尿石素A 對小鼠異氟醚麻醉所致術后認知功能障礙的改善作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討尿石素A （UA） 對長時程異氟醚麻醉所致小鼠術后認知功能障礙 （POCD）的改善作用，并闡明其可能的作用機制。方法：24只健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為空白對照組、麻醉組和UA 組，每組8 只。UA 組小鼠于麻醉前2 d 每天腹腔注射200 μL UA 溶液，空白對照組和麻醉組小鼠給予等體積生理鹽水，麻醉組和UA 組小鼠制備長時程異氟醚麻醉模型，空白對照組小鼠不作處理。采用Y 迷宮實驗檢測各組小鼠輪替正確率、移動距離和移動速度，條件恐懼實驗檢測各組小鼠僵直時間百分率，Western blotting 法檢測各組小鼠海馬組織中白細胞介素（IL） -1β、IL-10 和成熟腦源性神經營養因子（mBDNF）蛋白表達水平。結果：Y迷宮實驗，與空白對照組比較，麻醉組小鼠輪替正確率明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠輪替正確率明顯升高（Plt;0. 01）。條件恐懼實驗中情境記憶測試，與空白對照組比較，麻醉組小鼠僵直時間百分率明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠僵直時間百分率明顯升高（Plt;0. 05）；線索記憶測試，各組小鼠僵直時間百分率比較差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。Western blotting 法，與空白對照組比較，麻醉組小鼠海馬組織中IL-1β蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01），IL-10 和mBDNF 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠海馬組織中IL-1β 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10 和mBDNF 蛋白表達水平明顯升高 （Plt;0. 05或Plt;0. 01）。結論：UA可以改善小鼠的POCD，其作用機制可能與UA的抗炎活性可抑制POCD 小鼠的中樞炎癥且上調mBDNF 蛋白表達有關。

［關鍵詞］ 尿石素A； 異氟醚； 術后認知功能障礙； 白細胞介素； 腦源性神經營養因子

［中圖分類號］ R742 ［文獻標志碼］ A

術后認知功能障礙（postoperative cognitivedysfunction， POCD） 的發生與手術創傷和全身麻醉有關。研究［1-2］ 顯示：長時間暴露于揮發性麻醉藥會損害老年患者的神經認知能力。對嚙齒動物的研究［3］ 表明： 長時程麻醉會導致認知功能障礙，長期暴露于麻醉中會對動物認知功能產生不可逆轉的影響。異氟醚是使用最為廣泛的吸入麻醉劑之一， 已被證實會損害患者認知功能［4］。鞣花酸（ellagic acid， EA） 是鞣花單寧（ellagitannin，ETs） 的一種水解產物，在石榴、漿果和堅果中含量豐富［5］。人體對EA 和ETs 的吸收較差，但EA 和ETs 會被腸道微生物群進一步代謝，產生尿石素。尿石素A （urolithin A，UA） 是人體內可被觀察到的腸道菌群主要代謝產物，可以通過血腦屏障［6］。近年來，UA 作為一種天然分子，因其具有抗衰老、抗細胞凋亡和神經保護活性而受到廣泛關注［5］。研究［7］ 顯示：UA 能夠促進線蟲有絲分裂、延長線蟲壽命和提高嚙齒類動物肌肉功能。UA 在體外和體內均具有抗炎和抗氧化特性［5］。飲食中補充UA 可以緩解阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease， AD）模型小鼠在空間學習記憶、聯想學習和探索行為方面表現出的認知障礙［8］。目前關于UA 改善POCD模型小鼠認知功能障礙的作用尚未完全闡明。本研究構建POCD 模型小鼠，探討UA 通過抑制中樞炎癥改善小鼠的認知功能，并闡明其可能的分子作用機制，為臨床優化POCD 治療方案提供新的策略。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 、藥物 、主要試劑和儀器

雄性C57BL/6J 小鼠24 只， 8 周齡， 體質量20～25 g，購自南京大學模型動物研究中心。所有動物分組飼養，適應環境2 周以上，可自由進食。實驗動物生產許可證號：SCXK （浙） 2019-0004。動物房間維持在標準的12 h 光/暗周期，溫度（23±1） ℃和濕度50%～60%。本研究經南京大學實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號： 2020AE01110）， 所有動物實驗均符合《實驗動物護理和使用指南》的要求， 所有實驗程序均按照歐盟關于動物實驗的第2010/63/EU 號指令進行。異氟醚購自山東魯南貝特制藥有限公司， UA 購自上海 Standard 公司。RIPA 裂解液（貨號：P0013B） 購自上海碧云天生物技術有限公司， 蛋白酶和磷酸酶抑制劑購自美國Thermo Fisher 公司， SDS- 聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophosesis， PAGE） （ 貨號： PG112） 和TBST （貨號： PS103） 購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司，兔抗成熟腦源性神經營養因子（mature brain-derived neurotrophic factor，mBDNF）（貨號：ab108319）、兔抗谷氨酸受體2B抗體（N-Methyl-d-Asprtate receptor-2B，NMDAR2B） （ 貨號： ab3856） 和兔抗白細胞介素（interleukin， IL）-1β （貨號： ab9722） 購自美國Abcam 公司，兔抗IL-10 （貨號：12163S） 和兔抗β -actin （貨號： 4970） 購自美國Cell Signaling 公司，羊抗兔IgG-HRP 二抗（貨號：BL003A） 購自北京蘭杰科技有限公司， 二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO） 和增強型化學發光液（enhacedchemiluminescence， ECL） 工作液（貨號： E412-02） 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。異氟醚揮發罐購自上海瑞曼信息科技有限公司，Y 迷宮為南京大學醫學院附屬鼓樓醫院麻醉科自制，條件恐懼研究系統Fear-Condition system 購自西班牙Panlab 公司，超低溫冰箱購自美國Thermo Fisher 公司，低溫冰箱購自安徽中科美菱公司，恒溫水浴槽購自美國Crystal SafeTemp 公司，核酸蛋白檢測分光光度計和蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad 公司。

1. 2 實驗動物造模和分組

C57BL/6J小鼠適應性飼養2 周后，按照隨機數字表法將小鼠隨機分為空白對照組、麻醉組和UA 組， 每組8 只。UA 溶于DMSO［6］，注射前使用生理鹽水進一步稀釋，終濃度為0. 5 g·mL－1。UA 組小鼠于麻醉前2 d 每天腹腔注射200 μL UA 溶液，空白對照組和麻醉組小鼠均給予等體積生理鹽水。麻醉組和UA 組小鼠置于含有5% 異氟醚的麻醉箱中誘導1 min，以2～3 L·min－1的流速于100% 氧氣中以1. 5% 異氟醚維持6 h。異氟醚暴露期間，使用麻醉監護儀連續監測小室中異氟醚濃度，空白對照組小鼠于相同環境下飼養但不進行麻醉處理。在麻醉期間，觀察小鼠的呼吸以判斷小鼠生命體征，防止出現呼吸抑制，并用加熱毯覆蓋箱子以維持小鼠的正常體溫，制備長時程異氟醚麻醉小鼠模型。小鼠生命體征正常即為造模成功。

1. 3 Y迷宮實驗檢測各組小鼠空間記憶能力

長時程異氟醚麻醉模型小鼠全身麻醉后第 3 天進行Y 迷宮實驗。Y 迷宮為長方體空間，由3 個相同的臂組成， 各臂之間的夾角為 120°， 分別為 A 臂、B 臂和C 臂。理論上具有良好空間記憶的小鼠進入Y 迷宮的新臂后， 不會立即探索先前訪問過的舊臂。實驗開始前，將小鼠置于Y 迷宮的中心，使其在迷宮中自由探索8 min，使用Any-mzae 軟件記錄小鼠進入每個臂的順序和次數。實驗檢測各組小鼠進入每個臂的次數、移動距離和移動速度。未重復的輪替探索順序，如ABC、BCA 和CAB，被定義為成功的輪替組合。儀器自動記錄輪替次數，計算小鼠輪替正確率。輪替正確率=未重復的輪替探索次數/總輪替探索次數×100%。

1. 4 條件恐懼實驗檢測各組小鼠恐懼記憶能力

長時程異氟醚麻醉模型小鼠全身麻醉后第3 天進行條件恐懼實驗。將小鼠置于25 cm×25 cm×25 cm 箱子中進行5 min 自由探索；然后接受4 kHz、90 dB 的聲音刺激28 s，聲音刺激結束后接受足部0. 8 mA 電擊刺激2 s。更換小鼠后，使用75% 乙醇擦拭箱子。第2 天進行情境記憶測試和線索記憶測試，檢測在實驗期間小鼠僵直和運動的時間。在情境記憶測試中，小鼠被放置于相同的房間內5 min，無聲音和電擊刺激；在線索記憶測試中，人為改變箱子內部隔板，小鼠暴露于相同的聲音刺激下，但無電擊刺激。采用PACKWIN 系統記錄小鼠僵直時間百分率。僵直時間百分率=測試時小鼠的僵直時間/總時間×100%。

1. 5 Western blotting法檢測各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-10和 mBDNF 蛋白表達水平

完成行為學測試后，對各組小鼠安樂死并取海馬組織，－80 ℃冰箱保存。小鼠海馬組織中加入RIPA 裂解液后勻漿，使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑防止降解。4 ℃離心， 收集上清。SDS-PAGE 上樣， 電泳后轉膜。5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST 溶液漂洗，加入一抗4 ℃過夜，兔抗IL-1β （1∶2 000）、兔抗IL-10（1∶2 000）、兔抗mBDNF （1∶1 000） 和兔抗β-actin（1∶20 000） 稀釋，漂洗3 次，加入羊抗兔IgG-HRP二抗（1∶20 000） 室溫搖床孵育2 h。ECL 工作液顯影并拍照。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 6 統計學分析 采用 SPSS 22. 0統計軟件進行

統計學分析，GraphPad 9. 0 軟件繪制圖像。各組小鼠Y 迷宮實驗輪替正確率、移動距離和移動速度，條件恐懼實驗各組小鼠僵直時間百分率，海馬組織中IL-1β、IL-10 和mBDNF 蛋白表達水平均符合正態分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組小鼠輪替正確率、移動距離和移動速度

與空白對照組比較，麻醉組小鼠輪替正確率明顯降低（Plt;0. 01），移動距離和移動速度差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。與麻醉組比較，UA 組小鼠輪替正確率明顯升高（Plt;0. 01）， 移動距離和移動速度差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見表1。

2. 2 各組小鼠僵直時間百分率

情境記憶測試結果顯示：與空白對照組比較，麻醉組小鼠僵直時間百分率明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠僵直時間百分率明顯升高（Plt;0. 05）。線索記憶測試結果顯示：各組小鼠僵直時間百分率比較差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。見表2。

2. 3 各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-10和mBDNF蛋白表達水平

與空白對照組比較，麻醉組小鼠海馬組織中IL-1β 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01），IL-10 和mBDNF 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與麻醉組比較，UA 組小鼠海馬組織中IL-1β蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10和mBDNF蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖1。

3 討 論

UA 可改善APP/PS1 雙轉基因小鼠突觸結構蛋白丟失和行為學層面的認知能力下降［9］。研究［10］ 顯示： UA 可促進哺乳動物海馬區的神經發生和認知功能改善，在口服UA 的AD 小鼠模型中，小鼠海馬區細胞凋亡減少。同時， UA 處理的APP/PS1 小鼠顯著增加了海馬區神經發生， 提示其具有對APP/PS1 小鼠學習和記憶的改善作用［5］。UA 具有神經保護作用，其機制可能與其對神經元凋亡、海馬神經發生、反應性膠質細胞增生和炎癥信號等多個過程的調控有關［6］。研究［11］顯示：UA 可以緩解糖尿病相關的認知障礙。在帕金森病小鼠模型中， UA 治療可以減少多巴胺能神經元的丟失，改善認知行為障礙和神經炎癥［12］。研究［13］ 顯示UA 對神經細胞有抗氧化和保護作用。UA 可降低脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 處理的促炎型小膠質細胞中一氧化氮（nitric oxide， NO） 水平，并降低腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor- α，TNF-α）、IL-6 和IL-1β 等細胞因子水平［14］。此外，UA 可抑制TNF-α 的產生和LPS 刺激的巨噬細胞極化［15-16］。以上研究結果均提示，UA 在體內和體外均具有抗氧化及抗炎的能力。本研究結果顯示：長時程異氟醚麻醉模型小鼠的輪替正確率和僵直時間百分率均明顯降低，提示小鼠海馬依賴性記憶功能明顯受損，小鼠POCD 模型制備成功。在線索記憶測試中，各組小鼠僵直時間百分率無明顯差異，提示小鼠的非海馬依賴性記憶能力無明顯損傷。因此，長時程異氟醚麻醉會導致小鼠認知功能下降，進而導致POCD。本研究結果顯示：長時程異氟醚麻醉前2 d， 腹腔注射UA 可以緩解小鼠麻醉后產生的認知功能障礙，與麻醉組比較，UA 組小鼠的輪替正確率和僵直時間百分率均明顯升高，提示UA 可改善小鼠長時程異氟醚麻醉引起的POCD。尿石素具有抗炎和抗氧化作用，其中UA 顯示出最強的抗炎活性［10，17］。本研究結果顯示： 小鼠腹腔注射UA 后，小鼠海馬組織中IL-1β蛋白表達水平明顯降低，IL-10 蛋白表達水平明顯升高， 提示UA 可能抑制神經炎癥，進一步改善POCD 小鼠的認知障礙。

腦源性神經營養因子（brain-derivedneurotrophic factor， BDNF） 是神經營養蛋白家族成員之一，其表達水平變化會影響神經元的生長、發育、分化和存活，也是突觸傳遞和突觸可塑性的主要調節因子［18-19］。BDNF 的成熟體mBDNF 在海馬長時程記憶形成的過程中發揮重要作用［20］。本研究結果顯示：與對照組比較，麻醉組小鼠海馬組織中mBDNF 蛋白表達水平明顯降低，給予UA 后，小鼠海馬組織中mBDNF 蛋白表達水平明顯升高。

綜上所述，UA 可以改善POCD 小鼠的認知功能障礙，其作用機制可能與UA 的抗炎活性可抑制POCD 小鼠的中樞炎癥且上調mBDNF 蛋白表達有關。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：許敏慧、程曉雷和夏天嬌參與文獻檢索、實驗設計、實驗數據分析及結果討論，許敏慧、許繼巖和江林昊參與實驗數據收集、分析及論文撰寫。

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[基金項目] 國家自然科學基金項目（82101636）