煙草黑脛病拮抗細(xì)菌的篩選與初步鑒定

摘"要：為了充分發(fā)揮煙草根際土壤中促生和防治病害微生物的作用，更好地實(shí)現(xiàn)煙草減肥減藥生產(chǎn)，對(duì)煙草黑脛病拮抗細(xì)菌進(jìn)行了篩選及鑒定。首先，利用稀釋涂布平板法及平板對(duì)峙法從煙草根際土壤中分離和篩選煙草黑脛病拮抗細(xì)菌，然后采用形態(tài)特征（菌落及革蘭氏染色）、生理生化特征及16S rDNA 基因序列對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，篩選出5株拮抗細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病菌抑菌率大小依次為JKXJ-1（64.4%）gt; JKXJ-5 （62.37%）gt; JKXJ-2（53.72%）gt; JKXJ-4（49.33%）gt; JKXJ-3（44.06%）。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)特征及16S rDNA 基因序列分析，初步鑒定5株拮抗細(xì)菌均為側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporu）。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛?。簧锓乐危晦卓梗粋?cè)孢短芽孢桿菌

0"引言

煙草黑脛病是一種嚴(yán)重的土傳性卵菌病害［1］，該病菌主要會(huì)導(dǎo)致煙株的根部和莖部發(fā)生病變，且在煙株的整個(gè)生育期都可發(fā)生，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。煙草黑脛病的防治方法包括植物誘導(dǎo)抗性、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)藥劑防治、生物防治等，其中化學(xué)防治普遍應(yīng)用，生物防治逐漸被重視［2］。

關(guān)于煙草黑脛病生物防治的報(bào)道很多，李小杰等［3］的研究表明，綠木霉菌、擬康寧木霉菌和近漸綠木霉代謝產(chǎn)物可以明顯抑制煙草黑脛?。恍焱龋?］研究認(rèn)為，木霉菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶對(duì)植物病原菌具有廣譜的拮抗作用。也有研究表明，假單胞桿菌不僅可以促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，而且對(duì)煙草黑脛病防治效果很好［5-6］。另外，對(duì)煙草黑脛病有防治作用的放線菌有鏈霉菌屬的波卓鏈霉菌［7］、婁徹鏈霉菌、魯薩鏈霉菌、高貴鏈霉菌、淡紫灰鏈霉菌等［8-10］。煙草黑脛病的生物防治具有高效、無(wú)毒、無(wú)殘留等特點(diǎn)，已經(jīng)成為煙草病害防治的研究熱點(diǎn)。拮抗菌株是生物防治研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)，為此，本研究進(jìn)行拮抗細(xì)菌菌株的篩選及鑒定，為煙草黑脛病的生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"供試材料

煙草黑脛病病原菌由貴州理工學(xué)院提供；試驗(yàn)用土壤樣品采自貴陽(yáng)近郊煙田；微生物培養(yǎng)基包括燕麥瓊脂培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、肉汁蛋白胨培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2"實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1"細(xì)菌的分離、純化

將90 mL無(wú)菌水和10 g 土壤樣品加入事先滅菌的100 mL 的三角瓶中；再放入搖床130 r/min 振蕩30 min，然后采用逐級(jí)稀釋法分別稀釋到10-4、10-5、10-6 g/mL。最后取不同濃度的稀釋液各100 μL，涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，重復(fù)3次；37 ℃培養(yǎng)48 h［11］，選單菌落NA平板劃線，確認(rèn)單菌落后移入試管斜面成純培養(yǎng)，作為供試菌株于4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2"拮抗細(xì)菌的篩選

選取煙草黑脛病病原菌長(zhǎng)勢(shì)良好的燕麥培養(yǎng)基平板，用直徑為5 mm打孔器選取菌落密集的1塊黑脛病菌塊，接入NA培養(yǎng)基平板的中心，在距離黑脛病菌塊24 mm左右兩側(cè)對(duì)稱接入待篩選菌塊，每個(gè)菌株重復(fù)3次，僅接種黑脛病菌塊平板作為對(duì)照。28 ℃ 倒置培養(yǎng) 3 d，觀察平板是否具有拮抗效果，并記錄具有拮抗作用菌株的抑菌圈直徑，按照公式（1）計(jì)算其抑制率。把接入兩側(cè)改為四周接種4個(gè)中心等距菌塊，其他的步驟同初篩一樣，進(jìn)一步復(fù)篩。

抑制率=（對(duì)照菌落直徑-試驗(yàn)菌落直徑）對(duì)照菌落直徑×100%（1）

1.2.3"拮抗菌株鑒定

（1）形態(tài)特征鑒定。將純化后的菌株接種于 NA 培養(yǎng)基上，觀察菌落的形態(tài)特征、生長(zhǎng)情況、表面光澤、色澤和透明度，并在顯微鏡下進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

（2）生理生化鑒定。根據(jù)拮抗細(xì)菌生理生化特征，進(jìn)行初步鑒定。主要的生理生化實(shí)驗(yàn)包括碳源利用試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵、接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽還原試驗(yàn)、氮源利用試驗(yàn)、明膠液化、V-P試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)等。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)常規(guī)鑒定方法［12-13］進(jìn)行菌株的初步鑒定。

（3） 分子生物學(xué)鑒定。（a）拮抗菌基因組DNA 提?。簩⒒罨玫霓卓咕鶭KXJ-1、 JKXJ-2、 JKXJ-3、 JKXJ-4、JKXJ-5，在37 ℃、150 r/min 條件下，LB 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24 h，然后取1 mL 菌液，以10 000 r/min 離心8 min，收集菌體，具體操作步驟見(jiàn)細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（NO.B518225-0050）的說(shuō)明書。（b）DNA序列測(cè)定：拮抗細(xì)菌PCR擴(kuò)增引物分別為：Seq foward5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′和Seq reverse，5′-CGCCABBBTTTTCCCAGTCACGAC-3′。擴(kuò)增體系，如表1所示。采用寶生物公司 16S rDNA 細(xì)菌鑒定 PCR試劑盒說(shuō)明書操作。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后，由北京六合華大基因科技有限公司重慶分公司完成測(cè)序。

（4）菌株分子鑒定。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用BLAST 對(duì)拮抗細(xì)菌序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性高的序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列，同屬菌株對(duì)應(yīng)序列為參比序列，利用MEGA 11 軟件，使用鄰位連接法（NJ）構(gòu)建拮抗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行菌株鑒定。

2"結(jié)果與分析

2.1"拮抗細(xì)菌的篩選結(jié)果

試驗(yàn)篩選5株拮抗細(xì)菌，其編號(hào)分別為JKXJ-1、JKXJ-2、JKXJ-3、JKXJ-4、JKXJ-5。各拮抗細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的抑制率分別為64.40%、53.72%、44.06%、49.33% 、62.37% ，其中有3株細(xì)菌對(duì)黑脛病的抑制率超過(guò)50%，抑制效果最好的菌株為JKXJ-1，抑制率為64.40%，各拮抗菌株的抑菌效果如圖1所示。

2.2"拮抗細(xì)菌菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

側(cè)孢短芽孢桿菌（B. laterosporus）細(xì)胞桿狀，（0.7～0.9）μm ×（ 3.0～5.0）μm，革蘭氏陽(yáng)性或可變，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，在膨大孢囊內(nèi)含橢圓形芽孢，菌落平、光滑［12-13］。

不同拮抗細(xì)菌菌落特征描述如表2所示，革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示。所得結(jié)果與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》描述基本一致。

2.3"拮抗細(xì)菌生理生化鑒定

側(cè)孢短芽孢桿菌：可耐 NaCl濃度（1%～7%），不分解淀粉，V-P陰性，接觸酶、氧化酶陽(yáng)性［12-13］。生理生化鑒定試驗(yàn)表明：5株拮抗菌株均可利用碳源、氮源，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，不能分解淀粉，硝酸還原、接觸酶、明膠液化陽(yáng)性，V-P陰性；在濃度分別為3%、7%、10%的NaCl中都能生長(zhǎng)。與側(cè)孢短芽孢桿生理生化特征基本一致，具體如表3所示。

3"結(jié)語(yǔ)

試驗(yàn)篩選出的 5株拮抗細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病菌的抑制率大小依次為JKXJ-1（64.40%）gt; JKXJ-5（62.37%）gt; JKXJ-2（53.72%）gt; JKXJ-4（49.33%）gt; JKXJ-3（44.06%）。革蘭氏染色、生理生化反應(yīng)特性及16S rDNA 基因序列分析試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株JKXJ-1、JKXJ-2、JKXJ-3、JKXJ-4、JKXJ-5均為側(cè)孢短芽孢桿菌。

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