補血益母丸對氣血雙虛小鼠的毛發代謝組學研究

〔摘要〕 目的 探討補血益母丸對氣血雙虛小鼠的毛發代謝組學研究。方法 采用腹腔注射環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）及眼眶放血，建立氣血雙虛小鼠模型后，將動物分為模型組、補血益母丸低劑量組和補血益母丸高劑量組，另設正常組，并連續10 d對小鼠進行灌胃補血益母丸1.82、7.28 g·kg-1干預。通過氣相色譜飛行時間質譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，

GC-TOF-MS）技術對各實驗組小鼠的毛發進行分析，采用主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis， OPLS-DA）尋找并發現補血益母丸作用于氣血雙虛模型小鼠的差異代謝物。結果 毛發中有5個差異性代謝物與CTX致免疫低下型氣血雙虛證相關，主要涉及酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）和初級膽汁酸生物合成（primary bile acid biosynthesis）；經補血益母丸治療后代謝輪廓趨近正常組，有11個代謝物涉及3條代謝通路，推測補血益母丸對氣血雙虛證的治療作用可能通過調控氨基酸代謝有關。結論 本研究從毛發代謝組學角度為中醫氣血雙虛病癥及補血益母丸的干預提供了氨基酸代謝、膽汁酸代謝機制層面的解釋，部分揭示了補血益母丸益氣補血作用機制，為其臨床運用提供了一定理論依據。

〔關鍵詞〕 代謝組學；補血益母丸；氣血雙虛；氣質聯用；毛發代謝

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.06.008

Hair metabolomics study on Buxue Yimu Pill treating mice with

qi-blood deficiency

LIU Shijun， LU Yu'ai， HOU Shiyi， GE Yuying， XIA Bohou， XIE Mingxia*， LI Yamei*

College of Pharmacy/Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study Buxue Yimu Pill （BXYMP） treating mice with qi-blood deficiency based on hair metabolomics. Methods A mouse model of qi-blood deficiency was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide （CTX） and orbital bloodletting. After modeling， the animals were divided into model group， as well as low- and high-dose BXYMP groups which were intragastrically treated with BXYMP at doses of 1.82 and 7.28 g·kg-1 respectively for 10 consecutive days. Additionally， a normal group was set up for comparison. Gas chromatography time-of-flight mass spectrometry （GC-TOF-MS） was used to analyze the hair of mice from each experimental group. Principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least-squares discriminant analysis （OPLS-DA） were employed to discover and identify the differential metabolites in the mice with qi-blood deficiency after the treatment of BXYMP. Results Five differential metabolites in the hair were associated with CTX-induced immunodeficiency of qi-blood deficiency pattern， mainly involving tyrosine metabolism and primary bile acid biosynthesis; after treatment with BXYMP， the metabolic profile approached that of the normal group， with 11 metabolites involved in three metabolic pathways. It was speculated that the therapeutic effect of BXYMP on qi-blood deficiency pattern may be related to the regulation of amino acid metabolism. Conclusion This study explains the TCM pattern of qi-blood deficiency and the intervention of BXYMP on it in ways of the mechanisms of amino acid metabolism and bile acid metabolism from the perspective of hair metabolomics. It partially reveals the mechanism of action of BXYMP in supplementing qi and tonifying blood， providing a certain theoretical basis for its clinical application.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 metabolomics; Buxue Yimu Pill; qi-blood deficiency; gas chromatography time-of-flight mass spectrometry; hair metabolism

氣血雙虛為中醫證候名，是一種整體綜合的病證，由于失血過多、長期患病或者是年老體弱、精神壓力等原因，易造成人體氣血虧虛，從而加快機體對能量的消耗，增加新陳代謝的產物，造成亞健康狀態[1]。中醫理論認為“發為血之余”，毛發不僅具有儀表功能，又是體內氣血盛衰的外在標志。《雜病源流犀燭》曰：“毛發也者，所以為一身之儀表。”這種儀表含義的描述既概括了毛發的儀表功能，又反映了從儀表的外證探知機體的成熟；同時，毛發榮枯反映氣血的盛衰，至今仍然是臨床診療毛發疾病時最方便、最直觀的方法之一[2]。而且，給予益氣補血中藥干預調整氣血雙虛的代謝紊亂，可有效預防亞健康疾病的發生[3]。因此，從氣血雙虛誘導亞健康的最終內部表型產物（代謝產物）出發，以外證部位的毛發為對象，進行氣血雙虛病理機制中藥干預的現代醫學解釋是可行的[4]。

補血益母丸由當歸、黃芪、阿膠、益母草、陳皮5味中藥配伍而成，其中“當歸-益母草”為核心藥物。方中當歸性溫味甘辛，善補血活血為君藥; 黃芪性溫味甘，善補中氣、益精血、通暢血液；阿膠味甘性平，善養陰、止血，為補血要藥，二者益氣養血，能增強君藥之功用，故為臣藥。陳皮性溫味苦，常溫胃、祛寒、理氣健脾；益母草性微寒味苦，具有活血化瘀的功效，與陳皮共作為佐藥[5]。全方兼具補益氣血、祛疲生新雙重功效，主要用于氣血雙虛兼血瘀證產后腹痛。劉海燕等[6]學者發現，補血益母復方在治療供血不足方面有較好的療效，適用于氣虛血瘀引起的貧血，且能顯著改善貧血癥狀，為治療供血不足的有效藥物。現代藥理研究表明，補血益母丸具有補氣、補血、抗炎、免疫調節、子宮修復、改善血液循環代謝等藥理作用[7]。然而，補血益母丸對氣血雙虛的作用機制仍不明確。因此，明確補血益母丸的作用機制，有助于完善補血益母丸的理論研究，為其臨床合理用藥提供科學依據。

代謝組學是一種適合復雜體系的研究手段[8]，從整體角度詮釋生物體內在的變化狀態[9]。中藥代謝的內環境是一個動態過程與代謝組學研究特點相符合，因此，代謝組學對于揭示中藥的代謝模式具有獨特的優勢[10]。本研究區別其他的傳統生物樣本，使用頭發作為代謝樣本，可用于長期和回顧性地測定外來生物暴露和內源性擾動并且與中醫“發為血之余”的理論相吻合。與代謝物停留時間有限的傳統標本相比，頭發作為一種生物生長器在樣品穩定性方面具有優勢，可以進行“從天到年”的測量，并且易于收集、運輸和存儲[11-12]。

為了進一步明確補血益母丸治療氣血雙虛證的代謝標志物及代謝通路，本研究基于氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry， GC-TOF-MS）對氣血雙虛模型小鼠及補血益母丸干預小鼠的毛發樣本進行測定。采用主成分分析法（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis， OPLS-DA）篩選差異性代謝物。探討補血益母丸對氣血雙虛模型小鼠的調節作用及其可能機制，為氣血雙虛的病理及補血益母改善氣血雙虛提供理論依據。

1 材料與方法

1.1" 動物

40只昆明小鼠，動物許可證編號：SCKK（湘）2016-0002，雄性，體質量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（動物倫理批準號：HN-LL-KY-2016-004-01）。所有小鼠均自由飲食飲水，適應性喂養1周。

1.2" 藥物

補血益母丸（批號：20181205，規格：12 g×10袋，湖南株洲千金藥業股份有限公司）；環磷酰胺（批號：18091225，規格：0.2 g/瓶，江蘇盛迪醫藥有限公司）。

環磷酰胺配制成濃度為10.00 mg·mL-1的溶液，補血益母丸配制成91.00 mg·mL-1和364.00 mg·mL-1的混懸液，均用生理鹽水作為溶劑配制。

1.3" 試劑及儀器

甲醇（德國CNW Technologies GmbH公司，批號：67-56-1）；氯仿、吡啶（阿達瑪斯試劑中國公司，批號：67-66-3、110-86-1）；氫氧化鉀、濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：1310-58-3、7664-93-9）；甲氧銨鹽（東京化成工業株式會，批號：593-56-6）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技公司，批號：103616-89-3）；飽和脂肪酸甲酯（德國Dr. Ehrensto？鄄rfer公司，批號：TRC-A144890）；氣相色譜、PEGASUS HT、質譜儀、色譜柱[美國Agilent公司，型號：7890A、8890、LECO、DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）]；離心機、超低溫冰箱（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Heraeus Fresco17、Forma 900 series）；分析天平（德國賽多利斯公司，型號BSA124S-CW）；研磨儀（上海凈信科技有限公司，型號：JXFSTPRP-24）；純水儀（安徽石澗科技有限公司，型號：明澈D24 UV）；超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司，型號：PS-60AL）；烘箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHG-9023A）；真空干燥儀（太倉市華美生化儀器廠，型號：LNG-T98）。

1.4" 方法

1.4.1" 氣血雙虛小鼠模型的建立" 根據本課題組前期研究[5]，建立動物模型。通過小鼠眼眶放血和經腹腔注射環磷酰胺建立氣血雙虛模型。經血常規分析確認造模成功小鼠，將30只已造模好的小鼠隨機分為模型組和補血益母丸高、低劑量組，每組10只。根據人-小鼠體表面積劑量換算得到小鼠給藥劑量。補血益母丸低、高劑量組分別給予1.82 g·kg-1（等效劑量的1/2）和7.28 g·kg-1（等效劑量的2倍）的劑量灌胃[13]；正常組與模型組給予10 mL·kg-1生理鹽水灌胃，連續灌胃10 d。給藥結束后，取小鼠后頸毛發，并用2 mL超純水和2 mL甲醇洗滌兩次置于2 mL EP管中，-80 ℃保存[14]。本模型建立成功相關的指標及補血益母丸的干預作用具體見本課題組前期文章[5]。

1.4.2" 毛發樣品前處理" 取樣本（10 ±1） mg于2 mL EP管中，加入1 mL 1 mol/L的氫氧化鉀溶液，渦旋30 s后放入54 ℃烘箱孵育23 h；冷卻室溫后，加入84 μL 9 mol·L-1的硫酸溶液，渦旋30 s；將樣本在4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，轉移上清液于2 mL EP管中，提取物在真空濃縮器中干燥；向干燥好的樣本中加入1 mL 70%的甲醇溶液，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s后，冰水浴超聲25 min；將樣本4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；移取900 μL上清液于5 mL EP管中，再加入900 μL氯仿，渦旋30 s；將樣本振蕩20 min[15]；小心移取下層溶液600 μL，每個樣本各取100 μL混合成QC樣本；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入40 μL甲氧胺鹽試劑，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；向每個樣品中加入50 μL BSTFA，將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL飽和脂肪酸甲酯；然后通過GC-TOF-MS對所有樣品進行分析。

1.4.3" GC-TOF-MS數據采集" 使用GC-TOF-MS進行數據采集。該系統使用DB-5MS毛細管柱。進樣量1 μL，He為載氣，前部入口吹掃流量為3 mL·min-1，氣體流速為1 mL·min-1。溫度程序：初始溫度50 ℃1 min；10 ℃·min-1，50～310 ℃；然后在310 ℃下保持8 min。注入、傳輸線和離子源溫度分別為280、280、250 ℃。在電子碰撞模式下，能量為70 eV。溶劑延遲6.25 min，在質譜掃描范圍為50～500 m/z下獲得質譜數據。

1.4.4" 數據分析" 使用ChromaTOF軟件對質譜數據進行了峰提取、基線矯正、峰對齊等分析。通過LECO-Fiehn Rtx5數據庫對物質定性。最后，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD＞30%的峰剔除[16]。經過內標的歸一化后將得到的數據矩陣導入SIMCA15.0.2統計軟件進行PCA以及OPLS-DA。根據VIP篩選差異代謝物，并利用單變量統計分析方法的t檢驗，顯著性水平設為P＜0.05。利用PubChem和KEGG生物學數據庫進行生物標志物的通路富集分析。

2 結果

2.1" GC-TOF-MS圖譜

對正常組、模型組、補血益母丸高低劑量組的共40例小鼠毛發樣本進行GC-TOF-MS分析，從中提取724個峰并對原始數據中的缺失值進行模擬，數值模擬方法為最小值二分之一法進行填補。數據標準化利用內標進行歸一化。經過預處理后671個峰被保留，不同的顏色代表不同組別，結果顯示（圖1）得到總離子流色譜圖的趨勢比較相似，證明重復性好，結果可靠。

2.2" QC驗證

在物質提取、檢測分析過程中會有系統誤差，導致QC樣品間存在差異。差異越小說明整個方法穩定性越好數據質量越高。本次實驗抽取了5份QC樣品數據用于評估實驗的可重復性和儀器穩定性。對5份QC樣本進行PCA分析，如圖2所示：其散點圖分布較集中，說明整個實驗儀器的穩定性較好，誤差小，實驗的數據是穩定可靠的。并且內標在QC樣品中峰面積的RSD為4.49%，RSD≤30%說明儀器數據采集穩定。

2.3" 多元變量數據分析

對得到代謝物數據進行PCA分析，建立模型參數R2X＝0.77，Q2＝0.596，模型分析了77%的原始數據，累計貢獻率為56.9%。如圖3所示，樣品集中分布于散點圖的橢圓內，證明模型擬合效果較好。正常組和模型組兩組間有分離趨勢，但存在部分交叉重疊。補血益母丸高劑量組和補血益母丸低劑量組分布在模型組和正常組之間，表明經藥物治療后，補血益母丸能夠顯著改善模型組代謝物水平趨向于正常發展。

為了獲得更高水平的群體分離，篩選補血益母丸組治療氣血雙虛的可能機制，應用了OPLS-DA進一步對組間進行分析處理，如圖4A所示，模型組與正常組顯著的位于兩側，說明兩者代謝組數據之間存在顯著差異。建立的模型解釋能力參數R2X預測能力參數Q2分別為 0.983、0.934，說明該模型具有較好區分能力以及預測能力。如圖4C所示，模型組和補血益母丸高劑量組也能完全區分，說明給藥后機體內源性代謝物發生顯著變化。其模型解釋能力參數R2Y、預測能力參數Q2分別為0.996，0.980。如圖4E所示，模型組較補血益母丸低劑量組比較，其模型解釋能力參數R2X、預測能力參數Q2分別為0.986、0.968。200次置換檢驗結果也顯示該模型有效，模型組與正常組模型組R2和Q2的截距分別為0.703、-1.150，補血益母高劑量R2和Q2的截距分別為0.795、-0.989，模型組較補血益母丸低劑量R2和Q2的截距分別為0.434、-0.943，均可用于其差異標志物的篩選。

2.4" 潛在代謝標志物確定

確認模型可進行差異代謝物篩選后，進一步對差異的標志代謝物進行篩選，以解釋補血益母丸治療氣血雙虛的機制，在OPLS-DA模型進行關鍵變量分析，使用P＜0.05、VIP＞1的原則，對篩選的差異代謝物進行顯著性檢驗，篩選得到的變量被認為與氣血雙虛有潛在關聯。與正常組相比，模型組小鼠毛發中的對苯二甲酸、二十四碳烷含量顯著下調，香草酸、糞甾烷酸、3，4-二羥基扁桃酸含量顯著上調，這5種物質可能為氣血雙虛小鼠毛發潛在代謝標志物，見表1。在模型組與補血益母丸高、低劑量組中，異亮氨酸、脫氫莽草酸、二十四（碳）烷、（S）-甘露醇酸、2，4，6-三羥基二苯甲酮含量顯著上升。香草酸、環亮氨酸、三甲基賴氨酸、皮質酮2、2-脫氧-D-半乳糖2、酪胺含量顯著下調，這11種物質可能為補血益母丸對氣血雙虛小鼠毛發代謝機制潛在標志物，見表2—3。

將篩選差異代謝物的結果以火山圖的形式進行可視化，結果如圖5A、C、E所示，散點顏色代表最終的篩選結果，紅色表示顯著上調的代謝物，藍色表示顯著下調的代謝物，灰色為非顯著差異的代謝物。并分別對正常組與模型組，模型組與補血益母丸高低劑量組的差異代謝物進行ROC曲線分析反應標志物的靈敏度和可靠度，結果如圖 5B、D、F所示，ROC曲線靠近左上角，即靈敏度越高，誤判率越低，曲線下面積AUC均接近1，表現出較好的分類效果。模型組與正常組敏感度為87.5%，特異性為73.3%；模型組與補血益母丸高劑量組敏感度為70%，特異性為84%；模型組與補血益母丸低劑量組敏感度為85%，特異性為78.3%。

2.5" 潛在生物標記物層次聚類分析

層次聚類分析將具有相同特征的代謝物歸為一類，發現代謝物在不同組間的變化特征。對差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣（euclidean distance matrix），將差異代謝物進行聚類以熱圖進行可視化，如圖6所示。正常組和模型組中差異標志物含量水平能夠明顯區分，模型組與給藥組也能明顯區分。該熱圖能夠反映出不同組分之間可能存在的生物標記物的變化情況。

2.6" 差異代謝物的代謝通路分析

對差異代謝物進一步代謝通路分析，找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。將代謝差異物輸入KEGG、PubChem等權威代謝物數據庫進行映射，對應物種的通路數據庫進行搜索和代謝通路分析。將代謝通路分析的結果以氣泡圖進行可視化，這些差異代謝途徑的顯著性由P值和富集因子決定的，氣泡較大、顏色較深的代謝途徑越為顯著，如圖7A所示，大鼠造模后共5個差異代謝物參與了2條不同的代謝通路，為酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）和初級膽汁酸生物合成（primary bile acid biosynthe？鄄sis）。由此可知，經環磷酰胺造模后，小鼠機體發生紊亂，主要集中于氨基酸代謝和膽汁酸合成。如圖7B所示，經補血益母丸治療后的11個差異代謝物參與了3條代謝途徑，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（valine， leucine and isoleucine biosynthesis）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（valine， leucine and isoleucine degradation）、氨酰基tRNA生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）。結果表明，經補血益母丸治療后，體內的代謝紊亂得到改變，主要集中在氨基酸代謝。

3 討論

本實驗采用放血和注射環磷酰胺建立了有中醫藥特色的氣血雙虛小鼠模型，其氣血雙虛狀態的持續時間相對較長，有利于中藥藥效的表達[17]。當前對氣血雙虛發病機制的研究主要集中在基因多態性和基因表達差異等方面。但是，中醫氣血雙虛是先天遺傳和后天環境共同影響的結果，單靠基因的差異無法全面解釋其發生的分子機制[18]。本研究采用GC-TOF-MS聯合模式識別和統計分析方法，基于代謝組學對氣血雙虛小鼠的毛發內源性代謝物及補血益母丸對氣血雙虛的內在分子機制進行初步探索。

代謝組學研究結果顯示，氣血雙虛證小鼠體內受較大擾動的代謝通路初級膽汁酸生物合成和酪氨酸代謝。膽汁酸是膽固醇在肝臟分解代謝的產物，初級膽汁酸是由肝中膽固醇經肝細胞通過多步酶促反應合成的[19]，初級膽汁酸生物合成通路中主要的代謝差異物為5-β-膽堿-3α，7α，12α-三醇（5-β-Cholestane-3α，7α，12α-triol）。其是肝臟中初級膽汁酸、鵝去氧膽酸和膽酸生物合成的中間體[20]。血虛時，人體血糖下降，為補充機體所需能量，膽汁酸合成增多，促進脂肪的分解，緩解血虛時的血糖下降。因此，在模型組中初級膽汁酸生物合成通路中代謝差異物5-β-膽堿-3α，7α，12α-三醇上調。結果說明初級膽汁酸生物合成與氣血雙虛證患者的心悸、頭暈、免疫功能紊亂疾病相關[21]。

氨基酸是人體內起著非常關鍵的作用的物質，它不僅是構成蛋白質的基本單元，而且還是多種重要含氮化合物的前驅體。酪氨酸（L-tyrosine）是一種非常重要的營養必需氨基酸，在人體和動物的新陳代謝、生長發育中發揮著非常關鍵的作用，還具有調節情緒和刺激神經系統的作用，此外還有幫助加快體內新陳代謝，治療慢性疲勞等疾病的功效[22]。酪氨酸代謝通路中主要的差異代謝物為3，4-二羥基扁桃酸（3，4-Dihydroxymandelic acid， DHMA），DHMA是一種有效的抗氧化劑和自由基清除劑。DHMA在酪氨酸代謝中是去甲腎上腺素的代謝產物，而左旋酪氨酸產生的左旋3，4-二羥基苯丙氨酸（左旋多巴）可以增加兒茶酚胺（多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素）的合成和釋放[23]。模型組中DHMA水平高于正常組，導致其上游代謝物腎上腺素水平增加。腎上腺素分泌增多可見焦慮不安、面色蒼白、弦暈、出汗、四肢發冷、無力、心悸，短時的血乳酸或血糖升高等。而氣血雙虛人群活動時會出現多汗、氣短、乏力、四肢發冷的表現，與腎上腺素分泌增多的表現相似。結果提示酪氨酸代謝與氣血雙虛證患者的失血過多久病過勞或年老體衰精神緊張負性情緒密切相關。

經補血益母丸治療后，氣血雙虛證小鼠體內受較大擾動的代謝通路為氨基酸代謝。氨基酸可以利用自身及其代謝產物，對機體的生命活動和細胞基因表達的信號轉導、免疫、抗氧化、抗應激等進行調控，對神經和內分泌產生影響，這些調節影響著生長發育、生產以及健康狀況[24-25]。異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，主要在肌肉中分解代謝。異亮氨酸（isoleucine）是蛋白質和葡萄糖代謝的調節器，也是維持淋巴細胞敏感性與免疫細胞功能所必需的功能物質[26]，經給與補血益母丸后異亮氨酸水平上調，說明促進其維持機體各免疫細胞的功能，從而增強機體免疫力。以上結果表明，補血益母丸治療氣血雙虛可能與調節氨基酸代謝相關，通過改善氣血雙虛患者氨基酸代謝，進而調節機體免疫力恢復氣血平衡。

本研究以GC-TOF-MS代謝組學技術分析在小鼠毛發中潛在的生物標志物，結果顯示氣血雙虛改變了機體的氨基酸代謝、膽汁酸代謝等，經補血益母丸治療后，部分代謝物水平向正常組靠攏。因此，推測補血益母丸主要通過改善肝功能、抗氧化損傷和調節機體免疫等途徑改善氣血雙虛。綜上所述，補血益母丸可能通過回調氨基酸代謝紊亂從而發揮對氣血雙虛的調節作用。同時，提高小鼠免疫功能來發揮治療氣血雙虛證的作用。特別是纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝有關，這為后續從代謝水平闡釋補血益母丸治療氣血雙虛的生物學機制奠定了實驗基礎。但由于人體內氨基酸代謝復雜多樣，尚有很多未涉及的氨基酸代謝通路，未來尚需進一步深入研究。

參考文獻

[1] 畢建璐. 補中益氣丸干預氣虛質的臨床觀察及其血漿代謝組學機制研究[D]. 廣州： 南方醫科大學， 2014.

[2] 劉先利， 劉寶利. 基于中醫古籍文獻探討血虛證病因、癥候及治則治法[J]. 北京中醫藥， 2020， 39（3）： 262-265.

[3] 劉" 芳， 張" 勝. 疏肝養血法治療斑禿的研究概況[J]. 中醫臨床研究， 2019， 11（32）： 139-142.

[4] 張文卓， 董" 慧， 黃曉巍. 血虛證中醫藥研究進展[J]. 中國當代醫藥， 2013， 20（1）： 16-18.

[5] 李亞梅， 賓雨飛， 夏伯候， 等. 補血益母丸對氣血雙虛模型小鼠的藥效作用研究[J]. 中藥藥理與臨床， 2020， 36（3）： 158-164.

[6] 劉海燕， 金季玲， 張士表， 等. 補血益母顆粒治療功血的臨床觀察[J]. 光明中醫， 2013， 28（3）： 515-516.

[7] 吳夢瑤， 張" 鵬， 龔" 云. 補血益母丸/顆粒化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2022， 42（6）： 1037-1043.

[8] 劉" 萍， 王" 平， 陳" 剛， 等. 應用代謝組學探討中醫藥復雜理論體系的研究思路和方法[J]. 中華中醫藥雜志， 2011， 26（5）： 993-998.

[9] WANG M， CHEN L， LIU D， et al. Metabolomics highlights pharmacological bioactivity and biochemical mechanism of traditional Chinese medicine[J]. Chemico-Biological Interactions， 2017， 273： 133-141.

[10] 黃曉晨， 宿樹蘭， 郭建明， 等. 代謝組學在中醫藥若干科學問題研究中的應用與思考[J]. 中草藥， 2014， 45（2）： 147-153.

[11] CAPLAN Y H， GOLDBERGER B A. Alternative specimens for workplace drug testing[J]. Journal of Analytical Toxicology， 2001， 25（5）： 396-399.

[12] CHANG W C， WANG P H， CHANG C W， et al. Extraction strategies for tackling complete hair metabolome using LC-HRMS-based analysis[J]. Talanta， 2021， 223（Pt 1）： 121708.

[13] 李亞梅， 賓雨飛， 夏伯候， 等. 基于氣質聯用技術的補血益母丸治療氣血兩虛小鼠的代謝組學研究[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2021， 41（1）： 53-60.

[14] YANG Y， YIN Y Q， TANG X L， et al. Evaluating different extraction approaches for GC-MS based metabolomics analysis of the giant pandas' fur[J]. Toxics， 2022， 10（11）： 688.

[15] DELPLANCKE T D J， DE SEYMOUR J V， TONG C， et al. Analysis of sequential hair segments reflects changes in the metabolome across the trimesters of pregnancy[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）：36.

[16] DUNN W B， BROADHURST D， BEGLEY P， et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J]. Nature Protocols， 2011， 6（7）： 1060-1083.

[17] 田" 峰， 張" 蕻， 任連生. 加味當歸補血顆粒對環磷酰胺的骨髓抑制及荷瘤小鼠免疫功能的影響[J]. 中國藥物與臨床， 2004， 4（6）： 445-448.

[18] 肖" 雅. 桂附地黃丸干預陽虛體質的臨床觀察及血漿代謝組學機制研究[D]. 廣州： 南方醫科大學， 2015.

[19] 居永慧， 姚衛峰， 張" 麗. 膽汁酸代謝在中藥研究中的應用進展[J]. 中國中藥雜志， 2020， 45（10）： 2360-2367.

[20] FURSTER C， WIKVALL K. Identification of CYP3A4 as the major enzyme responsible for 25-hydroxylation of 5beta-cholestane-3alpha， 7alpha， 12alpha-triol in human liver microsomes[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1999， 1437（1）： 46-52.

[21] 唐曉波. 再生障礙性貧血中醫證候分析[D]. 北京： 北京中醫藥大學， 2007.

[22] ZHENG P， CHEN J J， HUANG T， et al. A novel urinary metabolite signature for diagnosing major depressive disorder[J]. Journal of Proteome Research， 2013， 12（12）： 5904-5911.

[23] 李" 超， 鞠建慶， 潘文慧， 等. 基于血清代謝組學的高血壓病中醫證型代謝模式差異分析[J]. 中華中醫藥雜志， 2021， 36（9）： 5515-5520.

[24] XIA Z， CHOLEWA J M， ZHAO Y， et al. A potential strategy for counteracting age-related sarcopenia： Preliminary evidence of combined exercise training and leucine supplementation[J]. Food amp; Function，2017， 8（12）： 4528-4538.

[25] CEMIN H S， TOKACH M D， WOODWORTH J C， et al. Branched-chain amino acid interactions in growing pig diets[J]. Translational Animal Science， 2019， 3（4）： 1246-1253.

[26] LES I， DOVAL E， GARC？魱A-MART？魱NEZ R， et al. Effects of branched-chain amino acids supplementation in patients with cirrhosis and a previous episode of hepatic encephalopathy： A randomized study[J]. The American Journal of Gastroenterology， 2011， 106（6）： 1081-1088.