直推督脈對孤獨癥譜系障礙模型鼠PVN區催產素神經元及認知功能的影響

〔摘要〕 目的 觀察直推督脈對孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD）模型鼠室旁核（paraventricular nucleus， PVN）區催產素（oxytocin， OXT）神經元活性及認知功能的影響，探討直推督脈對ASD的作用及潛在機制。方法 采用腹腔注射丙戊酸鈉的方法構建ASD模型。隨機取7只孕12.5 d的SD大鼠腹腔注射丙戊酸鈉，3只腹腔注射生理鹽水。孕鼠產仔后第21天，剔除雌性幼鼠，將剩余雄性幼鼠分為空白組、模型組、直推督脈組、藥物注射組，每組5只。空白組、模型組給予腹腔注射同等劑量生理鹽水；直推督脈組予以直推督脈的干預方式，20 min/次，一日2次，并予以腹腔注射同等劑量生理鹽水；藥物注射組以每日0.1 mg/kg的劑量腹腔注射OXT，以上干預均連續14 d。第35天進行高架十字迷宮實驗、Morris水迷宮實驗以判斷其焦慮情緒和認知能力；通過免疫熒光染色法標記PVN區OXT與c-Fos蛋白、海馬區OXT與催產素受體（oxytocin receptor， OXTR）；Western blot法檢測海馬區OXTR蛋白表達水平；ELISA法檢測幼鼠海馬區與下丘腦中的OXT含量。結果 與空白組相比，模型組開放臂活動時間縮短、開放臂進入次數減少（P＜0.01）；逃避潛伏期增加、平臺所在區域活動路程減少（P＜0.05，P＜0.01）；PVN區OXT神經元與c-Fos陽性表達、海馬區OXT與OXTR結合的陽性表達、海馬區OXTR蛋白表達均減少（P＜0.01）；下丘腦與海馬區OXT含量下降（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組、藥物注射組的開放臂活動時間增長、開放臂進入次數增加（P＜0.05，P＜0.01）；逃避潛伏期縮短、平臺所在區域活動路程增加（P＜0.05，P＜0.01）；PVN區OXT神經元與c-Fos陽性表達、海馬區OXT與OXTR結合的陽性表達、海馬區OXTR的蛋白表達水平均增加（P＜0.01）；下丘腦、海馬區OXT含量上升（P＜0.01）。結論 直推督脈可以改善ASD模型鼠的認知功能，其機制可能與PVN區OXT神經元被激活，OXT水平升高，從而增加其與海馬區OXTR結合相關。

〔關鍵詞〕 孤獨癥譜系障礙；推拿；督脈；認知功能；催產素神經元

〔中圖分類號〕R244.1" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.014

Effects of straight pushing the Du meridian on the oxytocin

neurons in the PVN region and the cognitive function of

autism spectrum disorder model rats

ZHI Hui1， FENG Xiang1， ZHANG Yuxing1， LI Wu1， AI Kun1， HUANG Wentao2*， LI Jiangshan1*

1. College of Acupuncture， Tuina， and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of straight pushing the Du meridian （SPDM） on the activity of oxytocin （OXT） neurons in the paraventricular nucleus （PVN） region and the cognitive function of autism spectrum disorder （ASD） model rats， and to explore the effects and potential mechanism of SPDM on ASD. Methods The ASD model was established by intraperitoneal injection of sodium valproate. Seven SD rats at 12.5 days of pregnancy were randomly selected and sodium valproate was then injected into the abdominal cavity， while three other rats were injected with physiological saline into the abdominal cavity. On the 21st day after birth， female young rats were excluded and the remaining male young rats were divided into blank group， model group， SPDM group， and drug injection group， with five rats in each group. The blank group and model group were given intraperitoneal injection of the same dose of physiological saline; the SPDM group was intervened by SPDM for 20 minutes per time， twice a day， and the same dose of physiological saline was injected into the abdominal cavity; the drug injection group received intraperitoneal injection of OXT at a daily dose of 0.1 mg/kg， and the above interventions were continuous for 14 d. On the 35th day， elevated cross maze and Morris water maze experiments were conducted to assess the rats' anxiety and cognitive abilities; immunofluorescence staining was used to label OXT and c-Fos proteins in the PVN region， as well as OXT and oxytocin receptor （OXTR） in the hippocampus; Western blot was used to check the expression levels of OXTR protein in the hippocampus; ELISA method was used to determine the content of OXT in the hippocampus and hypothalamus of young rats. Results Compared with the blank group， the model group had shorter open arm activity time and fewer open arm entry times （Plt;0.01）; increased escape latency （Plt;0.05） and decreased distance of the platform's quadrant （Plt;0.01）; reduced positive expressions of OXT neurons and c-Fos in the PVN region， the positive expressions of OXT and OXTR binding in the hippocampus， and the OXTR protein expressions in the hippocampus （Plt;0.01）; and the lower OXT content in the hypothalamus and hippocampus regions （Plt;0.01）. Compared with those of model group， the open arm range of activity increased and the number of open arm entries increased in SPDM group and drug injection group （Plt;0.05， Plt;0.01）， while the escape latency shortened and the range of activity in the quadrant where the platform was located increased （Plt;0.05， Plt;0.01）; the positive expressions of OXT neurons and c-Fos in the PVN region， the positive expressions of OXT and OXTR binding in the hippocampus， and the expressions of OXTR in the hippocampus all increased （Plt;0.01）; the OXT content in the hypothalamus and hippocampus increased （Plt;0.01）. Conclusion SPDM can improve cognitive function of ASD model rats， and its mechanism may be related to the activation of OXT neurons in the PVN region， which in turn increases OXT levels and thus strengthens their binding with hippocampal OXTR.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 autism spectrum disorder; Tuina; the Du meridian; cognitive function; oxytocin neuron

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder， ASD），又稱自閉癥，屬于神經發育障礙類疾病之一，常表現為社交障礙、認知困難、刻板行為以及興趣狹隘等一系列癥狀[1]。目前，在全球范圍內ASD已呈現出逐年增長的發病趨勢[2]，嚴重影響患者的生存質量并加重家庭經濟負擔[3]。然而，ASD的發病原因至今尚未明確，導致暫未形成針對病因的治療方案。盡管美國食品藥品監督管理局批準兩種可用于治療兒童ASD的藥物，即阿立哌唑與利培酮，但二者均存在嚴重不良反應，如體質量增加、睡眠問題、自傷行為等[4]。因此，當前多以康復干預、針灸、推拿等輔助療法改善其臨床癥狀。

催產素（oxytocin， OXT）作為一種肽類激素，在室旁核（paraventricular nucleus， PVN）和視上核（supr？鄄aoptic nucleus，SON）中合成，并通過垂體儲存、釋放進入血液，發揮外周效應[5]。除刺激泌乳和收縮子宮的功能外，OXT還通過神經投射與其受體結合的方式產生中樞效應，在介導社會認知、社會交流等方面具有重要作用[6]。近年來，OXT被認為可能是參與ASD發病的因素之一。諸多研究表明[7-8]，ASD患者體內的OXT含量異于正常健康人，可表現為OXT水平低下、催產素受體（oxytocin receptor， OXTR）結合異常等。體內實驗表明[9]，敲除小鼠腦中的OXTR基因后，小鼠表現出低社會識別能力等ASD樣行為。而經外源補充或者內源刺激可提升ASD患者的認知能力，并改善ASD患者的社交缺陷、面部表情識別困難等癥狀[10-11]。故提升OXT水平可能是改善ASD患者認知障礙的一種有效干預方式。

推拿作為中醫學中外治法的重要組成部分，具有無痛、無不良反應的特點。現已證明，推拿可以促進OXT的釋放[12]，這可能與推拿可激活C類觸覺傳入纖維有關[13]。MT等[14]對20名4～7歲的ASD患兒進行長達2年的推拿干預發現，ASD患兒對面部表情的反應能力得到提升，并有26%的患兒經診斷已無ASD的核心癥狀。ASD患兒在接受推拿之后，其唾液中的OXT水平增加的同時，社交能力也有所改善[15-16]。中醫學認為，ASD的病位在腦，《靈樞·邪氣臟腑病形》中提到“病變在腦，首取督脈”，督脈素有“陽脈之海”之稱，通過調節督脈之經氣可達到調控體內陽氣的目的。督脈入屬于腦，腦為髓海，陽氣充盛則髓海得養，從而推動腦的生理功能正常運轉。目前，研究人員以針刺或推拿為施術方法，以督脈為切入點建立的干預方案可有效緩解ASD患者的認知、社交障礙和焦慮情緒，提高語言交流能力以及眼神接觸能力[17-18]。但直推督脈能否通過促進OXT的釋放并對認知功能產生影響尚未可知。因此，本研究以ASD模型鼠為研究對象，以直推督脈為施術方式，探究直推督脈對ASD模型鼠OXT水平及認知功能的影響，為臨床干預提供科學證據。

1 材料與方法

1.1" 動物來源與模型制備

實驗動物為SPF級SD孕鼠10只，孕12.5 d，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證編號：SYXK（湘）2019-0004，單籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心。飼養溫度為24～26 ℃，濕度為50%～70%，晝夜各半。本次實驗方案已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（倫理編號：LL202201180002）。本研究將10只孕鼠隨機分成兩組，7只以600 mg/kg的劑量腹腔注射丙戊酸鈉，以構建ASD模型[19]，根據幼鼠行為學檢測（高架十字迷宮、Morris水迷宮實驗）結果，以存在焦慮情緒和認知障礙作為造模成功的標準[20]。3只孕鼠腹腔注射同等劑量生理鹽水，作為ASD對照組。在幼鼠出生后的第21天從ASD對照組產下的子代雄鼠中，隨機選取5只為空白組；剔除ASD模型產下的子代雌鼠，剩余子代雄鼠15只，隨機分為模型組、直推督脈組、藥物注射組，每組5只。

1.2" 主要儀器與試劑

高架十字迷宮實驗視頻分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號：ZS-DSG）；Morris水迷宮（上海欣軟信息技術有限公司，型號：XR-XM101）；正置熒光顯微鏡、成像系統（日本尼康儀器有限公司，型號：NikonEclipseC1、NikonDS-U3）；推法刺激器（自制研發，專利號：ZL202121852010.X）。

丙戊酸鈉、OXT（美國MedChem express公司，批號：HY-10585A、HY-17571A）；OXTR抗兔抗體（成都正能生物技術有限責任公司，批號：R389033）；OXT神經毒素1、c-Fos多克隆抗體（6A3）（湖南艾方生物科技有限公司，批號：AF02963、AF11092）。

1.3" 實驗方法

直推督脈組的幼鼠予以推法刺激器順督脈循行方向進行直推的操作。督脈定位參照2014年版《實驗動物針灸手冊》[21]，操作范圍為尾根沿后正中線上至百會穴，施術寬度為0.8 cm。將直推督脈組的幼鼠俯臥位放置，推法頻率100次/min，壓力100 g，操作距離100 mm，操作20 min，每日2次，分別于上午10：00與下午4：00時進行操作，并給予腹腔注射同等劑量生理鹽水，每日1次，連續14 d。藥物注射組每日以0.1 mg/kg的劑量腹腔注射OXT，每日1次，共14 d，空白組、模型組幼鼠均正常飼養，并給予腹腔注射同等劑量生理鹽水，每日1次，共14 d。。

1.4" 行為學檢測

1.4.1" 高架十字迷宮實驗" 高架十字迷宮實驗[22]是針對實驗對象焦慮狀態的檢測。分別由兩個開放臂、閉合臂交叉組成，臂長50 cm、臂寬10 cm、臂高30 cm，兩者重合區域為中心區。實驗開始之前將幼鼠放置于迷宮之中，使其熟悉環境。實驗正式開始時，以中心區作為起始點，將幼鼠放至中心區后計時10 min，觀察其在設定時間內，在高架十字迷宮中的運動軌跡，以及在開放臂的運動時間和路程。一次實驗結束后，用75%乙醇擦拭開放臂、閉合臂以消除氣味，待儀器干燥后放入下一只待測幼鼠。

1.4.2" Morris水迷宮實驗" Morris水迷宮[23]是檢測認知能力的經典實驗之一，主要檢測實驗動物的學習能力和空間記憶能力。迷宮由直徑1 200 cm的圓柱形水池及可固定平臺組成。將水池平分成4個象限，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。將平臺固定放置于某一象限，并放水沒過平臺。實驗連續進行6 d。第1、2天為訓練期，將幼鼠從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限放入水中，記錄其在120 s內到達平臺的時間。若120 s未找到平臺，在計時結束之后，將幼鼠引導至平臺并停留20 s。分別記錄第3、4、5天從Ⅰ～Ⅳ象限入水的平均逃避潛伏期，即120 s內幼鼠從入水到登上平臺的時間，以觀察其學習認知能力，如未登上平臺則記為120 s。第6天將平臺撤去，將4組幼鼠從Ⅱ象限放入水中，記錄幼鼠在原平臺所在象限的路程，檢測空間記憶能力。

1.5" 樣本采集

14 d干預結束并進行動物行為學檢測之后，將各組幼鼠以戊巴比妥鈉進行麻醉，充分暴露心臟，剪去心耳，進行灌注。使用高溫滅菌手術器械將一側腦組織的海馬取出，放至液氮中，后轉運至-80 ℃冰箱，用以Western blot檢測；另一側取腦組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，以進行免疫熒光染色。

1.6" 免疫熒光雙標染色觀察PVN區OXT、c-Fos和海馬區OXT、OXTR共表達情況

將包含海馬區、下丘腦的腦組織固定48 h，梯度乙醇脫水后，進行石蠟包埋。隨后以4 μm的厚度連續切片。石蠟切片在經過脫蠟、抗原修復后加入自發熒光淬滅劑。處理完成后滴加BSA孵育，孵育結束后分別滴加一抗、二抗，并用DAPI復染細胞核，最終封片、鏡檢拍照。

1.7" Western blot檢測海馬區OXTR表達量

將海馬區放入離心管中，加入裂解液與蛋白酶抑制劑后，充分勻漿。4 ℃，5 000 r/min，離心15 min（離心半徑9.81 cm），收集上清液。利用BCA蛋白測定法檢測蛋白濃度。使用蛋白上樣緩沖液將蛋白定量為4 μg/mL，放于-20 ℃冰箱保存。使用10%的SDS-PAGE分離膠、5%的濃縮膠，經過電泳之后，將PVDF膜覆蓋于凝膠上，利用濕轉法進行轉膜。脫脂牛奶封閉2 h后，TBST沖洗3次，每次10 min。將一抗OXTR抗兔抗體（1∶1 000）倒入孵育盒中，以覆蓋PVDF膜為準，4 ℃過夜。第二天TSBT洗膜3次，孵育二抗（1∶10 000）1 h后再次將PVDF膜沖洗3次，曝光顯影。最終結果以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值呈現。

1.8" ELISA法檢測下丘腦、海馬區OXT濃度

使用PBS將下丘腦、海馬區的殘留血液沖洗干凈后進行稱重，并將其充分剪碎。按照1∶9的比例將剪碎的組織與PBS放入離心管中，每管分別加入蛋白酶抑制劑。將離心管置于提前預冷的高速研磨機中使其充分研磨。將離心管取出，放入4 ℃的離心機中，5 300 r/min離心5 min（離心半徑9.81 cm），提取上清液，用ELISA試劑盒檢測其OXT含量。

1.9" 統計學分析

利用SPSS 26.0進行統計學分析。實驗數據以“ｘ±s”表示。滿足正態性和方差齊性則用單因素方差分析并結合LSD檢驗進行兩兩比較；當方差不齊時則用韋爾奇方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1" 高架十字迷宮實驗結果

與空白組相比，模型組幼鼠在開放臂的活動時間縮短、進入開放臂的次數減少（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組、藥物注射組在開放臂的活動時間均延長（P＜0.01），開放臂進入的次數增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖1。

2.2" Morris水迷宮實驗結果

與空白組相比，模型組幼鼠的平均逃避潛伏期延長（P＜0.01），平臺所在區域的活動路程縮短（P＜0.05）。與模型組相比，直推督脈組和藥物注射組幼鼠的平均逃避潛伏期縮短（P＜0.01），平臺區域活動路程增長（P＜0.01）。詳見圖2。

2.3" 下丘腦PVN區OXT神經元表達結果

與空白組相比，模型組共定位的陽性細胞數量占比減少（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組與藥物注射組共定位的陽性細胞數量占比增加（P＜0.01）。詳見圖3。

2.4" 海馬區OXT與OXTR熒光染色結果比較

與空白組相比，模型組海馬區OXT與OXTR雙染的陽性細胞數量占比減少（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組與藥物注射組OXT與OXTR雙染的陽性細胞數量占比增多（P＜0.01）。詳見圖4。

2.5" 海馬區OXTR蛋白表達結果比較

與空白組相比，模型組的OXTR的表達量下降（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組與藥物注射組的OXTR表達水平升高（P＜0.01）。詳見圖5。

2.6" 下丘腦、海馬區OXT表達水平比較

與空白組相比，模型組下丘腦、海馬區OXT水平均降低（P＜0.01）。與模型組相比，直推督脈組和藥物注射組下丘腦、海馬區OXT水平均升高（P＜0.01）。詳見圖6。

3 討論

中醫學并無關于ASD的名稱記載，但其中所描述的“語遲”“胎弱”“童昏”的癥狀與ASD發育遲緩、認知缺陷、表情淡漠等臨床表現相似，均由生長發育和精神思維異常導致，屬神之病變[24]。中醫學認為本病的病位在腦，腦為元神之府，主宰人體的生命活動，元神神機失養則出現發育遲緩、認知異常、語言混亂的表現[25]。從中醫的經絡理論出發，腦與督脈密切聯系[26]。“督脈者，起于下極之俞……入屬于腦”，說明督脈通過循行以入腦，從而參與調節腦的生理功能[27]。督脈為“陽脈之海”，手足三陽經均通過大椎穴匯入督脈而入腦。督脈陽氣不足，無力上充腦竅將導致ASD患者出現沉默不語、反應遲緩或自言自語的癥狀。現代研究表明，督脈是交感神經與副交感神經中樞所在之處，其循行范圍、作用與皮質脊髓束的走向和功能大致相同，可以維持大腦正常的生理功能[28]。前期研究發現，以督脈為核心制定的推拿方案可有效改善ASD患兒的社交障礙、刻板行為以及縮短與他人眼神接觸的反映時間等[29-30]。因而，治療ASD可從督脈入手。本研究結果顯示，干預后，直推督脈組、藥物注射組開放臂的活動時間與進入次數、水迷宮平臺所在象限的活動路程均增加，平均逃避潛伏期縮短。表明通過直推督脈，可改善ASD幼鼠的焦慮和認知情況，而焦慮情況的緩解有利于認知能力的提升，兩者之間存在相互影響的關系[31]。

OXT在促進社會交流、社會認知以及共情能力等方面發揮著重要的作用[32-33]。OXT在下丘腦PVN區分泌，并通過神經纖維投射等方式傳遞至海馬區、杏仁核、前額葉等相關腦區，與其中的OXTR結合以發揮作用[34]。下丘腦PVN區的OXT系統受損，將會影響OXT的分泌[35]。研究人員發現，ASD患者下丘腦分泌OXT的能力不及正常健康人[36]。因此，提高ASD患者下丘腦OXT神經元的興奮性，促進OXT的分泌是改善ASD患者臨床癥狀的潛在干預方式。c-Fos蛋白是PVN區OXT神經元激活的標志，輕柔體表刺激可激發大鼠PVN區OXT神經元c-Fos蛋白的表達[37-38]。本研究通過免疫熒光雙標染色法對4組幼鼠PVN區OXT神經元與c-Fos蛋白共同標記，結果顯示模型組幼鼠PVN區共定位的陽性細胞占比均少于空白組、直推督脈組、藥物注射組。下丘腦的OXT含量檢測發現，模型組OXT含量明顯低于其余3組，說明直推督脈可激活ASD模型鼠PVN區OXT神經元，刺激OXT含量的升高，為其投射至遠隔腦區提供了基礎。

下丘腦PVN區OXT神經元以神經投射的方式傳遞至廣泛的腦區，其中包括海馬區[39-40]。海馬區為調控機體認知、學習功能的關鍵腦區。有證據表明，OXT可以調控海馬CA2區神經元的放電模式以調控海馬區內部的信息傳遞，且海馬CA2區正是影響社會記憶與認知的重要結構[41]。海馬區OXTR的表達在調控學習認知功能方面發揮了重要作用[42]。因此，上述研究共同表明OXT、OXTR兩者相互協作共同參與海馬區調控認知的功能。研究證實，ASD患者的海馬區功能受損，且通過功能磁共振成像發現，ASD患者海馬區中與調控情景記憶的網絡連接減弱[43]。然而，有證據顯示，通過補充OXT可以改善ASD小鼠的社會功能并重塑海馬回路，提升學習記憶能力[44]。長期鼻飼OXT可部分改變ASD模型鼠海馬區中與ASD樣行為相關的分子途徑，下調差異基因[45]。本研究結果發現，直推督脈組、藥物注射組海馬區OXT的含量均高于模型組，提示直推督脈可以升高海馬區OXT的含量；模型組海馬區的OXTR蛋白表達水平明顯下調，而直推督脈組幼鼠的OXTR蛋白表達水平上調；模型組海馬區OXT與OXTR共表達的陽性細胞占比少于直推督脈組、藥物注射組。因而推斷直推督脈可以改善ASD模型鼠OXT神經元的投射異常，增加海馬區OXT與OXTR的結合，改善ASD模型鼠的認知能力。

綜上所述，直推督脈能夠改善ASD模型鼠的認知功能，其機制可能與PVN區OXT神經元被激活，從而促進OXT分泌并使其與海馬區OXTR結合相關。

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