紅大戟水提物的急性毒性及抗炎、鎮痛、抗凝血作用研究

【摘 要】 目的：對紅大戟水提物的急性毒性及抗炎、鎮痛、抗凝血作用進行研究。方法：采用最大給藥量法對小鼠進行急性毒性試驗，用二甲苯致小鼠耳腫脹試驗、脂多糖（LPS）誘導炎癥小鼠模型評價其抗炎作用，用小鼠熱板試驗和醋酸扭體試驗評價其鎮痛作用。通過檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）評價其抗凝血作用。結果：紅大戟水提物最大給藥量（120 g/kg/d）灌胃后連續觀察14 d，全部小鼠均未出現死亡和明顯的急性毒性反應。在抗炎研究中，紅大戟水提物高、中、低劑量均能顯著降低小鼠耳腫脹度（P<0.05或P<0.01），腫脹抑制率分別為39.5%、28.6%和20.2%，且能顯著降低炎癥模型小鼠血清中IL-6和TNF-α含量（P<0.05或P<0.01），而對IL-1β無顯著性影響。在鎮痛研究中，紅大戟水提物各劑量在120 min時均能顯著提高小鼠的熱板痛閾值（P<0.01），且能顯著降低小鼠扭體次數（P<0.05或P<0.01），扭體抑制率分別為36.7%、29.3%和23.5%。抗凝研究中，紅大戟水提物高劑量能顯著延長小鼠血漿PT值（P<0.05），而對APTT、TT無顯著性影響。結論：紅大戟水提物在最大給藥量（120g/kg/d）條件下無明顯的急性毒性反應，其具有明顯的抗炎鎮痛抗凝血作用。

【關鍵詞】 紅大戟；急性毒性；抗炎；鎮痛；抗凝血

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2024）12-0035-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.12.zgmzmjyyzz202412008

Study on Acute Toxicity， Anti-inflammatory， Analgesic，and Anticoagulant of the Water Extract of Knoxia valerianoides

ZENG Sen1 LI Yan2 WANG Lu2 WU Chaoquan3 NING Ling3 ZHAO Yue3 CHEN Yufeng2*

1. Guilin Tianhe Pharmaceutical Yiwei Co.Ltd，Guilin 541000，China；

2.Guilin Huarun Tianhe Pharmaceutical Co.Ltd，Guilin 541000，China；

3.Guangxi Institute For Food and Drug Control， Nanning 530000，China

Abstract：Objective To study the acute toxicity，anti-inflammatory，analgesic and anticoagulant effects of the water extract of Knoxia valerianoides.Methods Mice were given the maximum dose of Knoxia valerianoides to observe the acute toxicity. The anti-inflammatory were studied by xylene-induced ear swelling and an inflammation model of lipid polysaccharides（LPS） induced mice. Analgesic effects were studied by hot plate test and glacial acetic acid-induced writhing text. The anticoagulant effect was evaluated by the prothrombin time（PT），activated partial prothrombin time（APTT），thrombin time（TT）.Results At the maximum dose of the water extract of Knoxia valerianoides，no death or acute toxicity was observed within 14 days in the mice.At the anti-inflammatory study， all dose of the water extract of Knoxia valerianoides had inhibitory effects on xylene induced auricle inflammation（P<0.05 or P<0.01），the inhibition rates were 39.5%， 28.6% and 20.2%. It could significantly reduce the contents of IL-6 and TNF-α（P<0.05 or P<0.01）， but had no significant effect on IL-1β.At the analgesic study. All dose of the water extract of Knoxia valerianoides had inhibitory effects on acetic acid-induced writhing in mice（P<0.05 or P<0.01），the inhibition rates were 36.7%， 29.3% and 23.5%. The pain threshold of mice could be significantly prolonged （P<0.01）. At the anticoagulant study，the high dose of the water extract of Knoxia valerianoides could significantly prolonged the prothrombin time（P<0.05）. Conclusion Knoxia valerianoides has no obvious acute toxicity at the maximum dose of 120 g/kg/d. It has anti-inflammatory，analgesic and anticoagulant effects.

Key words：Knoxia valerianoides；Acute Toxicity；Anti-inflammatory；Analgesic；Anticoagulant

《中國藥典》中記載，紅大戟是茜草科植物紅大戟（Knoxia valerianoides Thorelet Pitard）的干燥塊根，其性苦、寒；有小毒；具有瀉水逐飲、攻毒消腫散結的功效，臨床上用于治療胸腹積水、二便不利、癰腫瘡毒、瘰疬痰核等癥［1］，對咽炎亦有治療作用［2-3］。紅大戟主要含有蒽醌類、三萜類、豆甾酮、木脂素、香豆素等成分［4-9］，其藥理活性研究較少，僅發現一篇關于紅大戟抑制結核桿菌報道［10］。與紅大戟瀉水逐飲、攻毒消腫散結功效相關的藥理作用有瀉下、利尿、抗菌、抗炎等 ［11-12］，據此推測，紅大戟可能有抗炎的作用。此外，中醫認為的腫、結、癰、瘡、瘰疬共同的病機為血瘀證，是與微循環障礙有聯系的病理過程［13-14］。抗凝能改善血瘀證的高凝狀態、改善微循環，從而達到消腫散結的效果。紅大戟的攻毒消腫散結功效是否與抗凝血相關，值得探究。因炎癥與疼痛密切相關［15］，且紅大戟有“小毒”，故本研究以紅大戟為研究對象，研究其水提物的急性毒性和抗炎鎮痛抗凝血作用，以期為紅大戟的藥理研究和臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 藥物與試劑 紅大戟（Knoxia valerianoides）由桂林華潤天和藥業有限公司提供。二甲苯（批號：20141020，國藥集團化學試劑有限公司）；醋酸（批號：20150505，國藥集團化學試劑有限公司）；羅通定（批號：210301，四川迪菲特藥業有限公司）；阿司匹林（批號：22102103，沈陽奧吉娜藥業有限公司）；生理鹽水（批號：22306003，廣西昆澤藥業有限公司）；PT試劑盒（批號：568056A，德國西門子醫學診斷產品有限公司）；APTT試劑盒（批號：568056A，上德國西門子醫學診斷產品有限公司）；TT試劑盒（批號：00685，德國西門子醫學診斷產品有限公司）；LPS（批號：P2636866，Sigma Aldrich）；Mouse TNF-αELISA Kit（批號：052211002104840522，江萊生物）；Mouse IL-6 ELISA Kit（批號：052211002202680522，江萊生物）；Mouse IL-1β ELISA Kit（批號：052211002184420522，江萊生物）。

1.2 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，共450只，雌性200只，雄性250只，體質量18～22 g，由廣西壯族自治區食品藥品檢驗所生產，實驗動物生產許可證號：SCXK桂2022-0001。

1.3 儀器 8 mm打孔器（得力手握式打孔器）；AL204-IC精密電子天平（梅特勒）；HI1220熱板（LEICA）；CS-1300全自動血凝分析儀［希森美康醫用電子（上海）有限公司］；多功能酶標儀（TECAN）。

2 方法

2.1 紅大戟最大給藥濃度水提物的制備 稱取紅大戟粉（過20目篩）400 g，加入8倍量的水，浸泡60 min后大火煮沸，保持微沸狀態回流1 h，紗布過濾藥液；藥渣繼續加入8倍量的水，同法第2次煎煮，過濾，將兩次濾液合并，濃縮成濃浸膏。加適量水研磨配制成剛好能通過12號灌胃針的最大濃度 ［16］，此時濃度相當于1.0 g紅大戟藥材/mL。

2.2 急性毒性試驗

2.2.1 預試驗 50只小鼠隨機分5組，每組10只， 雌雄各半。用水將1.0 g/mL的紅大戟水提物按0.85比例逐級稀釋配制得1.0、0.85、0.72、0.61 g/mL濃度組的藥液，空白組給純凈水，各組灌胃體積為40 mL/kg，觀察記錄給藥后14 d內小鼠體重、一般行為活動及死亡數。

2.2.2 最大給藥量試驗 40只小鼠隨機分為空白組和紅大戟組，每組20只，雌雄各半。空白組給純凈水，紅大戟組以最大給藥濃度1.0 g/mL和最大給藥體積40 mL/kg灌胃給藥，24 h內給藥3次，給藥劑量為120 g/kg/d，觀察并記錄給藥后14 d內小鼠的急性毒性反應。

2. 3 紅大戟水提物抗炎作用研究

2.3.1 耳腫脹試驗 50只雄性小鼠，隨機分為紅大戟水提物高劑量組（10 g/kg）、紅大戟水提物中劑量組（5 g/kg）、紅大戟水提物低劑量組（2.5 g/kg）、陽性組（阿司匹林0.2 g/kg）、模型組（純化水），按0.1 mL/10 g灌胃給藥，1次/d，連續給藥7 d。末次給藥45 min后，每只小鼠的左耳前后兩面用0.04 mL的100%二甲苯均勻涂抹，右耳作對照。涂抹45 min后將脫頸處死小鼠，沿耳廓剪下兩耳片，用直徑8 mm的打孔器在兩耳同一部位打下圓耳片，立即稱量兩耳片的質量，以左右兩耳片質量之差表示腫脹度，計算腫脹抑制率。

腫脹抑制率=（模型組腫脹度-試驗組腫脹度）/模型組腫脹度×100%［17］

2.3.2 LPS誘導的炎癥小鼠模型 50只雄性小鼠，隨機分為紅大戟水提物高劑量組（10 g/kg）、紅大戟水提物中劑量組（5 g/kg）、紅大戟水提物低劑量組（2.5 g/kg）、模型組（純化水）和空白組（純化水），每組10只，按0.1 mL/10 g灌胃給藥，1次/d，連續7 d，末次給藥60 min后，除空白組外，其他各組按20 mg/kg腹腔注射LPS制作炎癥小鼠模型［18］，注射60 min后，摘眼球取血，分離血清，并按照試劑盒說明書測定IL-6、TNF-α和IL-1β含量。

2.4 紅大戟水提物鎮痛作用研究

2.4.1 熱板試驗 選取雌性小鼠，將小鼠置于（53±0.5）℃的熱板上，以小鼠足底接觸熱板至出現舔后足的時間作為痛閾指標，選取痛閾在5～30 s的小鼠用于后續試驗。第1次測定后60 min測第2次，取2次痛閾的平均值作給藥前痛閾值。將選出來的小鼠隨機分為紅大戟水提物高劑量組（10 g/kg）、紅大戟水提物中劑量組（5 g/kg）、紅大戟水提物低劑量組（2.5 g/kg）、陽性組（羅通定0.06 g/kg）、空白組（純化水），每組10只，按0.1 mL/10 g灌胃給藥，1次/d，連續給藥7d。末次給藥后于60、120 min檢測痛閾值（s），如痛閾值超過60 s按60 s記并立即停止測試。

2.4.2 醋酸扭體試驗 50只雄性小鼠，隨機分為紅大戟水提物高劑量組（10 g/kg）、紅大戟水提物中劑量組（5 g/kg）、紅大戟水提物低劑量組（2.5 g/kg）、陽性組（羅通定0.06 g/kg）、模型組（純化水），每組10只，按0.1 mL/10 g灌胃給藥，1次/d，連續給藥7 d。末次給藥90 min后按10 mL/kg腹腔注射0.8% 冰醋酸溶液，記錄15 min內小鼠扭體次數，扭體以小鼠表現出“腹部內凹、臀部抬高、軀體扭曲”為依據，計算扭體抑制率。

扭體抑制率=（模型組扭體次數-給藥組扭體次數）/模型組扭體次數×100%

2.5 紅大戟水提物抗凝血作用研究 50只雄性小鼠，隨機分為紅大戟水提物高劑量組（10 g/kg）、紅大戟水提物中劑量組（5 g/kg）、紅大戟水提物低劑量組（2.5 g/kg）、空白組（純化水），每組10只，按0.1 mL/10g灌胃給藥，1次/d，連續7 d，末次給藥90 min后，摘眼球取血，分離血漿并測定PT、APTT、TT值。

2. 6 統計分析 用 SPSS 17.0軟件進行數據統計分析，結果以（x±s）表示，采用單因素方差分析法進行多組間比較。P＜0.05時，認為有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠急性毒性試驗 預試驗結果顯示，給藥后14 d內，各組小鼠行為活動正常，未見急性中毒癥狀。因此，以最大給藥量法進行急性毒性試驗，給藥劑量達到120 g/kg/d。給藥后，紅大戟組和空白組的全部小鼠狀態及行為活動等均正常，連續觀察14 d，各組小鼠未出現死亡，全部小鼠一般狀況良好，未發現急性毒性反應。

3.2 紅大戟水提物的抗炎作用

3.2.1 紅大戟水提物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 由表1可知，與模型組相比，紅大戟水提物高、中、低劑量組均能顯著抑制小鼠耳腫脹度（P＜0.05或P＜0.01），抑制率分別為39.5%、28.6%和20.2%。結果提示，紅大戟水提物對二甲苯誘導的小鼠耳腫脹急性炎癥具有較好的抑制作用。

3.2.2 紅大戟水提物對炎癥小鼠模型的IL-6、TNF-α和IL-1β的影響 由表2可知，與空白組相比，LPS腹腔注射60 min后模型組的IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著提高（P＜0.01），提示造模成功［18］。與模型組相比，紅大戟水提物高、中、低劑量組能顯著降低炎癥小鼠模型血清中的IL-6和TNF-α的含量（P＜0.05或P＜0.01），對IL-1β無顯著影響。

3.3 紅大戟水提物的鎮痛作用

3.3.1 紅大戟水提物對小鼠熱板痛閾值的影響 由表3可知，給藥前各組痛閾值無顯著性差異，給藥60 min后，與空白組相比，紅大戟水提物各劑量組痛閾值無顯著變化，給藥120 min后，紅大戟高、中、低劑量組痛閾值顯著升高（P＜0.01）。結果提示，紅大戟水提物對熱板致小鼠疼痛有一定鎮痛作用。

3.3.2 紅大戟水提物對小鼠醋酸扭體試驗的影響 由表4可知，與模型組相比，紅大戟水提物高、中、低劑量組均能顯著減少小鼠的扭體次數（P＜0.05或P＜0.01），抑制率分別為36.7%、29.3%和23.5%，結果提示，紅大戟水提物對醋酸致小鼠疼痛有一定抑制作用。

3.4 紅大戟水提物對小鼠血漿PT、APTT、TT 的影響 由表5可知，與空白組相比，紅大戟水提物高劑量組（10 g/kg）使小鼠PT有顯著性延長（P＜0.05），對APTT、TT值無顯著性影響，中低劑量對PT、APTT、TT值無顯著影響。結果提示，紅大戟水提物有一定的抗凝作用。

4 討論

李興華等［19］按最大劑量為40 g/kg/次，1次/d灌胃給藥的方法未發現紅大戟水提物的急性毒性反應，但此方法的給藥劑量未達到紅大戟水提物的最大給藥量，而有“小毒”的藥物，只有超大劑量才會發生中毒［20］。為了進一步研究紅大戟水提物的急性毒性，本研究采用最大給藥量法，給藥劑量達到120 g/kg/d，試驗結果顯示，紅大戟水提物在最大給藥量的條件下，無明顯的急性毒性反應。

炎癥是眾多疾病共同的病理表現。二甲苯致小鼠耳腫脹模型主要是通過化學物質引發炎癥介質釋放，使局部血管擴張，最終使小鼠耳部發生急性腫脹，本研究發現紅大戟水提物可顯著抑制二甲苯誘導的小鼠耳腫脹。LPS誘導的炎癥小鼠模型符合受到革蘭氏陰性菌感染發生的癥狀。LPS進入小鼠體內會刺激巨噬細胞產生進而使得促炎細胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α大量分泌［21］，誘導炎癥反應。抑制炎癥因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的生成，表明拮抗了炎癥反應［22］。本研究發現，紅大戟水提物能顯著降低LPS誘導的炎癥小鼠模型血清中IL-6和TNF-α的含量，試驗結果表明，紅大戟水提物具有較好的抗炎作用。

炎癥與疼痛關系密切，本研究利用熱板試驗和小鼠醋酸扭體試驗來評價紅大戟水提物的鎮痛作用。熱板試驗結果顯示，紅大戟水提物能顯著提高小鼠的熱板痛閾值。醋酸扭體試驗是通過腹腔注射一定劑量的冰醋酸造成的大面積深部的炎性疼痛，導致小鼠發生扭體反應，本研究發現紅大戟水提物能抑制小鼠醋酸扭體的次數。以上結果提示，紅大戟水提物具有較好的鎮痛作用。

本研究選取了凝血四項中的PT、APTT、TT三項來評價紅大戟水提物的抗凝作用。抗凝血試驗結果顯示，紅大戟水提物高劑量能顯著的延長PT值，結果提示紅大戟水提物具有較好的抗凝作用。

本研究證實了紅大戟水提物具有抗炎鎮痛抗凝血的作用，對紅大戟的藥理研究和臨床的應用具有一定的參考意義。有研究表明，紅大戟所含的三萜類化合物阿江欖仁酸［7］和2α-3β-23-三羥基烏蘇-12烯-28-酸［7］具有較好的抗炎［23］和抑制凝血因子Xa活性作用 ［24］，但本研究所用的紅大戟水提物未進行指紋圖譜研究，亦未對三萜類化合物進行含量分析，因此，紅大戟抗炎鎮痛抗凝血的“譜-效關系”還有待進一步研究。

參考文獻

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2020：156-157.

［2］李興華. “紅芽大戟”的實名考證［J］.中藥材，2013，36（2）：322-324.

［3］李治方.紅芽大戟含服治療慢性咽炎54例［J］.江西中醫藥，1987，18（4）：3.

［4］趙峰，王素娟，吳秀麗，等.紅大戟中的蒽醌類化學成分［J］.中國中藥雜志，2011，36（21）：2980-2986.

［5］ZHAO F，WANG S，WU X，et al. Anthraquinones from the roots of Knoxia valerianoides［J］.Journal of Asia Natural ProductsＲesearch，2011，13（11）：1023-1029.

［6］趙峰，王素娟，吳秀麗，等.紅大戟中的非蒽醌類化學成分［J］.中國中藥雜志，2012，37（14）：2092-2099.

［7］洪一郎，馬麗，王垣芳，等.紅大戟中的蒽醌和三萜類化學成分［J］.中國中藥雜志，2014，39（21）：4230-4233.

［8］趙峰，馬麗，孫居鋒，等.紅大戟中的1個新降碳三萜［J］.中草藥，2014，45（1）：28-30.

［9］ ZHAO F，WANG S，LIN S，et al. Natural and unnatural anthraquinones isolated from the ethanol extract of the roots of Knoxia valerianoides［J］.Acta Pharm Sin B，2012，2（3）：260-266.

［10］秦海宏，賈琳鈺，高陽，等.紅大戟提取物對結核桿菌的抑制作用觀察［J］.山東醫藥，2013，53（10）：77-78.

［11］方曉艷，王琳琳，焦河玲，等.中藥藥理瀉下藥概述部分對比分析教學法的應用.［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2016，14（15），19-20.

［12］羅良濤，黃國維，劉仁慧，等.結合《藥理學》和《中藥藥理學》講授《中藥學》.［J］.繼續醫學教育，2022，36（2），49-52.

［13］冷媛媛，陳林，王念，等.血瘀證與活血化瘀治法的古代文獻溯源［J］.江蘇中醫藥，2023，55（5），59-63.

［14］李小茜，何建成.血瘀證之溯源［J］.中華中醫藥學刊，2014，32（10）：2449-2452.

［15］唐銘澤，申圳，高天樂，等.中藥天然產物在疼痛管理中應用的研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志.

［16］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛生出版社，1993：113-119.

［17］王燦紅，弓寶，劉洋洋，等.通體結香技術產沉香的鎮痛抗炎作用研究［J］.生物資源，2021，43（4）：363-369.

［18］賈航航，羅生杰，譚莉萍，等.基于LPS誘導小鼠炎癥模型對苦苣菜抗炎機制的初步研究［J］.塔里木大學學報，2022，34（2）：8-15.

［19］李興華，鐘麗娟，王晶晶.京大戟與紅大戟的急性毒性和刺激性比較研究［J］.中國藥房，2013，24（3）：208-210.

［20］翁成國.有毒中藥的傳統藥性特征研究［D］.南京：南京中醫藥大學，2013.

［21］ZAMYATINA A，HEINE H. Lipopolysaccharide recognition in the crossroads of TLR4 and caspase-4/11 mediated inflammatory pathways［J］. Front Immunol，2021（12）：649442.

［22］ZHAO Y，COOPER DAVID K C，WANG H Y，et al. Potential pathological role of pro-inflammatory cytokines （IL-6，TNF-α，and IL-17） in xenotransplantation［J］.Xenotransplantation，2019，26（3）：e12502.

［23］權洪峰，閆欣，彭曉東.阿江欖仁酸對LPS 誘導的小鼠 RAW264.7巨噬細胞的抗炎作用初步研究［J］. 醫學信息，2017，30（23）：30-32.

［24］王瓊. 澤蘭和丹參中凝血因子 Xa 抑制成分的研究［D］. 南京：南京中醫藥大學，2013.

（收稿日期：2023-09-12 編輯：劉 斌）