復方中藥提取物凍干精華液對頭皮組織衰老的影響

摘 要 目的：探究復方中藥提取物凍干精華液對頭皮組織衰老的影響。方法：以體外培養的正常人體頭皮組織作為實驗對象，并分為對照組和精華液處理組。采用William完全培養基進行組織培養，然后通過酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光檢測等技術，評估精華液對頭皮組織衰老相關關鍵蛋白的影響。結果：在體外培養的頭皮組織中，精華液在x/5、x/3、x/2濃度下均能將白介素-6表達水平降至基線的1%以下。此外，精華液在x/10濃度下可分別降低25%的8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine， 8-OHdG）表達、48%的硫酸軟骨素蛋白多糖versican表達和19%的髓鞘蛋白零樣蛋白3（myelin protein zero-like 3， MPZL3）表達（均P<0.01），在x/5濃度下可分別降低24%的8-OHdG表達、24%的versican表達和33%的MPZL3表達（均P<0.01）。結論：復方中藥提取物凍干精華液對體外培養的頭皮組織具有抗炎、抗氧化和抗衰老的作用，具有開展進一步臨床研究的價值。

關鍵詞 復方中藥提取物凍干精華液 頭皮組織 抗衰老

中圖分類號：TQ658.3 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）11-0012-05

引用本文 梁曉進， 陳憲策， 倪春雅， 等. 復方中藥提取物凍干精華液對頭皮組織衰老的影響[J]. 上海醫藥， 2024， 45（11）： 12-16； 22.

基金項目：上海市衛生健康領軍人才項目（2022LJ017）；上海市靜安區臨床優勢專病建設項目（2021ZB01）；上海毛發醫學工程技術研究中心項目（19DZ2250500）；上海申康醫院發展中心資助項目（SHDC22022302）

The effect of lyophilized essence of compound traditional Chinese medicine extracts on scalp tissue aging

LIANG Xiaojin1， CHEN Xiance2， NI Chunya3， YANG Kai3， MA Yanyun4， WU Xuefeng5， LIN Jinran1， WU Wenyu1， 3， LIU Qingmei1

[1. Department of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China； 2. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China； 3. Department of Dermatology， Shanghai Jing’an District Central Hospital， Shanghai 200040， China； 4. Human Phenome Institute， Fudan University， Shanghai 200438， China； 5. Bella Medical Technology （Suzhou） Co.， Ltd.， Suzhou 215300， China]

ABSTRACT Objective： To explore the effects of lyophilized essence of compound traditional Chinese medicine extracts on scalp tissue aging. Methods： Normal human scalp tissues cultured in vitro were selected as the experimental subjects， which were divided into a control group and an extracts essence treatment group. The tissues were cultured in William’s complete medium， and the effects of the extracts essence on the key proteins associated with scalp aging were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluorescence detection. Results： In scalp tissues cultured in vitro， the extracts essence could significantly reduce the expression level of interleukin 6 to below 1% of the baseline at the concentrations of x/5， x/3， and x/2. In addition， the extracts essence could decrease the expression levels of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine （8-OHdG） by 25%， versican by 48% and myelin protein zero-like 3 （MPZL3） by 19% at a concentration of x/10 （all P<0.01）， and the expression of 8-OHdG by 24%， versican by 24% and MPZL3 by 33% at a concentration of x/5 （all P<0.01）， respectively. Conclusion： The lyophilized essence of compound Chinese medicine extracts has anti-inflammatory， antioxidant and anti-aging effects on human scalp tissues cultured in vitro and a value of further clinical research.

KEY WORDS lyophilized essence of compound Chinese medicine extracts； scalp tissue； anti-aging

隨著年齡增長，皮膚衰老是一個不可避免的生理過程。頭皮是面部和頸部皮膚的延續，更是毛發生長的基礎。頭皮健康對于維持人的整體外觀和自信至關重要，但與面部皮膚保養相比，頭皮護理常被忽視。頭皮衰老是由多種內外因素共同引起的復雜過程，內部因素包括年齡增長導致的基因變化、氧化應激、炎性反應、微循環減弱和毛囊干細胞活力下降等，外在因素包括紫外線輻照、環境污染和不良生活習慣等[1]。近年來的研究顯示，人參和丹參等中藥提取物具有抗氧化和皮膚修復作用[2-3]，提示中藥在頭皮護理中有廣闊的應用前景。不過，雖然市場上存在眾多含有復方中藥的頭皮護理產品，但在頭皮護理領域，有關復方中藥抗頭皮衰老的研究很少。

本研究對一種由復方中藥提取物制備的凍干精華液進行實驗評估，以探究其在抗頭皮衰老方面的潛在作用及其機制，為開發新型頭皮護理產品提供更多的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

妮雀娜頭皮凍干精華液（以下簡稱精華液），由貝拉醫療科技（蘇州）有限公司提供（配方編號：L514ZC0520/01-2+L514ZC0208/10-1）。該精華液由膚漾舒、悅膚寧、蟲草復方與丹參提取物薇乳DG組成，其中膚漾舒含有人參根、黃花蒿和山楂果的提取物；悅膚寧含有丁二醇和柑橘果提取物；蟲草復方與丹參提取物薇乳DG富含多種植物精粹，包括蛹蟲草、何首烏根、姜根、日本獐牙菜、側柏葉、人參根和丹參根的提取物。

William基礎培養基（美國Gbico公司）；胎牛血清和6孔板（Corning公司）；青霉素-鏈霉素雙抗溶液、氫化可的松和牛胰島素（上海優寧維生物科技股份有限公司）；L-谷氨酰胺[生工生物工程（上海）股份有限公司]；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline， PBS。武漢賽維爾生物科技有限公司）；白介素-6（interleukin， IL-6）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）檢測試劑盒（美國Abcam公司）；正常人體頭皮組織（取自頭皮痣手術切除后廢棄的頭皮組織）。

1.2 實驗方法

1.2.1 William完全培養基配制

取1瓶500 mL William基礎培養基復溫至室溫，然后分別稱取146.1 g L-谷氨酰胺、5 mg氫化可的松和5 mg牛胰島素并依次加入其中，最后再加入5 mL青霉素-鏈霉素雙抗溶液，配制成William完全培養基，用于離體組織培養。

1.2.2 體外頭皮組織培養和精華液處理

取得新鮮頭皮組織后，先進行酒精消毒和PBS清洗，然后使用高壓滅菌過的手術器械剔除皮下脂肪組織，保留表皮和真皮，并切割成大小為1 mm×1 mm的塊狀，再用PBS清洗。將處理好的頭皮組織塊放置于6孔板中，加入2 mL William完全培養基進行氣液界面培養，于37℃和5% CO2條件下孵育24 h以適應環境。24 h后，再加入不同濃度（x/5、x/3和x/2濃度）的精華液（對照組加入等體積的培養基）處理。處理2、4和6 d后，收集培養液上清液并儲存在？80 ℃冰箱中以備ELISA檢測炎性細胞因子IL-6水平等。此外，以x/10和x/5濃度的精華液處理頭皮組織3 d，之后用PBS清洗并用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，對頭皮組織中的DNA氧化損傷、線粒體功能相關蛋白和細胞衰老相關蛋白指標進行免疫熒光檢測。

1.2.3 IL-6水平的ELISA檢測

按照IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書所述準備試劑和標準品。在96孔板中分別加入50 μL的待測樣本（上述上清液）或標準品，然后再向各孔中加入50 μL的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，密封孔板并在室溫下振蕩孵育1 h。用洗滌緩沖液PT洗滌孔板3次，并在最后1次洗滌后去除多余液體。加入顯影液TMB并在黑暗中孵育10 min。加入100 μL終止液，搖動1 min。檢測450 nm波長下的吸光度，并根據標準曲線計算樣本中的IL-6水平。

1.3 數據統計分析方法

使用GraphPad Prism 9.01軟件繪圖并進行統計分析。對于研究數據，先通過Shapiro-Wilk檢驗判斷是否符合正態分布。不符合正態分布的數據，2組間差異采用Mann-Whitney U檢驗；符合正態分布的數據，2組間差異采用獨立樣本t檢驗。3組及以上組間差異采用單因素方差分析。發現總體差異顯著時，采用多重比較方法進行組間分析。統計顯著性水平設為α=0.05。當P<0.05時，認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 頭皮組織中炎性細胞因子IL-6表達水平變化

ELISA檢測結果顯示，精華液對體外培養的頭皮組織中的炎性反應標志物IL-6表達水平具有顯著的下調作用。相較于對照組，給予x/5、x/3和x/2濃度的精華液處理2 d后，體外培養的頭皮組織中的IL-6表達水平均被降低至基線的1%以下（圖1）。這些結果提示，精華液能夠通過降低IL-6的表達水平而抑制頭皮組織中的炎性反應。

2.2 頭皮組織中DNA氧化損傷指標8-羥基-2’-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine， 8-OHdG）表達水平變化

免疫熒光檢測結果顯示，經x/10和x/5濃度的精華液處理3 d后，體外培養的頭皮組織中的8-OHdG表達水平分別降低25%和24%（均P<0.01），且不同濃度精華液組間沒有顯著差異（圖2）。這些結果提示，精華液具有減少頭皮組織中DNA氧化損傷的作用。

2.3 頭皮組織中細胞衰老相關蛋白硫酸軟骨素蛋白多糖versican（VCAN）和糖蛋白36（glycoprotein 36， GP36）水平變化

免疫熒光檢測結果顯示，經x/10和x/5濃度的精華液處理3 d后，體外培養的頭皮組織中的VCAN表達水平分別降低48%和24%（均P<0.001），x/10濃度的精華液下調VCAN表達水平的作用更強（圖3）。然而，精華液處理對于GP36表達水平沒有顯著影響（均P>0.05）。這些結果提示，精華液能夠下調特定的細胞衰老相關蛋白表達水平，具有抗頭皮組織細胞衰老作用。

2.4 頭皮組織中線粒體功能相關蛋白髓鞘蛋白零樣蛋白3（myelin protein zero-like 3， MPZL3）和線粒體編碼的細胞色素C氧化酶亞基1（mitochondrially encoded cytochrome C oxidase subunit 1， MTCO1）表達水平變化

免疫熒光檢測結果顯示，經x/10和x/5濃度的精華液處理3 d后，體外培養的頭皮組織中的MPZL3表達水平分別降低19%和33%（均P<0.01），精華液下調MPZL3表達水平的作用呈濃度依賴性（圖4）。然而，精華液處理對于MTCO1表達水平沒有顯著影響（均P>0.05）。這些結果提示，精華液能夠下調特定的線粒體功能相關蛋白表達水平，具有調節毛囊周期并促進毛囊進入生長期的潛在作用。

3 討論

頭皮衰老是一個復雜的生物學過程，受到多種內外因素的影響，其中氧化應激、炎性反應和基因調控的改變被普遍認為是頭皮衰老的關鍵機制。因此，分析頭皮組織中炎性反應和細胞衰老相關的生物標志物如IL-6、8-OHdG、VCAN、GP36和MPZL3等表達水平的變化對頭皮衰老研究具有重要意義。已有研究顯示，炎性細胞因子（如白介素-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α）表達水平的上調與皮膚膠原蛋白的降解、彈性纖維的無序化和細胞衰老有關[4]。另有研究揭示，VCAN在毛囊真皮乳頭細胞（dermal papilla cells， DPC）中表達水平的下調是人類毛囊衰老的一個顯著特征[5]。此外，與年輕女性相比，年齡>40歲的女性頭皮組織中的GP36表達水平在毛囊乳頭網狀層中下調，并在真皮鞘細胞中上調，提示其與頭皮衰老有關[6]。皮膚組織中活性氧的產生與細胞代謝和長期暴露于太陽長、中波紫外線有關，過高的氧化壓力會導致線粒體DNA損傷，繼而引發衰老表型[7]。8-OHdG作為DNA氧化損傷的生物標志物，在指示細胞活性氧水平方面具有重要價值[8-9]。MPZL3作為核基因編碼并定位于線粒體的蛋白，不僅是調節毛囊周期的關鍵信號因子，且與正常上皮細胞分化功能密切相關[10-11]。研究顯示，在敲除MPZL3的小鼠模型中可觀察到皮脂腺增生、皮脂分泌過多和毛囊生長周期加速[12]。MTCO1組成細胞色素C氧化酶，其表達水平與線粒體有氧代謝功能密切相關。

本研究對復方中藥提取物制備的凍干精華液進行實驗評估，發現其對頭皮衰老有顯著影響。本研究結果顯示，精華液能有效下調頭皮組織中的IL-6表達水平。在禿發的頭皮組織中，二氫睪酮會誘導禿發區域DPC中IL-6表達水平的上調，而IL-6作為一種由DPC分泌的旁分泌介質，可通過抑制基質細胞的增殖而影響毛發生長[13]。因此，IL-6表達水平的下調有助于改善頭皮組織環境，促進毛囊健康。此外，有研究表明，頭皮組織中的自由基積累在禿發開始前就已經出現，并且與毛囊干細胞的自我更新能力喪失有關[14]。本研究結果顯示，精華液能顯著下調頭皮組織中的8-OHdG表達水平，提示精華液可控制細胞內活性氧水平，減少細胞的氧化損傷。精華液也能下調上皮層內的MPZL3表達水平，提示精華液可能是通過影響毛囊生長周期而發揮抗頭皮衰老作用的。

在中藥抗皮膚衰老研究領域，一方面，已有大量研究表明多種中藥及其提取物能夠通過抗氧化、增強免疫力、調節皮膚代謝和促進膠原合成等機制而發揮延緩皮膚衰老的作用[15-16]。例如，人參皂苷能夠下調人角質形成細胞內的炎性細胞因子表達水平，從而發揮抗氧化和抗衰老的作用[17-18]。何首烏的有效成分在D-半乳糖誘導的小鼠衰老模型中也顯示具有降低活性氧、一氧化氮和胰島素樣生長因子-1水平的保護效應[19]。丹參的有效成分可以減少腫瘤壞死因子-α誘導的活性氧的產生和降低NADPH氧化酶的活性，并抑制白介素-1受體相關激酶1、4等炎性反應通路[20-21]。另一方面，中醫學認為皮膚的衰老與肺脾腎三臟臟腑功能失衡關系密切，使用中藥補腎健脾、調節陰陽、調理氣血等有助于延緩皮膚衰老過程[22]。隨著中藥抗皮膚衰老研究的深入，復方中藥的重要性日益凸顯。相關研究顯示，一些復方中藥提取物在動物模型中能夠調節多種與皮膚衰老相關的炎性細胞因子和氧化應激生物標志物水平，對改善衰老表型有積極的作用[23-25]。鑒于復方中藥成分的復雜性，未來研究的重點將是在人體中驗證這些作用，并比較復方中藥與單體中藥在療效和對機體影響方面的差異。

綜上所述，本研究通過體外實驗評估了一種由復方中藥提取物制備的凍干精華液的抗頭皮衰老作用，結果顯示其能下調頭皮組織中炎性反應和衰老相關生物標志物的表達水平，具有抗頭皮衰老的治療潛力。未來需進一步探究該精華液的具體作用機制，并評估其在人體中的有效性和安全性。

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