基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路探討熄風(fēng)解痙湯對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究

〔摘要〕 目的 觀察熄風(fēng)解痙湯對(duì)早期蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage， SAH）大鼠腦組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討熄風(fēng)解痙湯對(duì)SAH大鼠早期腦損傷（early brain injury， EBI）的保護(hù)作用機(jī)制。方法 選取成年健康雄性SD大鼠168只，采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH模型，造模成功后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（等體積蒸餾水）、假手術(shù)組（等體積蒸餾水）、模型組（等體積蒸餾水）、尼莫地平組[10 mg/（kg·d）]、熄風(fēng)解痙湯低劑量組[10.8 g/（kg·d）、熄風(fēng)解痙湯高劑量組[43.2 g/（kg·d）]、尼莫地平[10 mg/（kg·d）]+熄風(fēng)解痙湯[21.6 g/（kg·d）]組，每組24只，每12 h給藥1次，連續(xù)用藥72 h。采用Garcia神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能受損程度；HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)；TUNEL染色檢測大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulatory protein 78， GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein， CHOP）、胱天蛋白酶-12（cysteine aspartic acid specific protease-12， Caspase-12）蛋白的表達(dá)水平；計(jì)算腦組織含水量；EB染色檢測血腦屏障通透性。結(jié)果 與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組海馬區(qū)組織層次結(jié)構(gòu)不清，各層細(xì)胞排列疏松，可見大量凋亡細(xì)胞；各時(shí)間點(diǎn)的海馬區(qū)組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例、腦組織EB含量、腦組織含水量及 GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.05），Garcia神經(jīng)功能評(píng)分減低（P＜0.05）。與模型組比較，熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)較模型組清晰，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少；各時(shí)間點(diǎn)的海馬區(qū)組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例、腦組織含水量及 GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05），Garcia神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織EB含量升高（P＜0.05）。結(jié)論 SAH后EBI過程中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，熄風(fēng)解痙湯可降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、Caspase-12表達(dá)水平，提高EBI過程中大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低腦組織含水量，降低血腦屏障通透性。

〔關(guān)鍵詞〕 熄風(fēng)解痙湯；蛛網(wǎng)膜下腔出血；早期腦損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R256" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.001

Mechanism of protective effects of Xifeng Jiejing Decoction on early brain injury in rats with subarachnoid hemorrhage based on endoplasmic reticulum stress signaling pathway

XIANG Xinggang， ZHOU Yifan， YIMAMU Yidayitula， ZHAO Yong， MAIMAIJIANG Abulizi， LIN Lin*

Traditional Chinese Medical Hospital of" Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi， Xinjiang 830000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Xifeng Jiejing Decoction （XFJJD） on the expression of endoplasmic reticulum stress （ER stress） signaling pathway-related factors in the brain tissue of rats with early subarachnoid hemorrhage （SAH）， and to explore the protective mechanism of XFJJD on early brain injury （EBI） in SAH rats. Methods A total of 168 healthy adult male SD rats were selected to establish the SAH model by intravascular puncture. After successful modeling， the rats were divided into control group （an equal volume of distilled water）， sham-operated group （an equal volume of distilled water）， model group （an equal volume of distilled water）， nimodipine group [10 mg/（kg·d）]， and low-dose XFJJD [10.8 g/（kg·d）]， high-dose XFJJD group [43.2 g/（kg·d）]， and nimodipine [10 mg/（kg·d）]+XFJJD group [21.6 g/（kg·d）] by random number table method， with 24 rats in each group. Each group was administered once every 12 h for 72 h continuously. The degree of neurological impairment was assessed by Garcia score; the morphology of hippocampal nerve cells was observed by HE staining; TUNEL staining was performed to determine the apoptosis of hippocampal cells in rats; Western blot was used to check the expression levels of endoplasmic reticulum stress-related markers， including glucose regulatory protein 78 （GRP78）， C/EBP homologous protein （CHOP）， and cysteine aspartic acid specific protease-12 （cysteine-12）; the water content of brain tissue was calculated; EB staining was used to examine the permeability of the blood-brain barrier. Results Compared with the control group and the sham-operated group， the model group exhibited unclear hierarchical structure of the hippocampus， loose arrangement of cells in each layer， and a large number of apoptotic cells; the proportion of apoptosis of hippocampal nerve cells， the EB content and water content of the brain tissue， as well as the protein expression levels of GRP78， CHOP， and Caspase-12 in the hippocampus increased at various time points （Plt;0.05）， while the Garcia score decreased （Plt;0.05）. Compared with the model group， the low- and high-dose XFJJD groups showed clearer hippocampal tissue structure and reduced number of apoptotic cells; the proportion of apoptosis of hippocampal nerve cells， water content of brain tissue， and the protein expression levels of GRP78， CHOP， and Caspase-12 decreased at various time points （Plt;0.05）， while the Garcia score and EB content of brain tissue increased （Plt;0.05）. Conclusion Endoplasmic reticulum stress reaction occurs during the EBI process after SAH. XFJJD can reduce the expression levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins including GRP78， CHOP， and Caspase-12， improve neurobehavioral scores of rats during EBI process， lower the water content of brain tissue， and reduce the permeability of blood-brain barrier.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Xifeng Jiejing Decoction; subarachnoid hemorrhage; early brain injury; endoplasmic reticulum stress signaling pathway; endoplasmic reticulum stress-related proteins

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage， SAH）是指腦底部或腦表面血管破裂后，血液流入蛛網(wǎng)膜下腔引起相應(yīng)臨床癥狀的一種腦卒中，占所有腦卒中發(fā)病的5%～10%，嚴(yán)重危及人類的生命健康[1]。早期腦損傷（early brain injury， EBI）是SAH發(fā)病后72 h內(nèi)大腦發(fā)生的一系列變化，包括腦水腫、血腦屏障損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[2-3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)影響細(xì)胞內(nèi)合成和修飾蛋白質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS）在神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起決定性的作用[4]。ERS可造成細(xì)胞凋亡[5-6]，但其機(jī)制尚不明確。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulatory protein 78，GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、胱天蛋白酶-12（cysteine aspartic acid specific protease-12，Caspase-12）是被公認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白，在細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，其表達(dá)升高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。

SAH屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，源于《靈樞·邪氣藏府病形》，其病機(jī)復(fù)雜，以“風(fēng)、火、痰、瘀、氣、虛”為主因，其中以肝腎陰虛為根本，病變涉及心、肝、脾、腎等臟。國醫(yī)大師沈?qū)毞淌谡J(rèn)為，中風(fēng)病為肝腎陰虧、肝陽偏亢、氣血逆亂所致，治以鎮(zhèn)肝息風(fēng)為主，佐以滋養(yǎng)肝腎為法，在鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的基礎(chǔ)上創(chuàng)制了熄風(fēng)解痙湯[8]。熄風(fēng)解痙湯方中懷牛膝引血下行、補(bǔ)益肝腎，為君藥；赭石鎮(zhèn)肝降逆，龍骨、牡蠣、龜甲、白芍、天麻益陰潛陽、鎮(zhèn)肝息風(fēng)，共為臣藥；玄參、天門冬滋陰清熱，壯水涵木，肝喜條達(dá)而惡抑郁，純用重鎮(zhèn)之品以強(qiáng)制之，影響其條達(dá)之性，故用茵陳、川楝子、生麥芽清泄肝熱、疏肝理氣，川芎行氣活血，以利于肝陽的平降鎮(zhèn)潛，均為佐藥；炙甘草調(diào)和諸藥，與生麥芽相配，并能和胃調(diào)中，防止金石類藥物礙胃之弊，為使藥。諸藥成方，共奏鎮(zhèn)肝熄風(fēng)之效。在前期研究中本課題組發(fā)現(xiàn)，熄風(fēng)解痙湯聯(lián)合尼莫地平能夠有效改善早期SAH患者的腦血流，平衡腦灌注，改善腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量，改善預(yù)后[9]。

因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路及其下游凋亡蛋白為切入點(diǎn)，探討熄風(fēng)解痙湯治療SAH的保護(hù)作用機(jī)制，為SAH后EBI的治療提供新思路和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性SD大鼠168只，體質(zhì)量250～300 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002，在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)2周，嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境，溫度（25±1） ℃，濕度保持50%±10%，12 h/12 h循環(huán)光照。嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)原則進(jìn)行動(dòng)物研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及流程均經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：IACUC-20210725-18。

1.2" 主要藥物與試劑

熄風(fēng)解痙湯配伍：懷牛膝30 g、龍骨（先煎）30 g、牡蠣（先煎）30 g、赭石（先煎）20 g、龜甲（先煎） 15 g、白芍15 g、天麻10 g、玄參15 g、天門冬15 g、川楝子9 g、茵陳9 g、生麥芽13 g、川芎10 g、炙甘草9 g。藥物均由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，上述藥物浸泡1 h，采用自動(dòng)煎藥機(jī)煎藥，每劑煎煮兩次，第一次煎煮30 min，第二次煎煮20 min，濾出合并藥液約400 mL，經(jīng)物理的方法將水煎劑濃縮至含原生藥量0.575 g/mL，經(jīng)120 ℃、400 kPa下消毒25 min，冷卻后密封包裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｄ崮仄狡ò荻t(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字H20003010，批號(hào)：2109007，規(guī)格：30 mg/片）。

TUNEL檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號(hào)：E-CK-A331）；兔源性Caspase-12抗體、GRP78抗體、CHOP抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號(hào)：AF51250、AF5366、AF5280）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：PC0020）；HE染色液（湖南艾佳生物科技股份有限公司，批號(hào)：P041IR）。

1.3" 主要儀器

光學(xué)顯微鏡（德國徠卡儀器有限公司，型號(hào)：DM4000）；高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H2050R）；全自動(dòng)多功能分析儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號(hào)：Triiogy]；電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)：1645050、Mini-Trans Blot]；PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：Q2000B）；電子天平（上海全福實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：MS205DU）；光凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：WD-9413B）。

1.4" 分組、造模及給藥

SPF級(jí)成年健康雄性SD大鼠168只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、熄風(fēng)解痙湯低劑量組、熄風(fēng)解痙湯高劑量組、尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組，每組24只，并進(jìn)行編號(hào)。除對(duì)照組、假手術(shù)組外，其余各組進(jìn)行SAH模型造模。

采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH模型[10]：除對(duì)照組外，其余各組通過腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉，麻醉成功后仰臥固定至手術(shù)板上，75%乙醇消毒頸部皮膚，作頸部正中切口，分離暴露右側(cè)頸部動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，將4-0尼龍線頭從頸外動(dòng)脈殘端插入右頸內(nèi)動(dòng)脈，直至刺破頸內(nèi)動(dòng)脈末端分叉處。假手術(shù)組大鼠僅在手術(shù)操作過程中將尼龍線頭端送至右頸內(nèi)動(dòng)脈，但不刺破頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處[11]。SAH模型肉眼觀可見大鼠大腦表面彌散分布積血，其中在腦底動(dòng)脈環(huán)、小腦延髓池及腦干腹側(cè)有大量積血存在；HE染色在蛛網(wǎng)膜下腔見到大量紅細(xì)胞，以此判定為造模成功[12]。

熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組予以不同濃度的熄風(fēng)解痙湯連續(xù)干預(yù)3 d，每12 h灌胃1次，給藥劑量計(jì)算方式參照《中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)》[13]中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方法部分。低劑量組、高劑量組以中劑量組的1/2倍、2倍劑量給藥，分別為10.8、43.2 g/（kg·d）[14]。空白組、假手術(shù)組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃，尼莫地平組予尼莫地平10 mg/（kg·d）灌胃治療[15]，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組予尼莫地平10 mg/（kg·d）及熄風(fēng)解痙湯21.6 g/（kg·d）灌胃治療實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)死亡的大鼠予以剔除并根據(jù)要求進(jìn)行補(bǔ)充。

1.5" 觀察指標(biāo)

1.5.1" 神經(jīng)功能評(píng)分" 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，在造模成功后6、12、24、48、72 h記錄各組大鼠Garcia神經(jīng)功能評(píng)分包括自主活動(dòng)、對(duì)稱性的四肢活動(dòng)、前肢伸展活動(dòng)、攀爬能力、本體感覺、胡須觸碰反射。最高18分，最低5分，得分越高，表明大鼠神經(jīng)功能受損程度越輕。

1.5.2" HE染色觀察海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)" 在造模后72 h，7組大鼠中隨機(jī)各取1只，麻醉生效后斷頭、完整取下腦組織。對(duì)照組和模型組在10%甲醛溶液中固定至少24 h，組織包埋在石蠟中，切成4 μm的切片，經(jīng)蘇木精初染5 min和伊紅復(fù)染4 min后，中性樹膠封片，行HE染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5.3" GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)水平檢測" 提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。將裂解物在4 ℃下以12 000 r/min，離心20 min（離心半徑8.5 cm），收集上清液，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，按照嚴(yán)格的抗原抗體反應(yīng)條件，分別添加GRP78、CHOP和Caspase-12一抗，稀釋比例分別為1∶1 000、1∶300和1∶300，在4 ℃下孵育過夜。次日，用PBST對(duì)PVDF轉(zhuǎn)膜3次、洗滌，孵育，以便在后續(xù)的ECL顯色反應(yīng)中能夠檢測到目標(biāo)蛋白。

1.5.4" 血腦屏障通透性檢測" 采用EB染色評(píng)估血腦屏障在SAH后的通透性變化[14]。將2% Evans染料（4 mL/kg）經(jīng)右側(cè)股靜脈緩慢注射，持續(xù)約2 min以上。1 h后用5%水合氯醛（7 mL/kg）將大鼠麻醉，經(jīng)心臟持續(xù)灌注0.9%氯化鈉溶液以去除血液中的Evans染料，灌注完成后斷頭取腦，在PBS緩沖液（pH 7.4）中放入腦組織，制備成勻漿，冷卻后以12 000 r/min離心20 min（離心半徑8.5 cm）。使用分光光度計(jì)測量上清液在620 nm處Evans染料的吸光度值。EB含量越高提示血腦屏障破壞、其通透性增加。

1.5.5" 腦組織含水量檢測" 造模成功后3、6、12、24、48、72 h檢測大鼠腦組織含水量。水合氯醛麻醉大鼠，頭部切斷，取出腦組織，并進(jìn)行稱量以獲取濕重?cái)?shù)據(jù)。每個(gè)腦組織樣本放置在100 ℃的烘箱中烘干7 h后，再次進(jìn)行稱量，可以得到腦組織樣本的干重。最后，計(jì)算腦組織的含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.5.6" 大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡檢測" 剝離各組大鼠海馬組織，生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚度5 μm），嚴(yán)格按照TUNEL凋亡試劑盒說明書標(biāo)記海馬組織中的凋亡細(xì)胞，在顯微鏡下觀察和收集圖像，并為每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率[16]。

1.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 各組大鼠Garcia神經(jīng)功能評(píng)分比較

與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，其余各組各時(shí)間點(diǎn)的Garcia神經(jīng)功能評(píng)分均降低（P＜0.05）；與模型組比較，用藥組各時(shí)間點(diǎn)的Garcia神經(jīng)功能評(píng)分均升高（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組在24、48、72 h的Garcia神經(jīng)功能評(píng)分均降低（P＜0.05），尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在12、24、48、72 h的Garcia神經(jīng)功能評(píng)分均升高（Plt;0.05）；與熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組比較，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組12、24、48、72 h的Garcia神經(jīng)功能評(píng)分均升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2" 各組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)比較

對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)組織各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞連續(xù)，細(xì)胞核數(shù)量正常；模型組海馬區(qū)組織各層紊亂變性；尼莫地平組大鼠海馬區(qū)組織各層結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞連續(xù)性、細(xì)胞核數(shù)量優(yōu)于模型組；熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)較模型組清晰；尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)較清晰，明顯優(yōu)于模型組、尼莫地平組及熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組。詳見圖1。

2.3" 各組大鼠腦組織細(xì)胞中GRP78、CHOP和Caspase-12表達(dá)水平比較

與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組和熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組在各時(shí)間點(diǎn)的GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，尼莫地平組在3、6、12、24、48 h時(shí)GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；72 h時(shí)，尼莫地平組GRP78蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），低于假手術(shù)組（P＜0.05），CHOP蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），高于假手術(shù)組（P＜0.05）。與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組和熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組在各時(shí)間點(diǎn)的Caspase-12蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在3、6、12 h時(shí)Caspase-12蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），在24、48、72 h時(shí)Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，用藥組各時(shí)間點(diǎn)的GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與尼莫地平組比較，熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組在6、12、24、48、72 h時(shí)GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組GRP78、CHOP蛋白在6、12、24、48 h的表達(dá)水平降低（P＜0.05），72 h時(shí)升高（P＜0.05），Caspase-12在6、12、24、48、72 h的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與熄風(fēng)解痙湯低劑量組比較，熄風(fēng)解痙湯高劑量組在6、12、24、48 h時(shí)Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組比較，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在6、12、24、48、72 h時(shí)GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。詳見表2—4，圖4。

2.4" 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性比較

與對(duì)照組比較，其余各組各時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量均升高（Plt;0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組和用藥組各時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量均升高（Plt;0.05）；與模型組比較，用藥組各時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量均升高（Plt;0.05）；與尼莫地平組比較，在6、12、24、48、72 h，熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組腦組織EB含量均降低（Plt;0.05），尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組腦組織EB含量均升高（Plt;0.05）；與熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組比較，在6、12、24、48、72 h，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組腦組織EB含量均升高（Plt;0.05）。詳見表5。

2.5" 各組大鼠腦組織含水量比較

與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組和熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組在各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均升高（P＜0.05）；尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在3、6 h腦組織含水量升高（P＜0.05），24 h腦組織含水量降低（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在48、72 h腦組織含水量升高（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在12、48、72 h腦組織含水量降低（P＜0.05）。與模型組比較，用藥組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均降低（P＜0.05）。與尼莫地平組比較，熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均升高（P＜0.05），尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組在6、12、24、48、72 h時(shí)腦組織含水量均降低（P＜0.05）。與熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組比較，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量均降低（P＜0.05）。詳見表6。

2.6" 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況比較

對(duì)照組、假手術(shù)組大鼠海馬組織細(xì)胞未見凋亡，模型組大鼠海馬區(qū)組織細(xì)胞可見大量細(xì)胞凋亡，呈棕褐色；尼莫地平組及熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組大鼠海馬區(qū)組織細(xì)胞凋亡數(shù)高于對(duì)照組，較模型組有所減少；尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組明顯減少。詳見圖3。

與對(duì)照組比較，其余各組各時(shí)間點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組與用藥組各時(shí)間點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05）；與模型組比較，用藥組各時(shí)間點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05），尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組各時(shí)間點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）；與熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組比較，尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組各時(shí)間點(diǎn)海馬組織細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）。詳見表7。

3 討論

SAH是神經(jīng)外科常見病、多發(fā)病，具有致死率高、致殘率高、患者預(yù)后差等特點(diǎn)，影響SAH預(yù)后的主要原因是腦血管痙攣和EBI。臨床研究表明，EBI是影響SAH患者預(yù)后的主要原因，臨床特點(diǎn)是缺氧缺血性腦損傷，病理生理學(xué)過程包括炎癥、線粒體功能障礙、細(xì)胞調(diào)亡等[17]，而細(xì)胞主要啟動(dòng)ERS。研究發(fā)現(xiàn)，ERS涉及多個(gè)信號(hào)通路的激活，包括未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)超負(fù)荷以及Caspase-12和CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[18]。ERS誘導(dǎo)GRP78、GRP94等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因子表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞的能力[19]。當(dāng)應(yīng)激持續(xù)存在或過于強(qiáng)烈時(shí)，ERS也能觸發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡機(jī)制，通過激活特定的凋亡通路，如Caspase-12和CHOP通路，來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78、CHOP、Caspase-12作為ERS的標(biāo)志蛋白，均有明顯增加的趨勢[21]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，尼莫地平組、熄風(fēng)解痙湯低劑量組、熄風(fēng)解痙湯高劑量組、尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組各組腦組織含水量下降，EB含量均升高。Evans藍(lán)進(jìn)入血管后與蛋白結(jié)合，正常狀態(tài)下不透過血腦屏障，當(dāng)血腦屏障通透性升高時(shí)EB含量升高[22]。腦水腫發(fā)生的主要原因是血腦屏障破壞。本研究結(jié)果顯示，模型組血腦屏障破壞，通透性增加，造成腦水腫，提示尼莫地平和熄風(fēng)解痙湯可以保護(hù)血腦屏障的完整，可減輕腦損傷，這可能為SAH的治療提供方向。血腦屏障主要由內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、基底膜等組成，是腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞彼此緊密連接，同時(shí)與周圍的周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等相互作用而形成的屏障系統(tǒng)，其中內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接是決定血腦屏障通透性的關(guān)鍵屏障，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接遭到破壞后會(huì)導(dǎo)致血腦屏障破壞，進(jìn)而損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)[23]。以往相關(guān)研究證實(shí)，SAH后會(huì)引起腦細(xì)胞凋亡，造成血腦屏障破壞[24]。本研究TUNEL染色結(jié)果顯示，模型組海馬組織細(xì)胞大量凋亡，而經(jīng)尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組干預(yù)后海馬組織細(xì)胞凋亡率降低，表明尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組可降低海馬組織細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而保護(hù)腦組織。根據(jù)本次研究結(jié)果，模型組大鼠海馬組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、GRP78、Caspase-12表達(dá)升高，而熄風(fēng)解痙湯低、高劑量組以及尼莫地平+熄風(fēng)解痙湯組大鼠海馬組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)降低，說明熄風(fēng)解痙湯可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，從而改善EBI。

綜上所述，SAH后大鼠存在ER介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，熄風(fēng)解痙湯能顯著減少ERS的發(fā)生，從而減少ER介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低SAH后大鼠血腦屏障通透性，降低腦組織含水量和海馬組織細(xì)胞凋亡，改善SAH后大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和預(yù)后。為SAH后EBI的治療提供新思路和靶點(diǎn)，有利于開展臨床轉(zhuǎn)化研究。

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