Trametes hirsuta 漆酶的分離純化及其對活性染料脫色研究

關鍵詞： 粗毛栓菌； 漆酶； 分離純化； 染料脫色

中圖法分類號： Q939.5 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）01-0076-08

漆酶是一種古老的含銅多酚氧化還原酶，最早發現于日本漆樹中（Rhusvernicifera）[1]，屬于銅藍氧化酶。漆酶來源廣泛，在植物、真菌、以及少數動物和細菌中都有分布[2-3]。它以氧氣為電子受體，能氧化酚類和部分非酚類化合物，且底物專一性較低，是一種環保型的天然酵素。漆酶的研究已經持續了100 多年，近年來仍是生物學、化學和環境等學科十分活躍的研究熱點，其研究內容主要涉及漆酶菌株的篩選鑒定、漆酶的分離純化、漆酶酶學性質、漆酶的結構與催化反應機理、漆酶基因的生物信息學分析、和漆酶的應用等方面[4-5]。漆酶在紙漿生物漂白、染料降解脫色、環境污染物脫毒、有機合成、生物檢測等領域具有廣闊的應用前景，尤其在染料廢水脫色領域的應用研究取得了長足發展[6-9]。

合成染料廣泛應用于紡織、造紙、印刷和化妝品行業，由于很多染料具有生物毒性甚至致癌、致畸、致突變作用，染料廢水給生態環境帶來了很大隱患[10]。染料廢水具有產生量大、危害性強、難于生物降解等特點，而且染料通常耐光、水和氧化劑，并且難以通過物理或化學過程降解。生物酶法催化染料脫色具有條件溫和、可脫色染料類型廣泛、脫色效率較高、成本低等優勢。因此，染料的脫色通常酶法優于物理化學方法，從而越來越多研究者開始關注酶法染料脫色[11]。酶法染料脫色主要使用的酶是木質素降解酶，如木質素過氧化物酶 （Lignin Peroxidases， LiP）、錳過氧化物酶 （Manganese Peroxidases， MnP）和漆酶[12]。其中漆酶尤其是真菌漆酶具有在自然界中分布廣，作用底物廣泛，催化活性高、降解徹底以及適用強等優點，已成為降解天然染料和合成染料最具潛力的酶類[13-14]。

染料根據結構分為蒽醌類染料、偶氮類染料和三苯甲烷類染料等。蒽醌類染料可直接被漆酶氧化脫色，但是有時添加介體可促進漆酶對蒽醌類染料的脫色。黃麗萍利用枝孢菌Cladosporium sp. KR14 漆酶對茜素紅（蒽醌類染料）直接脫色，24 h 茜素紅的脫色率為42.65%，添加介體紫脲酸（Violuric acid，VA），24 h 后漆酶對茜素紅的脫色率提高到82.79%[15]。大多數偶氮類染料不能被漆酶直接脫色，借助介體可以提高漆酶對偶氮類染料脫色效率。Ma等[16]研究表明白腐真菌Ganoderma sp. En3 漆酶粗酶液對偶氮染料活性橙16 有一定的脫色效果，介體丁香醛對于活性橙16 的脫色具有顯著的促進作用。部分三苯甲烷類染料可以在漆酶單獨作用下進行脫色，但所需時間較長，加入介體后可以明顯提高脫色效率，劉友勛利用雜色云芝Coriolusversicolor 漆酶對代表性三苯甲烷類染料孔雀石綠的脫色研究表明漆酶介體（ABTS）系統對孔雀綠的脫色效率比單獨使用漆酶要高出10倍[17]。Shou-Nan Wang 等利用毛栓菌Trametes sp.F1635 漆酶與介體組成的漆酶/介體系統（Laccase mediator systems，LMS）對三種偶氮類染料（鉻黑T、伊文思藍和甲基橙）、三種三苯甲烷類染料（溴酚藍、堿性品紅和孔雀石綠）、一種蒽醌類染料（活性藍）和一種噻嗪類染料（亞甲基藍）進行脫色，結果表明降解伊文思藍、堿性品紅、活性藍、甲基橙和孔雀石綠的最適介體為紫脲酸，降解鉻黑T 的最適介體為乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS），而介體1-羥基苯并三唑（HBT）則對八種染料的脫色無顯著促進作用[18]。由于介體成本通常較高，且合成介體具有潛在的環境毒性，不易回收，容易造成環境二次污染。因此，急需尋找無介體的漆酶催化染料脫色體系解決上述瓶頸問題。

本研究中使用的粗毛栓菌（Trameteshirsuta）具有較高的漆酶生產潛力。液態培養發酵后，經硫酸銨分級沉淀和DEAE Sepharose FF陰離子交換層析對Trametes hirsuta 漆酶進行了分離純化。進一步的實驗表明，Trametes hirsuta漆酶無需介體可對三苯甲烷類染料孔雀石綠和溴酚藍進行高效脫色，顯示出了Trametes hirsuta漆酶在染料脫色中的較大工業應用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗室保存的Trametes hirsuta 菌株。菌種接種于斜面麩皮固體培養基中4 ℃保存。將斜面保存的菌種接種于麩皮固體培養基平板上30 ℃恒溫培養7 d 后，取菌體接種于麩皮液體培養基進行液態發酵，約7 d 后收集發酵液。發酵液用八層紗布過濾放入礦泉水瓶中，-20 ℃條件下冷凍過夜，再自然解凍，離心去除多糖等雜質得漆酶粗酶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 漆酶活性和蛋白濃度測定 漆酶的活性測定采用ABTS法[19]，具體過程為：以ABTS為底物，其濃度為1 mM，總反應體積為3 mL，反應體系含有2.4 mL pH 4.8，20 mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液，0.45 mL ABTS 溶液和經適當稀釋的酶液0.15 mL，測定波長為420 nm，消光系數為ε=36 000 M-1?cm-1，檢測溫度為30 ℃，檢測時間為3 min。該條件下，每分鐘轉化1 μmol ABTS 所需酶量定義為一個酶活單位（U）。

以牛血清蛋白作為標準品，采用Lowry 法進行蛋白質濃度的測定。

1.2.2 漆酶的分離純化 粗酶液經硫酸銨分級沉淀后，用截留分子量為10 kDa 的透析袋，在pH 4.8，20 mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液中于4 °C透析去除硫酸銨，使用10 mL 截留分子量為10 kDa 的超濾管超濾濃縮。透析濃縮樣品加載到預平衡的DEAE-Sepharose FF 陰離子交換層析柱上，分別用含0.1 M和0.2 M NaCl 的40 mM醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.8）進行階段洗脫，收集洗脫液。根據核酸蛋白檢測儀檢測的洗脫曲線，測定蛋白峰所對應收集管中洗脫液的酶活，把酶活較高的洗脫液合并到一管，測定其酶活，取樣用于SDS-PAGE電泳。

1.2.3 SDS-PAGE 電泳檢測 經過上述步驟純化的漆酶使用SDS-PAGE電泳法測定漆酶分子量、檢測其純度。SDS-PAGE 分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳膠用考馬斯亮藍R-250進行染色。

1.2.4 漆酶對染料的脫色 反應體系為10 mL，定量酶活，染料液和酶液體積比為1∶1，在恒溫水浴鍋中進行脫色反應，在染料最大吸光度下測其吸光值，根據同一染料在相同條件下吸光值的變化來求得脫色率，染料脫色率根據下式計算。

脫色率=（A₀－A_t）×100％

A₀為反應前最大吸收波長處染料溶液的吸光值；A_t為反應t 時間后最大吸收波長處染料溶液的吸光值。

10mL 的反應體系：取染料母液0.4 mL，pH 4.8緩沖液4.6 mL，酶活0.60 U/mL，30 ℃水浴，測定結晶紫、溴酚藍、孔雀石綠，詹姆斯綠B6 h內的脫色率，每隔1 h測定1次。

染料濃度對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響：10mL反應體系，溴酚藍和孔雀石濃度分別為10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，20 mM、pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，酶活為1 U/mL 條件下40 ℃反應210 min，每隔30 min測1次吸光值。

溫度對染料脫色率的影響：10 mL 反應體系，20 mM、pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，溴酚藍濃度為40 mg/L，孔雀石綠濃度為50 mg/L，酶活為1 U/mL，相同的反應條件下分別在30 ℃ 、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃溫度時進行脫色反應210 min，每隔30 min 測染料液的吸光值，根據公式計算脫色率，比較不同溫度對脫色率的影響。

pH 對染料脫色率的影響：使用pH 3.5、pH4.5、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0 濃度為20 mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液，反應溫度40 ℃，酶活1 U/mL，溴酚藍40 mg/L，孔雀石綠50 mg/L，反應210 min，每隔30 min測1次吸光值。

Nacl 對脫色率的影響：反應體系中的NaCl分別為10 mM、20 mM、50 mM，溴酚藍40 mg/L，孔雀石綠50 mg/L，40 ℃、酶活1 U/mL 時進行脫色反應210 min，每隔30 min 測1 次吸光值。

2 結果與分析

2.1 漆酶的純化結果

漆酶各步純化得率和純化倍數總結為表1，酶活力總回收率為57.2%，純化倍數6.0 倍，比活力為758.5 U/mg。

2.2 DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析

離子交換柱層析法是高度分離純化蛋白質的技術手段。因真菌漆酶的等電點大都在酸性范圍，本研究選用了DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱分離粗毛栓菌漆酶。如圖1 所示，以0.1和0.2 M NaCl 洗脫時分別出現了2個主要蛋白峰，其中第一個蛋白峰的漆酶活力最高，是Trametes hirsuta 的主要漆酶部分，對該漆酶高活性組分進行收集。

2.3 SDS-PAGE電泳檢測

純化后漆酶的SDS-PAGE 電泳圖譜如圖2所示，電泳結果顯示，純化漆酶表現為一條蛋白帶，說明已達到電泳純，根據與標準蛋白相對分子質量對比，該漆酶的相對分子質量大概為50 kDa且為單亞基蛋白。

2.4 漆酶對染料的脫色

2.4.1 漆酶對結晶紫、溴酚藍、孔雀石綠、詹姆斯綠B 的脫色 不添加介體情況下，結晶紫、溴酚藍、孔雀石綠、詹姆斯綠B 在30 ℃ 、pH 4.8、0.60 U/mL的酶活條件下經過6 h 脫色反應，結果發現結晶紫和詹姆斯綠B的脫色情況較差，脫色率分別為14.02%，10.13%；而溴酚藍和孔雀石綠的脫色率較高，溴酚藍脫色率58.18%，孔雀石綠脫色率68.33%（圖3）。

2.4.2 染料濃度對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響 40 ℃、酶活1 U/mL、pH 4.8條件下對不同濃度的溴酚藍和孔雀石綠進行210 min的脫色反應。結果表明，兩者的脫色率都受染料濃度的影響（圖4）。溴酚藍和孔雀石綠濃度分別為40 mg/L、50 mg/L 時，脫色率較高，作用210 min 后脫色率分別達到60.69%、78.59%。

2.4.3 溫度對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響 溫度對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響結果見圖5。發現反應溫度在30 ℃～60 ℃條件下，隨著溫度升高，溴酚藍和孔雀石綠的脫色反應速度加快，脫色率升高，但是當溫度升高到70 ℃～80 ℃時漆酶對兩中染料的脫色率均降低，這是因為溫度越高漆酶酶活越高，但過高的溫度會導致漆酶變性失活。作用210min 后，50 ℃條件下溴酚藍脫色率最高為68.51%，孔雀石綠的脫色率最高為83.06%。

2.4.4 pH 對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響 pH對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響結果如圖6 所示。結果表明溴酚藍在pH值3.5～4.5 時脫色率較高，pH 值為3.5 時脫色率最高達到72.61%；孔雀石綠在pH 值4.5～6.0 時脫色率較高，pH 值為4.5 脫色率最高達到83.49%。Trametes hirsuta漆酶對溴酚藍和孔雀石綠脫色的最適pH 值不同，可能是因為這兩種染料在不同的pH 值下具有不同的穩定性。

2.4.5 NaCl 對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的影響 如圖7 所示，NaCl對溴酚藍和孔雀石綠的脫色率具有顯著影響，兩種染料脫色率隨NaCl 濃度的增高而降低，表明NaCl 對Trametes hirsuta漆酶催化染料脫色反應具有抑制作用，對溴酚藍脫色率的影響尤為顯著，這種抑制作用可能源于Cl-對漆酶活性具有抑制作用導致的。

3 討論

本研究采用兩步純化法，通過硫酸銨分級鹽析沉淀和 DEAE-Sepharose FF 層析純化，成功獲得了高純度的漆酶樣品，漆酶活性回收率高達57.2％，純化倍數達到6.0倍，比活力為758.5 U/mg。相比之下，劉芹等[20]通過硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析從白靈側耳菌渣中分離純化漆酶，經過各步純化后最終漆酶活力總回收率為18.8%，比活力為176.1 U/mg；Si 等[21]經過鹽沉淀、離子交換層析和分子篩層析三步操作對南方靈芝Dai 11646漆酶進行純化，最終漆酶回收率為38.44%，比活力為22.214 U/mg；Manavalan等[22]通過硫酸銨沉淀、Sephadex G-100 層析和DEAE-cellulose 層析對靈芝Ganoderma lucidum 分泌的漆酶進行了純化，漆酶活性回收率為32%，純化倍數為5.57 倍，比活力為145 U/mg。由此可見本研究的兩步純化Trametes hirsuta 漆酶法具有可行性強、操作簡單、方便、酶活回收率高等特點。這對于Trametes hirsuta 漆酶的應用和開發具有重要的意義，同時也為其他酶類的提取和純化提供了參考和借鑒。

本研究使用漆酶粗酶液脫色法，在實用性及經濟性方面更具優勢，能夠更好地滿足實際應用需求。Trametes hirsuta 所產漆酶粗酶液對不同染料有不同脫色能力，其對溴酚藍和孔雀石綠這兩種染料的脫色效果較為顯著（圖3）。Trameteshirsuta 漆酶在無介體存在時，1 h 對孔雀石綠的脫色率在17%以上，6 h脫色率在60%以上（圖3）。郭艷華等利用竹黃菌S8漆酶降解孔雀石綠，在無介體存在時，1 h 對孔雀石綠的脫色率6.45%[23]。劉友勛利用雜色云芝Coriolus versicolor 漆酶在添加介體ABTS 條件下10 h 對孔雀綠的脫色效率為60%左右[17]。可見Trametes hirsuta 漆酶在工業染料廢水的處理上效率較高。溫度是影響漆酶對溴酚藍和孔雀石綠脫色率的重要因素，過高或過低的溫度都會影響酶的穩定性和活性，從而降低脫色率，選擇適當的脫色溫度可以提高漆酶對染料的脫色率。此外，脫色體系的pH 值也對酶的活性產生顯著影響，不同染料的最適pH值也不同，因此應根據染料的特性選擇適合的pH 值。在染料脫色過程中，添加NaCl 會對Trametes hirsuta 漆酶的活性產生抑制作用，NaCl濃度越高，抑制作用越強，從而降低其對染料的脫色率，這種抑制作用可能源于Cl- 對該Trametes hirsuta 漆酶活性具有抑制作用導致的。這與郝龍云等人研究結果相符，郝龍云等研究表明漆酶的脫色性能隨所添加的鹽類不同而有顯著差異，Na2SO4對漆酶活性影響較小，而NaCl、KCl 對漆酶活性有抑制，隨著NaCl、KCl 質量濃度的增大，漆酶對活性艷藍K-3R脫色率逐漸下降，這種差異可能是由于酸根離子的不同而造成[24]。在實際應用中，需要消除抑制因素，增加促進因素，以提高漆酶的脫色效率。

大多數真菌漆酶需要在添加某種介體的情況下，才能對孔雀石綠等三苯甲烷類染料達到不錯的脫色效果[17，23，25]。但是介體價格往往比較昂貴，大大制約了真菌漆酶的工業化脫色應用。但Trametes hirsuta 漆酶對孔雀石綠和溴酚藍進行脫色時無需介體，在相對較短的時間內就達到了較好的脫色效果（圖3）。因此利用Trameteshirsuta 漆酶可降低脫色成本，使其更具有工業化應用價值和潛力。

4結論

漆酶作為一種具有廣泛應用前景的生物催化劑，在多個領域中都具有重要的應用價值。本研究高效的分離純化了Trametes hirsuta 漆酶，并對其染料脫色能力進行了深入的探究，研究發現該漆酶在不添加介體情況下對溴酚藍和孔雀石綠等染料具有顯著的脫色能力，為實現漆酶的染料脫色實際應用提供了理論數據支持。研究結果對于開發Trametes hirsuta 漆酶在染料廢水處理和其他生物技術領域的應用具有重要的意義，進一步的研究可以探索該漆酶的催化機制以及其在環境保護和工業生產中的潛在應用。