甜櫻桃類鈣調蛋白基因家族的生物信息學分析

摘 要：類鈣調蛋白（CML）是植物生長發育過程中應對刺激的一種重要蛋白，基于甜櫻桃全基因組，利用生物信息學的方法對甜櫻桃CML基因家族成員進行鑒定，并對理化性質、染色體定位、基因結構、啟動子作用元件等進行分析。結果表明，PavCML家族有49個基因，不均勻的分布于1～8號染色體上，亞細胞定位在細胞質、葉綠體、細胞核等部位，啟動子順式作用元件分析發現PavCML家族基因響應多種元件。與轉錄組數據結合進行熒光定量PCR分析，結果顯示CML在裂果部位的相對表達量高，表明該基因可能參與裂果過程，為CML家族基因的功能鑒定提供理論依據。

關鍵詞：甜櫻桃；CML基因家族；生物信息學分析

中圖分類號： S662.5" 文獻標識碼： A

文章編號： 1002-2910（2024）02-0032-08

收稿日期：2024-02-19

基金項目：山東省重點研發計劃鄉村振興科技創新提振行動（2023TZXD059）；泰安市良種工程項目（2022NYLZ04）。

*通訊作者：魏國芹（1983-），女，山東曲阜人，副研究員，從事果樹育種及栽培研究工作。E-mail：guoqinw1983@126.com

作者簡介：吳軍平（2000-），女，河南平頂山人，在讀碩士研究生，從事植物生理和分子相關研究。E-mail：16637515739@163.com

Bioinformatics analysis of CML gene family in sweet cherry

WU Junping1，FU Quanjuan2，GUO Yuanpeng3，HOU Sen2，SUN Yugang2，WEI Guoqin2*

（1.Shandong Agricultural University， Tai’an， Shandong 271018， China;2.Shandong Institute of Pomology， Tai’an， Shandong 271000， China；3.Juancheng County State Owned First Forest Farm， Heze， Shandong 274600， China）

Abstract：Calmodulin-like protein （CML） is an important protein in response to stimuli during plant growth and development. In this study， based on the whole genome sequence of sweet cherry， the members of sweet cherry CML gene family were identified using bioinformatics methods， and the physicochemical properties， chromosome localization， gene structure， and promoter elements were analyzed. The results showed that there were 49 genes in the PavCML family， which were unevenly distributed on chromosomes 1 to 8， and the subcellular localization was located in the cytoplasm， chloroplast and nucleus. Analysis of promoter cis-acting elements showed that PavCML family genes were involved in the response to a wide range of elements. Combined with transcriptome data， the RT-PCR results showed that the relative expression of PavCML was high in the fruit splitting site， indicating that the gene may be involved in the fruit splitting process， which provided a theoretical basis for the functional identification of CML family members.

Key words：sweet cherry; CML gene family; bioinformatics analysis

鈣離子作為植物信號轉導最重要的信使之一，在植物生長發育過程中不可或缺［1］。但是游離的鈣并不能直接發揮作用，需要由植物體中存在的鈣離子傳感器結合鈣離子并進行下游調控。目前植物中已經發現有四種鈣離子結合蛋白：鈣調蛋白（CaM）［2］、類鈣調蛋白（CML）［3］、鈣調B樣蛋白（CBL）［4］和磷酸鈣調樣激酶（CDPK）［5］。類鈣調蛋白又稱鈣調樣蛋白或類鈣調素（Calmodulin-like proteins， CMLs），CML基因家族是植物中特有的鈣離子傳感器，是參與高等植物生長發育、生物和非生物脅迫、激素作用等的信號轉導的一類基因家族，它含有高度保守的EF-hand結構域，呈螺旋-環-螺旋的結構［6］。相關CML基因在不同部位和一些靶蛋白或者同其他基因一起發揮不同的功能［7］。不同的CML基因在不同發育階段、不同器官和不同刺激反應存在明顯的差異表達。目前多種植物中都被鑒定，研究發現擬南芥中有50個［8］、番茄中有52個［9］、水稻有32個［10］、甜瓜有54個［11］、大豆有68個［12］、棗中有23個［13］CML家族成員等。目前在擬南芥中發現的50個CML基因中，AtCML12能介導生長素的運輸［14］，促進植物生長；AtCML18在植物生長中能抵抗鹽脅迫［15］；AtCML24除了能抵抗鹽脅迫，還能響應ABA和日光［16］；AtCML39在幼苗發育時期對病毒有抵抗作用［17］等。在棗中ZjCML13參與調控冬棗及其同源四倍體響應低溫脅迫。在茶樹中CsCML16、CsCML18-2和CsCML42響應鹽脅迫［18］，但甜櫻桃的CML家族成員和功能還并未見報道。

甜櫻桃（Prunus avium L.）成熟期遇雨裂果一直是影響果實品質和經濟效益的關鍵問題。甜櫻桃裂果除與水分、品種、砧木、果實性狀、栽培措施等密切相關外，還與礦質元素等密切相關。筆者通過對果實噴布氯化鈣溶液處理，探索CML家族跟鈣離子結合對甜櫻桃裂果的影響，通過生物信息學的方法鑒定了甜櫻桃的CML基因家族成員，為深入解析CML家族功能提供數據支持，為甜櫻桃分子育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 甜櫻桃PavCML家族基因鑒定及構建系統進化樹

通過對已經發表的擬南芥的50個CML基因［20］在Tair（TAIR - Home Page （arabidopsis.org））網站上檢索并下載蛋白質序列作為目標序列，在GDR（https：//www.rosaceae.org/）數據庫中下載甜櫻桃Prunus avium Tieton Genome v1.0［21］基因組蛋白序列文件，通過TBtool［22］進行Blast比對，在Pfam 數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載 CML家族的結構域模型文件（EF-hand_l：PF00036、EFhand_6：PF13405、EF-hand_7：PF13499、EF-hand_8：PF13833）［23］通過使用Simple HMM Search功能進行比對，將這兩種方法一起篩選得到的結果通過NCBI的swiss-port功能查看注釋，去除掉一些注釋不為CML基因后再通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）網站篩選掉不含EF-hand的非保守序列，最終得到在甜櫻桃中的有49個PavCML基因，通過MEGA11軟件，將擬南芥和甜櫻桃的CML基因一起構建系統發育樹，選擇Neighbor-joining tree，設置Bootstrap method的參數為1 000，Model選擇p-distance， Gaps選擇Complete deletion得到進化樹，用iTOL網站（https：//itol.embl.de/）對進化樹美化。

1.2 甜櫻桃PavCML染色體定位

通過在GDR網站上下載甜櫻桃GFF3文件對目標基因以及基因在染色體的位置信息進行提取后用在線網站MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）繪制染色體定位圖。

1.3 甜櫻桃PavCML蛋白理化性質分析

將得到的PavCML蛋白序列復制到 Expasy （https：//web.expasy.org/protparam/）網站，對蛋白質的氨基酸、分子量、等電點預測，通過用WoLF PSORT網站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測。

1.4 甜櫻桃PavCML基因家族Motif 結構分析

使用TBtools 中的Simple MEME Wrapper工具進行 Motif 分析，提交蛋白序列，默認Mode選擇Zero or One Occur Per Seq，設置查找 20 個 Motif 數。選擇Visualize MEME/MAST Motif Pattern進行motif結果的可視化分析。

1.5 甜櫻桃PavCML基因結構分析

選擇TBtools的Gene Struture View（Advanced）工具進行提交基因組注釋文件來繪制基因家族的基因結構。

1.6 甜櫻桃PavCML基因啟動子順式作用原件分析

在GDR網站上下載甜櫻桃基因組數據，通過提取甜櫻桃基因組DNA序列上游2 000 bp作為啟動子區域文件上傳至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），將得到的結果通過TBtools的Simple BioSequence View進行可視化繪制得到CML基因家族的啟動子順式作用元件。

1.7 擬南芥AtCML與甜櫻桃PavCML基因家族的共線性分析

使用 TBtools的Advanced Circos工具進行共線性分析，繪制擬南芥與甜櫻桃的共線性圖。

1.8 RNA提取與熒光定量PCR分析

以9年生甜櫻桃布魯克斯為試材，于果實轉色期噴布自來水和0.5% 氯化鈣，以不噴施作對照，間隔2 d噴施1次，共3次。果實成熟采樣，每處理選擇長勢相近的3個結果枝。選取對照、噴自來水、噴鈣3種處理的裂果和不裂果部位分別進行混合取0.1 g樣品提RNA后進行轉錄組測序，通過與轉錄組數據結合，從中選出10個CML相關基因進行熒光定量PCR分析。通過IDT（PrimerQuest - design qPCR assays | IDT （idtdna.com））進行定量引物的設計，如表1。樣品RNA的提取采用諾貝萊多糖多酚試劑盒，反轉錄采用全式金試劑盒進行第一條鏈的合成。熒光定量PCR試劑采用康為世紀的2x Magic SYBR Green Mixture ，定量儀采用ABI 7500 Fast，體系為20 μL：10 μL 2x Magic SYBR Green Mixture，0.2 μL Rox，0.4 μL引物F，0.4 μL引物R，1 μL cDNA，8 μL dd H2O。程序設置為95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）40個循環，溶解曲線程序95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s。通過相對定量 2-ΔΔCt 方法計算，用Excel繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 甜櫻桃PavCML基因家族成員系統進化分析

通過利用擬南芥50個CML基因作為參照基因，Blast后去除掉不含EF-hand結構域的序列，得到49個PavCML基因，依次命名為PavCML1～ PavCML49。將擬南芥與甜櫻桃進行構建系統發育樹如下圖所示，表明PavCML7與AtCML12、PavCML18與AtCML18、PavCML43與AtCML23、AtCML15與PavCML25、AtCML24與PavCML24等有較高的同源性。研究表明AtCML24調控花粉萌發及花粉管生長，猜測PavCML24也有類似的生理功能。根據進化樹可將其劃分A～G亞組，各類群數量不等，如圖1所示。

2.2 甜櫻桃PavCML基因家族的染色體定位分析

從甜櫻桃基因組注釋文件提取49個PavCML基因（圖2），這些基因不均勻的分布在8條染色體和一個sacf161碎片上，從圖中可看出在Chr1最長，分布的PavCML基因最多，有15個，PaCML8單獨分布在scaf161碎片上，Chr2和Chr4上均有2個PavCML基因。

2.3 甜櫻桃PavCML基因家族的蛋白質理化性質

將得到的49個PavCML基因的蛋白序列提交到Expasy網站進行預測蛋白質理化性質，如表2所示，發現該家族（Coding sequerce，CDS）長度在152～2 391 bp，每個序列至少有2個及以上的手性（EF-hand）結構域，氨基酸的長度在101～796 aa。PavCML40的分子量最大約90 kDa，PavCML7、PavCML8、PavCML24、PavCML32這些分子量稍大些，其他基因都在20 kDa 左右。只有PavCML14的等電點超過7，為8.76，其他均在7以下，在3.69～6.49，即大多數PavCML基因是酸性氨基酸。根據亞細胞定位預測顯示該家族大部分基因分布在葉綠體、細胞質、細胞核、線粒體，說明該家族參與細胞的轉錄翻譯等過程，少量分布在質膜和液泡中。

2.4 甜櫻桃PavCML 基因家族Motif 結構

得到的Motif如圖3所示，在這49個PavCML基因中都含有共同的Motif1，除了PavCML26和PavCML49，其他都含有Motif2結構。PavCML7、PavCML9、PavCML10、 PavCML11、PavCML47這幾個基因都含有相同的Motif結構分別是Motif1、Motif2、Motif13、Motif4、Motif5、Motif8、Motif19；PavCML34和PavCML22也含有相同的Motif結構。還有PavCML1、 PavCML2、 PavCML3、 PavCML16、 PavCML19、PavCML23、 PavCML29、 PavCML35、 PavCML36等這些序列基因也呈現出相似的Motif結構。

2.5 甜櫻桃PavCML基因結構

PavCML家族的基因結構中，一些基因含有較多的短片段的外顯子且沒有內含子，如PavCML9、PavCML11、PavCML19、PavCML24、PavCML26、PavCML32、PavCML33、PavCML40、PavCML47等。PavCML1、PavCML2、PavCML3、PavCML4、PavCML5、PavCML13、PavCML23、PavCML25、PavCML27等基因既有內含子，也有外顯子（圖4）。

2.6 甜櫻桃PavCML基因家族的順式作用元件

通過預測啟動子順式作用元件，發現PavCML基因家族大都有生長素響應元件、防御和應激反應的順式作用元件、赤霉素反應性的順式作用元件、低溫響應的順式作用元件、光敏色素下調表達的順式作用元件、水楊酸反應性的順式作用元件、脫落酸反應性的順式作用元件、涉及MeJA響應性的順式作用調節元件、赤霉素反應元件、光響應元件等（圖5），表明CML基因家族的廣泛作用，這些基因元件中含有的有光響應元件和防御和應激反應的順式作用元件，則證明該基因家族能廣泛應對脅迫刺激，抵抗逆境條件下的不良反應。

2.7 甜櫻桃PavCML基因家族的共線性分析

通過將擬南芥與甜櫻桃的CML基因進行共線性分析發現擬南芥的1號和5號染色體與甜櫻桃5號染色體上的基因，擬南芥3號染色體與甜櫻桃1號和8號染色體有較多共線，則表示有很好的共線性（圖6）。

2.8 甜櫻桃PavCML基因家族表達模式分析

通過與轉錄組數據相結合，選擇對照、噴自來水裂果和不裂果部位、噴鈣離子溶液的裂果和不裂果部位樣品，對CML基因進行熒光定量PCR（圖7），結果表明CML基因在裂果果實中的相對表達量高于不裂果果實中的相對表達量，且在施加鈣離子的裂果中的相對表達量高于噴自來水的裂果相對表達量，與轉錄組數據的調控趨勢一致，則可表明CML家族的基因很可能參與甜櫻桃生長發育過程中裂果，調控裂果發生的某些相關途徑。

3 小結與討論

類鈣調蛋白家族在植物生長發育方面起著至關重要的作用，本研究通過將擬南芥CML基因作為參考基因來獲得甜櫻桃的CML基因，共鑒定到49個，他們分別分布在8條染色體和一個碎片上，這49個PavCML基因大多數是小分子偏酸性蛋白，基因間有較大差異的基因結構，有些基因只有外顯子，有些基因內含子數量多，可能參與轉錄調控。與擬南芥相似，甜櫻桃的PavCML基因含有2～4個EF-hand手性結構，通過將甜櫻桃與擬南芥的CML基因家族一起進行進化樹分析，劃分了為7個亞族（如圖1），表明甜櫻桃PavCML家族蛋白成員眾多，在植物基因間有相似的進化，功能具有多樣性［24］ 。在預測CML家族順式作用元件，發現該家族成員蛋白具有生長素、赤霉素、光響應元件等大量激素響應元件，可知CML基因通過調控激素在植物抗逆中起到了極為重要的作用。除此之外，還鑒定到一些低氧、低溫和受傷反應元件，表明其對逆境脅迫的響應［25］。

為了探索鈣離子與CML基因家族對甜櫻桃生長的影響，本實驗基于本課題組的轉錄組數據進行熒光定量PCR，發現在鈣離子處理后，部分CML家族基因相對于對照CK的表達顯著上升（圖9），可推測鈣離子對甜櫻桃果實的發育有轉錄調控的作用，在鈣處理后的裂果部位的相對表達量要比任何組高，推測甜櫻桃PavCML基因家族可能響應裂果，參與裂果產生的機制，但具體作用機理和方式有待進一步研究。本研究初步闡明了甜櫻桃PavCML基因的基本生物信息學特點，驗證了CML基因參與甜櫻桃裂果，為進一步研究該家族成員的生物學功能提供了數據參考和理論依據。

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