根際微生境中生化過程的原位可視化研究進展

摘要： 根際及近根際區域（根際微生境） 進行著活躍的物質交換和能量流動，大部分陸地生態系統中碳、氧和礦質元素等關鍵生源要素循環的生化過程都發生在根際微生境中。根際微生境空間動態過程的可視化對于準確捕捉和量化根際界面物質遷移轉化過程和功能至關重要。過去幾十年中，采用二維成像方法進行營養元素、酶和微生物等多種生化過程的同步原位可視化研究取得了重要進展。本文系統總結了根際化學環境、微生物環境和代謝物原位可視化研究的最新方法與研究進展，討論了多參數成像技術在根際微生境研究中的應用前景，并對根際生化過程原位可視化研究的未來發展方向及亟待解決的問題進行了展望。為進一步提高根際原位可視化技術的研發與應用，深入解析微生境中生化過程與機制，需要在以下幾方面重點展開研究：1）開展操作簡單、耗時少、成本低的可視化技術開發，并進行多參數及多手段耦合的兼容性驗證；2）從樣品制備和數據整合等方面，開發根際三維及四維可視化方法，探索根際微生境的時空動態可視化；3）研發便攜式儀器，開展根際原位可視化技術的田間應用。

關鍵詞： 根際微生境； 多參數成像技術； 原位可視化

植物?土壤相互作用是地球關鍵帶中最重要的生物與環境互作過程之一，根際是植物?土壤?微生物互作的核心界面，決定著自然生態系統的多功能性和農業生態系統的可持續性和生產力[1?2]。自Hiltner提出“根際”的概念之后，其被廣泛應用于土壤學、植物學和微生物學等學科研究中。根際中進行著活躍的物質交換和能量流動，直接影響著陸地生態系統中關鍵要素如碳、氧和礦質元素的循環，而大部分生化過程實際上都發生在根際微區中。根際微生境下，根系、土壤、根系分泌物和生物體之間強烈的相互作用驅動了根際生物化學過程[3?5]。

隨著多組學技術與機器學習的迅猛發展，學界在元素生物地球化學循環、根際代謝物介導的植物?微生物互作和微生物群落組裝模式等根際生化過程研究方面取得了顯著成果[6?8]。然而，受限于原位可視化技術，根際微生境的多種生物化學過程很大程度上仍處于“黑箱”狀態。與破壞性方法相比，可視化技術得到的根際范圍準確性可提高3～5 倍[9]。因此，根際微域空間動態過程的可視化對于捕捉和量化根際界面物質遷移轉化過程和功能至關重要[9]。由于根際多組分的復雜性，為了實現不同生化參數的可視化，需要開發基于多尺度（亞微米～厘米） 的實驗設計和測試技術[4]。然而，由于各方面條件的限制，目前大多數根際可視化研究都在半人工實驗裝置中模擬田間條件，而對根際微生境生化過程的可視化研究仍處于起步階段[4]。可見，目前對根際的實際情況特別是根?土界面的多要素空間分布特征只有模糊的了解，在根際微區可視化方面研究仍存在巨大挑戰。

過去十年，前人已從不同方面回顧了根際微生境相關研究進展。例如，Oburger 等[4]系統綜述了根系分泌物的收集、植物?微生物互作及根際過程可視化的最新方法與技術。Védère 等[10]總結了土壤微生境中微生物及其活動的成像方法。近期，Li 等[11]重點綜述了土壤/沉積物研究中常用的微尺度采樣和二維成像方法，歸納了其研究進展和應用成果，并從研發方向和應用領域等方面對土壤、沉積物微尺度研究技術進行了展望。然而，已有的研究主要從總結單一技術的特性角度出發，針對根際特定生化過程的可視化方法研究進展尚缺乏系統性的總結。此外，依賴于斷層掃描技術，根系系統結構和水力特性可視化已被廣泛揭示[12]，而根際化學環境、微生物環境和根際代謝物等核心生物化學過程原位可視化的研究進展鮮有關注。因此，本文在強調根際微生境的范圍與特性的基礎上，旨在總結近年來在根際微生境生化過程非破壞性成像方向的進展，簡要歸納了不同生化參數的主流成像技術及優勢、存在的問題，最后展望了根際微生境原位可視化的未來努力方向，以期為根際過程研究提供參考。

1 根際微生境的范圍與功能

土壤中生物化學過程主要發生在根際微域，且會被周圍巨大的土體“稀釋”，這使得根際成為土壤乃至陸地生態系統中最重要的熱點區域[9]。“根際”通常指受植物根系影響的土壤，也可擴展為根?土界面，細分為外根際（ectorhizosphere）、根表（rhizoplane）和內根際（endorhizosphere） 3 個微生境[4， 13]。與內根際相比，外根際和根表微生境直接與土壤接觸，且由于受到根系的影響，其生物化學性質呈現高度的異質性和復雜性。此外，根際微生境存在以下特點：1） 根際的隱蔽性；2） 常規破壞式采樣方法易造成界面間功能和空間聯系消失；3） 根際邊界范圍和形狀不清晰；4） 不同生化參數的變化方式迥異；5） 時空波動造成難以捕捉根際瞬時狀態[14?15]。上述特性致使獲取根際微生境不同生化參數的準確范圍困難重重。

Kuzyakov 等[9]根據已有文獻，梳理了部分根際生化過程參數的邊界范圍和變化特征。其中，微量營養元素和重金屬的活動范圍最小，通常為0.5～1 mm，呈現出從外根際向根表遷移并逐漸耗竭的現象，這是由于部分元素向根表的擴散速率低于根系吸收速率所致[16]。土壤酶分子量較大，造成難以擴散，因此其活性的根際范圍約為1～3 mm，呈現由根表向外根際活性減弱的趨勢[17]。同位素成像發現，根系分泌物的根際范圍僅為2～3 mm[18]。Ca2+、Mg2+、NH4+及PO43?等養分和pH 的根際范圍為2～4 mm[19]。只有部分參數的根際范圍gt;4 mm，如O2、CO2、水和微生物，其中CO2 可擴散至距根表12 mm，這是由于根和根際微生物的呼吸作用造成的[20]。值得注意的是，微生物的根際范圍是根系分泌物的2 倍。可見，微生物可捕獲部分根系分泌物，根際對微生物的影響大于根系分泌物所能擴散的距離[9]。由上述研究可知，根際各個生化參數并非獨立存在，而是處于劇烈的相互作用中（圖1）。正因如此，精細刻畫不同參數的準確范圍，實現根際微生境生化過程的原位可視化尤為迫切。

2 原位可視化在根際生化過程中的應用

2.1 根際化學環境可視化

2.1.1 pH、O2 和CO2

pH、O2 和CO2 是影響根際生化過程及其功能的關鍵要素。早在20 世紀80 年代，有學者就進行了根際pH 值可視化的探索，將含有溴甲酚紫（pH 4.5～7.5） 或溴甲酚綠（pH 3.8～5.4）染料的瓊脂粘附在根箱可拆卸側的根土界面上，通過熒光激發、相機拍攝研究根際pH 的微區分布特征[21?22]。在此之后，基于熒光化學光學感應膜整合成像技術快速發展，成像對象逐漸擴展到O2、CO2、H2S、Fe2+、Mn2+、NH4+和溫度等參數[23?26]。近年來，模塊化成像系統 （VisiSens，PreSens Precision SensingGmbH，德國）[20]和平面光極分析儀 [Easysensor PO2100/1100，中科智感（南京） 環境科技有限公司][26]等商業化產品的出現，使得根際pH 值的可視化更加便捷高效。此外，依托于平面光極技術（PO），利用不同熒光化學光學感應膜實現了pH、O2 和CO2 等參數的同步定量可視化研究[27]。上述手段可通過在室內模擬及田間試驗構建根土界面，測定pH、O2 和CO2 等參數在根際微域的時空分布特征，從而揭示根際微生境酸化、泌氧及CO2 排放等生物化學過程與功能，具有原位非破壞、實時性、高分辨率及用戶友好的特性[26]。

2.1.2 礦質營養元素

礦質元素的根際空間分布特征表征目前主要采用薄膜擴散梯度（DGT）。該技術最初主要用于水體污染物和微量元素的有效性測定[28]，近年來被廣泛應用于土壤養分和污染物的生物有效性評價[11， 29?31]。DGT 主要由濾膜、擴散層和固定層組成，通過模擬根系吸收并耦合激光剝蝕電感耦合等離子體質譜儀（LA-ICP-MS） 獲取元素的二維空間分布[32]。利用這一技術，可獲取包括鐵（Fe）、鈣（Ca）、銅（Cu）、錳（Mn）、鋅（Zn）、鉬（Mo）、鎂（Mg）、鉀（K）、硫（S） 和磷（P） 等大部分礦質元素的根際空間分布特征[29]。例如，有研究利用DGT 成像，發現部分植物根表表現出P 耗竭特征，據此證實根系表面吸收P 速率高于P 從土壤向根表的擴散速率[19， 30， 33]。此外，利用納米二次離子質譜技術（NanoSIMS） 亦可高分辨率繪制部分礦質元素（如P、Si、S、Fe 等） 的根際空間分布圖，可在亞微米尺度上揭示植物?礦質元素?微生物的根際互作機理[4]。

2.1.3 污染物

與礦質營養元素類似，重金屬等污染物的根際二維分布特征表征亦主要采用DGT 開展。Kreuzeder 等[34]首次采用DGT 同時得到了根際陽離子（Cu、Mn 和Zn） 和陰離子[P 和砷（As）] 的高分辨空間分布圖像。基于DGT 元素分布表征和通量計算，發現水稻根尖O2 富集與酸化是造成根際土壤As、鉛（Pb） 和Fe （Ⅱ） 活化的重要原因[35]。類似的，銻（Sb， Ⅲ） 在水稻根際沿根軸及根尖區域呈明顯活化過程，且峰值出現在根表區域[36]。相反的，Smolders等[37]首次發現鎘（Cd） 在玉米根際呈現耗竭現象，這主要是由于Cd 的吸收受擴散控制所致。鎳（Ni） 超富集植物Odontarrhena serpyliffolia 和非富集植物Holcus lanatus 根際均顯示Ni 耗竭現象，但富集型植物耗竭區范圍為非富集型的4 倍[38]。Corzo 等[39]利用同步輻射微X 射線熒光光譜和X 射線吸收近邊緣結構成像技術，研究了As 在甘藍蕨和蜈蚣草根際?根界面的原位分布，發現As 可從富砷土壤中的根系向對照土壤中的根系遷移。

對于有機污染物而言，由于缺乏有效吸附有機污染物的膜材料，其根際空間分布至今仍未見報道，僅有少量研究發現了新興有機污染物在植物根系內的分布特征。譬如，Wang 等[40]利用解吸電噴霧電離質譜（DESI-MS） 發現，全氟辛烷磺酸（PFOS） 和全氟辛酸（PFOA） 在美人蕉和再力花、風車草及蘆葦根的表皮、皮層和維管束中有分布。近期，Chen 等[41]發現，全氟聚醚類（HFPO） 替代物和PFOA 主要累積在生菜根的表皮細胞和皮層中，而且在皮層中的含量遠高于相鄰表皮細胞。隨著吸附膜材料研發的進步，有機污染物的根際空間分布將被逐步揭示。

2.2 根際微生物環境可視化

可視化對于深入揭示微生物與土壤?植物根際互作至關重要。早期的切片?體式顯微鏡方法存在難以區分目標微生物的缺陷[42]。熒光染料與表觀熒光顯微鏡的結合，可以從背景中區分目標微生物體，進而實現細菌和真菌的空間定位和量化。與之相比，掃描和透射電子顯微鏡（SEM 和TEM） 的分辨率（0.5～1 nm） 要高得多，但所需的土壤固定、脫水、包埋和切片等步驟繁瑣[10， 43]。近年來，熒光原位雜交（FISH）、納米二次離子質譜技術（NanoSIMS）[ 4 4 ]和FISH-NanoSIMS 等技術逐漸應用到微生物可視化研究中。近期，Cao 等[45]開發了一種可容錯編碼的序貫熒光原位雜交（SEER-FISH） 技術，該方法可識別復雜群落中的不同微生物物種，在單細胞尺度上原位解析微生物物種之間以及微生物?宿主之間的相互作用。然而，現有研究主要采用室內培養基條件，微生物的根際原位可視化仍鮮有報道。此外，微生物可視化方法需要使用的部分儀器（如NanoSIMS）可用性較差，這限制了微生物可視化方法的進一步開發。

2.3 根際代謝物可視化

2.3.1 根系分泌物

根系分泌物能夠改變根際土壤理化性質，是造成根際土和非根際土之間根本區別的主要原因[46]。根系分泌物的原位高分辨率成像方法開發尤其艱難，這是由于根系分泌物組成復雜，根際生物與非生物因子交織所致。大多數根系分泌物的采集方法為破壞式，且不同采樣方法結果差異較大[14?15， 47]，無法提供樣品中目標分析物的準確空間分布。目前為止，根系分泌物的成像仍主要依賴于同位素標記[48?49]，但其效果受多種因素影響，如根中1 4C 活性、根半徑、根表到成像屏幕的距離、土壤中根系分泌物的數量等因素強烈影響成像信號的分布[50]。最為關鍵的是，同位素成像至今無法獲得某一特定根系分泌物的根際空間分布特征，這極大地限制其廣泛應用。

近年來，針對根系分泌物可視化研究的探索并未停止。Hoang 等[51]采用優化的熒光顯色法獲得了根際葡萄糖的分布圖像，也有研究利用基質輔助激光解吸電離質譜（MALDI-MS） 獲得地錢蘋果酸分泌物的空間分布[52]，但上述研究采用的人工基質與實際的根?土界面相差甚遠。Tiziani 等[53]采用DGT-氫氧化鋯結合凝膠，結合離子色譜表征了白羽扇豆根系分泌物檸檬酸的原位空間分布，但該方法過程較為復雜、容易交叉污染，分辨率較低。Veli?kovi?等[54]首次利用疏水性聚偏二氟乙烯（PVDF） 蛋白印跡膜和MALDI-MS 對根際代謝物進行了原位空間分布研究，發現了不同代謝物的空間分布特征。近期，Liu等[55]利用親水性PVDF 膜耦合DESI-MS 分析，實現了根系分泌物的原位定量成像，具有操作簡單、分辨率高、干擾少等特點。盡管已有方法仍存在分辨率低的局限性，但這無疑為根系分泌物的可視化帶來了新的思路。上述方法與平面光極、原位酶譜等技術的耦合有望實現根系分泌物、礦質元素、pH、O2 和CO2 的同步空間可視化。

2.3.2 微生物代謝物

微生物代謝物的可視化可為重要生物活性分子的發現、微生物菌落的代謝交流等過程提供直觀證據[56]。有學者耦合熒光原位雜交（FISH） 顯微鏡技術和高分辨率大氣壓基質輔助激光解吸/電離質譜技術，在同一組織切片上獲得了宿主和共生體代謝物的空間分布[57?58]，實現單細胞水平的空間代謝組學檢測。此外，二次離子質譜（SIMS）亦被報道可用于單細胞水平下的微生物代謝物可視化[57]。可見，質譜成像已成為發現微生物重要代謝物的重要平臺。不僅如此，微生物之間的化學對話亦獲得可視化。通過質譜成像技術，Moree 等[59]觀察到銅綠假單胞菌的吩嗪代謝物可被煙曲霉轉化，造成毒性增強并誘導真菌產生鐵載體。然而，上述有關微生物代謝物的可視化研究均基于培養基培養，原位根際土壤中微生物代謝物的空間分布特征仍鮮有報道。近期，有方法原位可視化獲得了根際代謝物的空間分布，目標代謝物從小分子擴展到高分子量代謝物[54?55]，但無法將根系分泌物和微生物代謝物區分開來。未來借助上述手段的改進，有望實現土壤微生物代謝物的原位高分辨可視化。

2.3.3 酶活性

根際酶活性的可視化目前主要依賴于原位酶譜技術。將含有特異性熒光標記底物吸附膜貼附在根土界面表面，底物與土壤酶反應生成的熒光產物信號可轉換為酶活性及其空間分布信息[48， 60?61]。原位酶譜技術在十年間發展迅猛，目前主要應用于土壤C、N、P 和S 循環相關的水解酶和氧化酶[17]。借助其非損傷、原位的特點和空間分辨率較高的優勢，原位酶譜技術克服了傳統土壤酶學技術的不足，為揭示土壤微觀生態過程及土壤?根系?微生物相互作用的微生境過程提供了直觀的證據[60]。已有數篇文獻綜述了原位酶譜的特點與應用前景[17， 60， 62]。然而，原位酶譜尚缺乏統一的技術規程，仍存在操作方法混亂和應用范圍較窄等問題[60]。

3 原位可視化多手段的耦合

多參數的同步原位可視化是解析根際生化過程的必由之路。近年來，原位可視化多手段的耦合逐漸引起學界的廣泛關注，并在土壤學、植物營養、農業資源與環境等多學科領域取得重要進展（表1）。Wei 等[49]聯合平面光極、酶譜和14C 成像進行pH、酶活性和根系分泌物3 種生化參數的同步可視化分析，量化并定位了水稻根表鐵膜對根際微氧區域有機質穩定的貢獻，進而評估了其對水稻土全球碳固存的作用。Liu 等[ 5 5 ]將DGT-LA-ICP-MS 與DESIMS成像分析相結合，表明DGT 與DESI 成像分析相結合在技術上是可行的，可以亞毫米分辨率同步定量測定元素和根系分泌物的根際空間分布。Li 等[29]利用平面光極（PO） 和薄膜擴散梯度（DGT） 等高分辨采樣和分析技術，發現苦草根系泌氧和根際酸化改變了沉積物中微量金屬的生物有效性，對Fe、As、Co 等元素的生物有效性起到抑制作用，而對Mn、Ni、Sb 和Cu 的生物有效性起到促進作用。由此可見，原位可視化多手段的耦合可在微觀尺度上提高現有根際多參數的范圍準確度。然而，目前的研究僅限于同步觀測2～3 個生化過程指標，多參數的根際可視化亟需開展多手段的耦合。

多手段聯用所面臨的限制因子，是雙方或多方的結合是否相互影響以及方法的兼容性如何。譬如，Hummel 等[30]通過DGT 與原位酶譜聯用，發現狹葉羽扇豆根際存在磷損耗與磷酸酶富集現象。然而，原位酶譜所需的4-甲基傘形酮酰磷酸酯中含有微量磷，這可能影響DGT 測定磷的準確性，因此建議DGT 取樣應先于酶譜分析，從而減小二者的相互影響。Védère 等[10]建議，在進行多種手段耦合時，首先進行不需要特定準備的方法（如X 射線或斷層掃描），其次是平面探針或凝膠法（如酶譜或平面光極），然后是需要制備薄片的方法，最后是對物體表面造成不可逆地損壞的方法（如SEM、LA-ICP-MS）。因此，在進行多種方法聯用時，有必要針對特定方法的樣品制備需求，選定多手段聯用的測試程序，從而最大限度減少方法間的相互影響，提高方法間的兼容性，以利于方法的推廣。

4 展望

獲取根際微生境生化過程的原位可視化證據，可促進我們對土壤熱點區域發生的物質轉化與能量流動的深入理解，有助于填補土壤“黑箱”的諸多研究空白。盡管近年來在根際過程的成像上取得了較多的重要進展（圖2），然而在根際時空動態可視化、多參數成像技術及可視化的田間應用等方面仍然存在較多的不足，未來需從以下3 個方面展開更深入的研究：

1） 根際微生境多參數的同步可視化。在根際中，多種生化過程往往同時發生，且在空間上具有重疊特征。例如，缺磷脅迫下，植物根際pH、有效磷、根系分泌物、磷酸酶活性和微生物群落結構均發生響應，但上述多種參數的同步空間分布特征仍不清晰。已有關于根際可視化的研究大多僅觀測2～3 個生化過程參數，亟需開展多手段的耦合，實現多參數的根際可視化。因此，技術開發仍然是多參數同步可視化的重要前提，特別是操作簡單、耗時少、成本低的方法開發尤為迫切。此外，不同方法之間的兼容性和組合優化尚需開展更多的驗證工作。

2） 根際微生境的時空動態可視化。時間動態是全面認識根際微生境中生物地球化學過程的關鍵，但已有的根際可視化研究仍較少涉及時間動力學，這主要是由于在構建時間序列時所需的樣品制備以及分析繁瑣所致，而分析儀器耗時較長且費用昂貴是限制其發展的另一重要因子。此外，除X 射線計算機斷層掃描等技術外，大部分可視化技術僅能獲取二維空間分布圖。因此，在拓展二維空間可視化參數的同時，應積極開發根際三維乃至四維可視化方法。未來可從三維可視化技術開發、樣品制備和數據整合方法等方面進行深入探究。

3） 根際原位可視化技術的田間應用。由于根際微生境空間分辨率的要求、田間條件的不可預測性，以及缺少便攜式儀器，已有研究主要在實驗室內模擬田間條件下，基于根箱或微根窗培養等方法構建根?土界面，探究根際生化參數的空間分布特征。然而，模擬獲得的根?土界面可能與田間條件在根系構型、化學和微生物環境等諸多方面有較大差異。因此，亟需開展根際可視化技術在田間的應用驗證。

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作者簡介：

顧文杰，博士，廣東省農業科學院農業資源與環境研究所所長，三級研究員，博士生導師，國家農業環境微生物種質資源庫（廣東）主任，擔任農業農村部南方植物營養與肥料重點實驗室主任、廣東省耕地保育與資源循環利用重點實驗室主任、中國植物營養與肥料學會副理事長、廣東省土壤學會副理事長。長期致力于微生物?植物互作與廢棄物資源化利用等研究。近年主持國家自然科學基金項目、國家重點研發項目子課題、廣東省自然科學基金、廣東省科技計劃重點項目及產學研項目等30 余項國家及省市級項目，發表論文50 余篇，獲授權專利20 件，參編專著3 本。研究成果分別獲教育部科技成果1 項、廣東省科技進步獎二等獎2 項、廣東省農業技術推廣獎一等獎1 項和二等獎3 項。

劉 沖，博士，廣東省農業科學院農業資源與環境研究所助理研究員，主要從事植物?微生物根際互作、土壤?植物系統微量元素行為等研究，主持國家自然科學基金青年基金、廣東省自然科學基金面上項目等項目，作為主要成員參與國家重點研發計劃、國家自然科學基金等多項國家、省部級項目。以第一作者在國內外重要學術刊物上發表學術論文10 余篇。獲廣東省農業技術推廣獎二等獎1 項。

基金項目：廣東省農業科學院農業資源與環境研究所科技條件平臺創新項目（ZHS2023-01）；國家自然科學基金項目（42307410）；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（2024A1515011125）；廣東省重點領域研發計劃項目（2023B0202010027）；“十四五”廣東省農業科技創新九大主攻方向“揭榜掛帥”項目（2023SDZG08）；廣東省科技計劃項目（2021B1212050020）；十四五新興學科團隊項目（202121TD）。