胞株

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、C-33A（貨號(hào)TCH-C193、TCH-C143），購(gòu)自上海慧穎生物科技有限公司。

1.2" 主要試劑

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）（貨號(hào)LM1066，純度98%，上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；款冬花多糖（貨號(hào)121449，純度≥98%，扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司）；miR-4282 mimics、inhibitor及其陰性對(duì)照（貨號(hào)HY- R00961，江蘇賽索飛生物科技有限公司）；一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)FG2210，北京凡知醫(yī)學(xué)科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)E-CK-A211）、EdU細(xì)胞增殖成像檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)E-CK-A378）、增強(qiáng)型CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)E-CK-A362）、山羊抗兔二抗（批號(hào)E-AB-1114），均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔源抗人Cyclin D1、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（B-cell lymphoma-2 related X protein， Bax）、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白[Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallo-proteinases 2， MMP-2）、E-cadherin]一抗（貨號(hào)ab134175、ab32503、ab227639、ab32124、ab9485、ab16700、ab92536）、結(jié)晶紫染色液（貨號(hào)ab246820）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3" 主要儀器

WEF-2008型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（上海沃爾福實(shí)業(yè)有限公司）；FACSMelody流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；LB102生物顯微鏡（廣州市萊特光電技術(shù)有限公司）；FluorChem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（英國(guó)SYGENE公司）；PowerEase Touch 350W觸屏電源、iblot 3 Western Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、XCellSureLock Mini-Cell電泳槽（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4" 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和C-33A體外培養(yǎng)及款冬花多糖在細(xì)胞中最佳作用濃度篩選

快速解凍HeLa、C-33A細(xì)胞，用MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗）復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代2次后以每孔1×104個(gè)的密度將HeLa和C-33A細(xì)胞分別接種在96孔板中培養(yǎng)，分別以終濃度0（設(shè)為對(duì)照組）、10、20、40、80、120 mg·L-1的款冬花多糖處理HeLa和C-33A細(xì)胞[10]24 h，每組6個(gè)復(fù)孔并設(shè)置不接種細(xì)胞的空白對(duì)照組，每孔加入10 ？滋L CCK-8試劑孵育90 min后測(cè)量各組細(xì)胞吸光度（optical density， OD）值，重復(fù)操作3遍，根據(jù)公式算出各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（OD值藥物處理組-OD值空白對(duì)照組）/（OD值對(duì)照組-OD值空白對(duì)照組）×100%。

1.5" HeLa和C-33A細(xì)胞分組和處理

HeLa和C-33A細(xì)胞傳代2次后以每孔1×105個(gè)的密度分別接種在24孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組、5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組、陰性對(duì)照組、款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組。對(duì)照組正常培養(yǎng)不做處理，此外其余各組進(jìn)行分組處理：5-FU組以終濃度20 μg·mL-1的5-FU處理[11]，款冬花多糖組以終濃度80 mg·L-1的款冬花多糖（根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)得到的半數(shù)抑制濃度確定款冬花多糖干預(yù)濃度）處理，miR-4282 mimics組以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染100 nmol·L-1的miR-4282 mimics，陰性對(duì)照組以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染100 nmol·L-1的miR-4282陰性對(duì)照，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組以終濃度80 mg·L-1的款冬花多糖+以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染100 nmol·L-1的miR-4282 inhibitor同時(shí)處理，miR-4282 mimics及其陰性對(duì)照濃度參考各自說明書設(shè)定，轉(zhuǎn)染方法見脂質(zhì)體2000說明書，各組細(xì)胞均于處理24 h后做后續(xù)檢測(cè)。

1.6" 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1" RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HeLa和C-33A細(xì)胞miR-4282表達(dá)水平" 用TRIzol試劑提取處理后的各組細(xì)胞總RNA，按照一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到的各基因循環(huán)閾值采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析，并選擇U6作為miR-4282內(nèi)參基因，重復(fù)操作3遍，引物序列見表1。

1.6.2" CCK-8實(shí)驗(yàn)、EDU實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、凋亡情況" CCK-8實(shí)驗(yàn)：HeLa和C-33A細(xì)胞傳代2次后以1×104個(gè)/孔的密度分別接種在96孔板中，按1.5中方法分組處理24 h后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，重復(fù)操作3遍，實(shí)驗(yàn)方法如1.4中所示。

EDU實(shí)驗(yàn)：HeLa和C-33A細(xì)胞傳代2次后以每孔1×105個(gè)的密度分別接種在24孔板中，按1.5中方法分組處理24 h，加入EDU試劑處理2.5 h后按EdU細(xì)胞增殖成像檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行EDU染色，熒光顯微鏡下拍攝各組圖像，重復(fù)操作3遍，用Image J圖像分析軟件對(duì)其中EDU陽性細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞總數(shù)目進(jìn)行定量，計(jì)算各組細(xì)胞EDU陽性率，EDU陽性率=EDU陽性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%。

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：取“1.5”項(xiàng)中藥物干預(yù)后的各組HeLa和C-33A細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后分別收集，使用PBS洗滌、重懸后測(cè)出細(xì)胞密度，每組取約1×105個(gè)HeLa和C-33A細(xì)胞，按Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行FITC、PI雙染，用流式細(xì)胞儀檢查各組細(xì)胞凋亡率，重復(fù)操作3遍。

1.6.3" 劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞遷移、侵襲情況" 取“1.5”項(xiàng)中藥物干預(yù)后的各組HeLa和C-33A細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后分別收集，使用PBS洗滌、不含血清的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后測(cè)出細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞密度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將各組HeLa和C-33A細(xì)胞制為1×106個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行遷移與侵襲檢測(cè)。

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移：每組分別取2×105個(gè)HeLa和C-33A細(xì)胞（細(xì)胞懸液各200 μL）接種在24孔板，等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)4 h后在每個(gè)細(xì)胞孔底部劃一條直線，用PBS清洗掉劃痕中的細(xì)胞，在生物顯微鏡下拍攝各組圖像，用Image J圖像分析軟件對(duì)各組劃痕面積數(shù)量進(jìn)行定量，病記為S1，等細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后再次拍攝其圖像并定量各組劃痕面積數(shù)量，記為S2，重復(fù)操作3遍，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率，遷移率=（S1-S2）/S1×100%。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移：每組分別取2×105個(gè)HeLa和C-33A細(xì)胞（細(xì)胞懸液各200 μL）接種在24孔Transwell板上室，等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)4 h后向Transwell板下室加入含10%血清的MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后以PBS清洗、4%多聚甲醛固定遷移到下室的細(xì)胞，以結(jié)晶紫染色液染色、PBS清洗后在生物顯微鏡下拍攝各組下室內(nèi)細(xì)胞圖像，重復(fù)操作3遍，采用Image J圖像分析軟件對(duì)其數(shù)量進(jìn)行定量，即得到各組HeLa和C-33A細(xì)胞遷移數(shù)。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲：取24孔Transwell板，使用基質(zhì)膠對(duì)其上室進(jìn)行包被，分別加入HeLa和C-33A細(xì)胞懸液各200 μL，后續(xù)操作與遷移檢測(cè)相同，重復(fù)操作3遍，最終得到各組HeLa和C-33A細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.6.4" Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、凋亡、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)收集1.5中分組處理后的各組HeLa和C-33A細(xì)胞，采用RAPI試劑在4 ℃下裂解后離心，從而提取各組HeLa和C-33A細(xì)胞總蛋白，采用BCA法分別測(cè)出每組細(xì)胞總蛋白濃度，然后在沸水浴內(nèi)加熱變性各組細(xì)胞蛋白，每組取35 ？滋g，各組HeLa和C-33A細(xì)胞總蛋白樣本，上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印，于PVDF膜上獲得按分子量大小分離開的各組蛋白，以5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉后剪下GAPDH、Vimentin、MMP-2、Cyclin D1、Bax、E-cadherin及Bcl-2蛋白條帶，分別孵育相對(duì)應(yīng)的兔源抗人一抗，然后孵育HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，以化學(xué)發(fā)光試劑顯色各組蛋白條帶，重復(fù)操作3遍，采集其圖像后運(yùn)用Image pro軟件定量其灰度值，最后以GAPDH作為內(nèi)參量化各組Vimentin、MMP-2、Cyclin-D1、Bax、E-cadherin及Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.7" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文數(shù)據(jù)采用“ｘ±s”描述，并運(yùn)用Graph Pad Prism 8.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間差異比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 款冬花多糖對(duì)HeLa和C-33A細(xì)胞存活率的影響

與0 mg/L款冬花多糖相比，10、20、40、80、120 mg·L-1的款冬花多糖均可降低HeLa和C-33A細(xì)胞存活率（P＜0.05），選擇半數(shù)抑制濃度附近的80 mg·L-1的款冬花多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。詳見圖1。

2.2" 款冬花多糖對(duì)HeLa和C-33A細(xì)胞miR-4282表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細(xì)胞miR-4282表達(dá)升高（P＜0.05），陰性對(duì)照組細(xì)胞miR-4282表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與5-FU組相比，款冬花多糖組細(xì)胞miR-4282表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細(xì)胞miR-4282表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3" 款冬花多糖對(duì)HeLa和C-33A細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與對(duì)照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細(xì)胞存活率、EDU陽性率降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）；陰性對(duì)照組細(xì)胞存活率、EDU陽性率、凋亡率無明顯變化（P＞0.05）。與5-FU組相比，款冬花多糖組細(xì)胞存活率、EDU陽性率、凋亡率無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細(xì)胞存活率、EDU陽性率升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05）。詳見圖3—5。

2.4" 款冬花多糖對(duì)HeLa和C-33A細(xì)胞遷移與侵襲的影響

與對(duì)照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細(xì)胞遷移率、遷移數(shù)與侵襲數(shù)降低（P＜0.05），陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移率、遷移數(shù)與侵襲數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；與5-FU組相比，款冬花多糖組細(xì)胞遷移率、遷移數(shù)與侵襲數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細(xì)胞遷移率、遷移數(shù)與侵襲數(shù)升高（P＜0.05）。詳見圖6—9。

2.5" 款冬花多糖對(duì)HeLa和C-33A細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；陰性對(duì)照組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。與5-FU組相比，款冬花多糖組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細(xì)胞Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見圖10、圖11。

2.6" 款冬花多糖對(duì)HeLa和C-33A細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，5-FU組、款冬花多糖組、miR-4282 mimics組細(xì)胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；陰性對(duì)照組細(xì)胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL、E-cadherin蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。與5-FU組相比，款冬花多糖組細(xì)胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL、E-cadherin蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。與款冬花多糖組相比，款冬花多糖+miR-4282 inhibitor組細(xì)胞Vimentin、MMP2、N-cadherin、SNAIL蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見圖12、圖13。

3 討論

宮頸癌的致病因素包括遺傳、病毒感染和環(huán)境等，但其致病機(jī)制目前還未得到明確闡釋，如今手術(shù)切除、放化療等宮頸癌治療技術(shù)在不斷發(fā)展和進(jìn)步，雖然取得了一定成果，但患者生存率仍然較低。因此，積極開發(fā)更有效的新型治療方法是提升患者預(yù)后的關(guān)鍵[12-13]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，款冬花具有明顯的抗癌功效，從款冬花中分離出的一種半萜類化合物可有效抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和體內(nèi)生長(zhǎng)[7，14]。另外很多研究證實(shí)，中藥多糖具有多角度、多機(jī)制協(xié)同的抗腫瘤作用，還可避免耐藥性的產(chǎn)生，在人類惡性腫瘤治療中具有極大研究?jī)r(jià)值和開發(fā)潛力[15]。CAO等[16]的研究顯示，款冬花多糖能顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力并促進(jìn)其凋亡。QU等[9]研究顯示，款冬花多糖對(duì)肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出抗增殖和促凋亡的作用，因而預(yù)測(cè)款冬花多糖可能對(duì)宮頸癌起到抑癌功效。本文結(jié)果顯示，以款冬花多糖處理人宮頸癌細(xì)胞HeLa和C-33A，可降低其細(xì)胞存活率、EDU陽性率、遷移率、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、Cyclin-D1與Bcl-2蛋白表達(dá)，升高其凋亡率、Bax蛋白表達(dá)，表明款冬花多糖可降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)其凋亡，作用與陽性對(duì)照藥5-FU相似。EMT是癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的必要生理過程，調(diào)控EMT標(biāo)志蛋白Vimentin、MMP-2、E-cadherin表達(dá)，可通過調(diào)控EMT介導(dǎo)宮頸癌的遷移侵襲[17]，以款冬花多糖處理人宮頸癌細(xì)胞HeLa和C-33A，可降低其細(xì)胞Vimentin、MMP-2蛋白表達(dá)并升高E-cadherin蛋白表達(dá)，表明款冬花多糖可通過減輕EMT而抑制宮頸癌遷移侵襲，作用與陽性對(duì)照藥5-FU相似，最終揭示款冬花多糖可對(duì)宮頸癌發(fā)揮顯著抗癌作用。

miR-4282是在癌癥發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵調(diào)控作用的微小RNA，可成為潛在的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)[18]。ZHOU等[19]的研究顯示miR-4282在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，對(duì)其過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。ZHANG等[20]的研究顯示miR-4282微微一種腫瘤抑制因子在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可顯著減輕口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移、EMT并增強(qiáng)其細(xì)胞凋亡，由此可知，miR-4282能成為的潛在治療靶點(diǎn)。本文結(jié)果顯示，以款冬花多糖處理人宮頸癌細(xì)胞HeLa和C-33A，可升高其miR-4282表達(dá)，另外以模擬物上調(diào)HeLa和C-33A細(xì)胞miR-4282表達(dá)，可對(duì)宮頸癌起到與款冬花多糖相似的抗癌作用，表明miR-4282是宮頸癌的潛在治療靶點(diǎn)，并可參與介導(dǎo)款冬花多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的抑制作用。然而，本研究結(jié)果表明，抑制miR-4282表達(dá)將削弱款冬花多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的抑制作用，同時(shí)降低款冬花多糖的促凋亡能力，削弱其對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用，最終逆轉(zhuǎn)其對(duì)宮頸癌的抗癌作用，揭示款冬花多糖抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲是通過上調(diào)控miR-4282表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，款冬花多糖可通過提高miR-4282表達(dá)而降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，最終對(duì)宮頸癌發(fā)揮顯著抗癌功效，本文為宮頸癌的臨床治療提供了新的候選藥物，并對(duì)其臨床治療技術(shù)的開發(fā)改進(jìn)起到一定積極意義。

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