藏藥塞北紫堇對小鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究

【摘 要】 目的：研究塞北紫堇的抗肝損傷作用。方法：采用CCl4誘導小鼠急性肝損傷模型，通過觀察肝組織病理切片，測定小鼠肝臟指數，血清中AST、ALT、AKP、LDH、TNF-α、IL-1β指標，以及肝組織中MDA、SOD、GSH指標，考察塞北紫堇提取物、生物堿和非生物堿部位的抗肝損傷活性。結果：除非生物堿部位外的各組均可降低模型小鼠血清中的AST、ALT、AKP、LDH、TNF-α、IL-1β水平和肝組織中MDA含量（P<0.05，P<0.01），升高GSH和SOD水平（P<0.01）；肝指數和HE染色結果顯示，各組均對肝組織損傷具有保護作用，且效果依次是提取物>生物堿>非生物堿部位。結論：塞北紫堇通過降低脂質過氧化，緩解氧化應激，并抑制炎癥因子釋放來減少模型小鼠肝損傷，總生物堿為其主要活性部位。

【關鍵詞】 塞北紫堇；生物堿；肝損傷

【中圖分類號】R285.6

【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2024）12-0029-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.12.zgmzmjyyzz202412007

Study on the Protective Effect and Mechanism of Corydalis impatiens

on Carbon Tetrachloride Induced Anti-liver Injury in Mice

MIN Tongtong ZHONG Guoyue ZHANG Yamei*

Research Center for Traditional Chinese Medicine Resource and Ethnic Minority Medicine，

Jiangxi University of Chinese Medicine， Nanchang 330004， China

Abstract：Objective To study the protective effect of Corydalis impatiens on liver injury and its mechanism of action. Methods Carbon tetrachloride was used to induce acute liver injury in mice model. Serum liver function indexes of mice aspertate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， alkaline phosphatase （AKP）， lactate dehydrogenase （LDH）， inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （ IL-1β） and liver antioxidant stress factors malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione （GSH） in each group were detected. The pathological changes of liver were detected by HE staining.Results Compared with model group， SOD and GSH enzyme activities were significantly increased in total extract group and alkaloids group（P<0.01）， and the contents of AST， ALT， AKP， LDH， TNF-α， IL-1β and MDA were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）.The pathological sections showed that Corydalis impatiens could significantly reduced liver damage．Conclusion Corydalis impatiens has a protective effect on CCl4 induced liver injury， and total alkaloid is the main active part. Its mechanism of action is related to inhibiting inflammatory reation and improving oxidative stress injury of mice liver.

Key words：Corydalis impatiens; Alkaloids; Liver Injury

藏藥“/巴夏嘎”是藏醫治療肝膽系統疾病的常用藥［1］。由于“巴夏嘎”正品基原藥材——爵床科植物鴨嘴花 Adhatoda vasica Nees.在西藏僅有東南部川區的亞熱帶森林有分布，且資源蘊藏量少，目前西藏大部分地區主要用玄參科植物長果婆婆納 Veronica ciliata Fisch.以及罌粟科植物塞北紫堇Corydalis impatiens （Pall.） Fisch.做其替代品使用［2］。基于藏藥“巴夏嘎”保肝利膽傳統功效開展的活性研究主要涉及鴨嘴花中生物堿類成分和長果婆婆納中酚類成分［3-4］；另一基原植物塞北紫堇及其活性部位的相關研究則未見報道。文獻研究［5-6］表明，塞北紫堇具有抗炎、鎮痛、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗缺氧等多種藥理活性，化學成分以生物堿為主，其次包括黃酮、酚類、萜類、醌類等。基于此，本研究采用CCl4致小鼠急性肝損傷模型探究塞北紫堇提取物、總生物堿部位、非生物堿部位的抗肝損傷活性及作用機制，為其臨床用于肝病治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 塞北紫堇采自四川省甘孜州甘孜縣，由江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心主任鐘國躍研究員鑒定為罌粟科紫堇屬植物Corydalis塞北紫堇Corydalis impatiens （Pall.） Fisch.的干燥地上部分。

1.1.2 試劑與藥品 多烯磷酯酰膽堿膠囊（批號：H20059010），購自賽諾菲（北京）制藥有限公司；谷丙氨酸轉移酶（ALT，批號：20210402）、谷草轉氨酶（AST，批號：20210401）、堿性磷酸酶（AKP，批號：20210405）、乳酸脫氫酶（LDH，批號：20210405）、腫瘤壞死因子（TNF-α，批號：20210528）、白介素1β（IL-1β，批號：20210528）、丙二醛（MDA，批號：20210406）、超氧化物歧化酶（SOD， 批號：20210407）、谷胱甘肽酶（GSH，批號：20210407）、BCA（批號：20210312），以上均購自南京建成生物工程研究所；水為超純水（Milli-Q型超純水系統，法國Milli-Q公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.3 動物 SPF級健康KM小鼠90只，體重18～22 g，雄性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于江西中醫藥大學動物房，提供標準的滅菌飲用水，動物房相對濕度為30%～60%，光/暗循環為12 h，溫度為22～24 ℃。

1.1.4 儀器 DY89-II電動勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速冷凍離心機（美國Beckman-Coulter公司）；Multiskan GO全波長酶標儀（美國Thermo公司）；紫外分光光度計UV-1800（日本島津有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 塞北紫堇提取物及陽性藥溶液制備 稱取105 g塞北紫堇藥材，粉碎、過2號篩，20倍量85%乙醇加熱回流3次，合并濾液濃縮至500 mL。取145 mL提取液，濃縮至干，臨用前加 CMC-Na水溶液配成每10 mL含生藥2.34 g的提取物溶液作為高劑量組，低劑量組稀釋1倍。多烯磷脂酰膽堿膠囊依據預實驗加CMC-Na水溶液配成每10 mL含0.18 g藥物的陽性藥溶液。

1.2.2 生物堿和非生物堿部位制備 取上述塞北紫堇粗提液300 mL濃縮至無醇味，用5%鹽酸溶液調節pH至3，石油醚萃取除掉葉綠素，酸水層加10%氨水調節pH至10，用體積比為1∶1的二氯甲烷萃取3次，堿水層復加10%氨水調pH至12，繼續用體積比為1∶1二氯甲烷萃取2次。合并5次的二氯甲烷萃取液得生物堿部位，蒸干，同1.2.1方法配成生物堿部位高、低劑量溶液。于堿水層中加5%鹽酸調節pH至7，過濾，得到非生物堿部位，蒸干，同上配置非生物堿部位高、低劑量溶液。

1.2.3 動物分組、給藥及CCl4模型建立 小鼠適應喂養3 d后，按重量隨機分為9組，即空白組，模型組，陽性藥組，塞北紫堇提取物高、低劑量組（EH組、EL組），生物堿部位高、低劑量組（AH組、AL組），非生物堿部位高、低劑量組（NH組、NL組），每組各10只。除空白組和模型組灌胃0.5%的CMC-Na溶液（10 mL/kg）外，各給藥組分別按高劑量2.34 g/kg（生藥）、低劑量1.17 g/kg（生藥）灌胃對應藥物溶液，每日1次，連續7 d。末次給藥2 h后，稱重。各給藥組和模型組均腹腔注射0.2% CCl4（10 mL/kg）橄欖油溶液建立急性肝損傷模型，空白組腹腔注射等體積橄欖油，造模16 h，期間禁食不禁水。

1.2.4 肝指數計算及血清、肝組織中生化指標檢測 造模16h后進行眼球取血，靜置2 h，全血于3500 r·min-1，4 ℃離心10 min。即得血清。嚴格按照試劑盒說明書檢測血清中的ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α、IL-1β的水平。將小鼠斷頸脫臼處死，于冰臺上采集肝臟組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，稱取肝臟濕重，按文獻計算肝臟指數（肝臟指數=肝濕重/體質量×1009b7973789f0cc800cb51b643d9087624edbee8093642615e5938bbb134acc871%）［7］。在冰臺上快速分離相同部位的肝組織2份，將肝大葉置于10%中性甲醛溶液里進行固定，肝小葉取出后置于-80 ℃冷凍保存。取部分肝小葉組織，解凍后按重量：體積=1（g）∶9（mL）的比例加冷生理鹽水制備成10%肝組織勻漿，置于4 ℃ 3500 r/min 離心10 min，取上清液用于檢測MDA含量、SOD和GSH的活性。

1.2.5 肝組織病理學變化觀察 取肝組織置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進行HE 染色。光鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.2.6 統計學分析 借助SPASS 21.0軟件進行統計學分析，結果以均數加減標準差（x±s）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析。

2 實驗結果

2.1 塞北紫堇對小鼠肝指數及肝組織病理學的影響 當肝細胞處于正常狀態時，肝指數較為穩定，進行造模染毒后，肝臟出現充血、水腫或增生肥大等現象，肝指數明顯增加。見表1，如圖1所示。由表1可知，模型組較空白組小鼠的肝濕重增加，體質量下降，肝指數顯著升高（P<0.001），顯示造模成功。與模型組相比，陽性藥組、EH、EL組、AH、AL組以及NH組均具有顯著降低（P<0.01或P<0.001），但NL組降低效果不具有統計學意義（P>0.05）。結合圖1各給藥組對小鼠肝組織影響的病理圖片分析，空白組小鼠肝組織及小葉結構清晰完整，肝細胞排列整齊，呈放射狀且核圓而清晰；模型組小鼠肝組織損傷嚴重，結構模糊，有大量的炎性細胞浸潤（以表示），肝細胞排列紊亂，正常結構出現壞死（以表示），表明CCl4造膜成功；與模型組相比，陽性藥組小鼠肝小葉結構尚清晰，肝細胞排列明顯規則，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死數量減少，胞質中可見微小空泡（以表示）；EH、EL組肝細胞排列整齊，炎性細胞浸潤較少，但損傷程度高于陽性藥組；AH、AL組肝組織結構較為清晰，炎性細胞浸潤減少，無非常明顯的肝細胞壞死現象；NH、NL組胞體略微腫脹，結構略清晰。肝指數和HE染色結果顯示，各給藥組均對肝組織損傷具有保護作用，且效果依次是提取物>生物堿>非生物堿部位，但次于陽性藥。

2.2 對小鼠血清ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α和IL-1β活性的影響 塞北紫堇總提物組、生物堿組、非生物堿組對小鼠血清ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α和IL-1β活性的影響見表2和如圖2所示。與空白組相比，模型組小鼠血清中的ALT、AST、AKP、LDH水平急劇升高（P<0.05或P<0.001），提示小鼠出現急性肝損傷，與文獻［7］報道一致，表明造模成功。與模型組相比，陽性藥組、EH、EL組、AH組對小鼠血清中ALT、AST、AKP、LDH、TNF-α和IL-1β活性均有顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。AL組對除LDH外的其他指標均有顯著降低，但NH組對除AST、AKP外的指標均無顯著影響，NL組所有指標均無統計學差異（P>0.05）。

2.3 對小鼠肝組織中的GSH、MDA含量和SOD活性的影響 塞北紫堇總提物組、生物堿組、非生物堿組對小鼠肝組織中的GSH、MDA含量和SOD活性的影響見表3、如圖3所示。與空白組相比，模型組小鼠肝勻漿中的MDA含量顯著升高，GSH和SOD活性顯著降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。與模型組相比，陽性藥組、EH、EL組、AH、AL組小鼠肝勻漿中的GSH和SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01或P<0.001），且AH、AL組對指標的影響效果優于EH、EL組。NH、NL組對小鼠肝勻漿中的SOD活性無顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

CCl4是典型的致肝毒性物質，用其復制的肝損傷動物傷模型也與人類肝臟受損特征類似［9］，因此本實驗采用CCl4建立肝損傷模型。ALT、AST、LDH表達于肝細胞內部，AKP則主要分布于人體肝臟、骨骼等組織的細胞膜上，均是肝組織不可或缺的酶，其在血清中的濃度與肝損傷程度呈正相關［9-10］。本實驗結果顯示，與模型組相比，塞北紫堇提取物和總生物堿組小鼠血清中ALT、AST、AKP、LDH水平顯著降低，肝指數顯著下降，病理學檢查結果亦有較大改善，提示塞北紫堇提取物和總生物堿部位均可緩解模型小鼠的肝損傷程度，且提取物效果優于生物堿，說明除生物堿之外的其他類成分亦具有抗肝損傷作用，而非生物堿部位各項指標亦有所證實，如和模型組相比，非生物堿部位高劑量組小鼠的肝損傷病理學檢查結果有所改善，肝指數和AST、AKP水平顯著下降。

此外，當肝組織受到損傷時，肝細胞活動減弱，抗氧化酶SOD、GSH等水平降低，氧化應激標志物MDA以及ROS水平增加，顯示肝組織氧化平衡被破壞，氧自由基代謝受阻［11］。本研究中，塞北紫堇提取物和總生物堿組小鼠肝組織內的GSH和SOD水平均較模型組顯著上升，MDA水平顯著下降，說明其可通過改善氧化應激減輕肝損傷。

TNF-α是由Kupffer細胞產生并由T細胞激活的炎癥細胞調節因子，可通過誘導雙鏈DNA斷裂增加肝細胞凋亡；IL-1β則是由活化的巨噬細胞產生的炎癥因子，可進一步刺激淋巴細胞活化，從而加重肝臟的損傷程度，二者的表達均與肝組織炎癥反應呈正相關，并進一步加深肝組織的損傷［11-12］。本實驗結果顯示，塞北紫堇提取物組、總生物堿組血清中TNF-α和IL-1β含量均較模型組顯著下降，提示其抗肝損傷作用與抑制炎癥因子釋放有關。

上述結果表明，塞北紫堇提取物及其總生物堿可通過緩解氧化應激，并抑制炎癥因子釋放來緩解模型小鼠肝損傷。

參考文獻

［1］仁真旺甲，文成當智，余羊羊，等. 藏藥“巴夏嘎”品種考證、藥性分析與用藥規律研究［J］. 世界科學技術-中醫藥現代化， 2020，22（11）：4044-4051.

［2］陳靜， 格桑頓珠. 藏藥巴夏嘎化學成分及其在藏藥方中應用的研究進展［J］.中醫藥導報，2017，23（10）：46-47.

［3］CHAITALI S， SANKHADIP B， SUGATO B. Evaluation of hepatoprotective activity of vasicinone in mice［J］. Indian Journal of Experimental Biology， 2014（54）：705-711.

［4］LI Y， LEI W， RAO F， et al. Antioxidant and hepatoprotective activity of Veronica ciliata Fisch. extracts against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice［J］. Molecules， 2014（19）： 7223-7236.

［5］王琪，王順善，馬吉元，等.塞北紫堇中生物堿成分及其藥理作用的研究進展［J］.華西藥學雜志， 2019， 34（4）：421-424.

［6］潘國慶，馬立閃. HPLC同時測定塞北紫堇中的2種生物堿［J］.華西藥學雜志， 2016， 31（6）：636-637.

［7］魏懷玲，劉耕陶. 紫堇靈、乙酰紫堇靈及原阿片堿對小鼠實驗性肝損傷的保護作用［J］.藥學學報，1997，32（5）：331-336.

［8］郭錳，張成輝，吳婷婷. 荷包牡丹堿對人肝癌MHCC97-H細胞轉移、侵襲的影響及機制研究［J］.中草藥，2019，50（22）：5515-5520.

［9］李青青，熊佳慧，溫玉清，等.丹參酮IIA對CCl4誘導小鼠急性肝損傷的保護作用 ［J］.中國臨床解剖學雜志， 2022，40（6）：671-676.

［10］曹琳，居博偉，冉崢，等.肉蓯蓉苯乙醇總苷對膽汁淤積型肝病小鼠的預防保護作用［J］.中國藥物警戒，2023，20（3）：286-290.

［11］毛竹，朱繼孝，曾金祥，等.短管兔兒草提取物對對乙酰氨基酚誘導小鼠藥物性肝損傷的保護作用與機制［J］.中成藥，2022，44（9）：3004-3008.

［12］陳玉嬋，彭東輝，孫延平，等. 柴胡皂苷b1緩解CCl4誘導急性肝損傷的作用機制研究［J］.中醫藥信息， 2023，40（4）： 38-43.

（收稿日期：2023-09-07 編輯：劉 斌）