甘薯脫毒及種薯（苗）繁育技術研究

摘要 中國是世界上最大的甘薯生產國，然而由于病毒病的存在，嚴重制約了甘薯產業的發展，建立通用的脫毒組培體系、高靈敏度的檢測體系及高效的種薯（苗）繁育體系對甘薯產業發展具有重要意義。對12個主栽品種進行莖尖脫毒處理，建立了通用的脫毒組培體系MS+2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，大多數品種的再生率在58%以上；獲得SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的特異性引物，該引物對病毒檢測極限依次為10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3，具有較高的靈敏性；對脫毒品系進行篩選，獲得優良脫毒株系甘12和粉薯2-2；建立脫毒種薯（苗）的三級繁育體系，即組培苗（一級）擴繁，溫網室基質苗（二級）扦插擴繁和網棚大田苗（三級）繁育生產用種；進行洗苗速率（帶根和不帶根）對比試驗，移栽方式（帶根和不帶根）與每孔移栽棵數（1～3棵）的雙因素試驗，結果表明不帶根處理可顯著提升洗苗速率，育苗前期每孔移栽棵數（1～3棵）在株高、莖粗、節間數方面無顯著差異，帶根處理前期生長具有優勢，但二者成活率無顯著差異，并不影響育苗結果。因此，該研究有利于甘薯病毒病防治、脫毒種薯（苗）推廣和育苗成本的降低。

關鍵詞 甘薯；莖尖脫毒；病毒檢測；脫毒繁育體系；組培苗移栽方式

中圖分類號 S 531 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）16-0033-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.007

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Virus-free and Seedling Propagation Techniques of Sweet Potato

QU Yu-yang¹，LIU Xun-long¹，YAO Feng² et al

（1. College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University Key Laboratory of Potato Biology and Biotechnology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wuhan， Hubei 430000;2. Hongan County Ruifeng Breeding Specialized Cooperative， Huanggang， Hubei 438000）

Abstract China is the largest sweet potato producer in the world. However， the development of the sweet potato industry is severely constrained by viral diseases. The establishment of a universal virus-free tissue culture system， a highly sensitive detection system， and an efficient seed potato （seedling） breeding system are of great significance for the development of the sweet potato industry. A total of 12 main cultivars were subjected to shoot-tip virus elimination treatment using a universal tissue culture system MS+2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA， with regeneration rates of over 58% for most cultivars. Specific primers for five viruses， namely SPFMV， SPCSV， SPLV， SPCFV and SPVG， were obtained. The detection limits of these primers for the viruses were 10^-6， 10^-1， 10^-4， 10^-3 and 10^-3， respectively， indicating high sensitivity. Virus-free lines were selected， and excellent virus-free strains Gan 12 and Fenshu 2-2 were obtained. A three-tier breeding system for virus-free seed potatoes was established， including tissue culture seedlings （first tier）， temperature-controlled greenhouse substrate seedlings （second tier） and field seedlings （third tier） for seed production. In addition， a comparison trial was conducted to evaluate the washing rate of seedlings （with roots and without roots）， as well as a dual-factor experiment to assess transplanting methods （with roots and without roots） and the number of transplanted seedlings per hole （1-3 plants）. Results showed that the treatment without roots significantly increased the washing rate of seedlings. There were no significant differences in plant height， stem thickness， and internode number among groups with different numbers of transplanted seedlings （1-3 plants） during the early stage of seedling growth. The treatment with roots had advantages in early growth， but did not significantly affect the survival rate or the final result of seedling growth. Therefore， this study was beneficial for the prevention and control of sweet potato viral diseases， the promotion of virus-free seed potatoes， and the reduction of seedling production costs.

Key words Sweet potatoes;Stem tip detoxification;Virus detection;Virus-free breeding system;Transplantation method of tissue culture seedlings

基金項目 華中農業大學橫向項目“紅安苕脫毒種苗生產、病毒檢測和繁育技術體系研究”。

作者簡介 曲玉陽（1997—），男，山東煙臺人，碩士研究生，研究方向：甘薯脫毒組培快繁及栽培模式。*通信作者，副教授，博士，從事馬鈴薯種薯繁育與農機農藝融合研究。

收稿日期 2023-09-01

甘薯（Ipomoea batatas L.）是世界范圍內一種重要的糧食作物，在全球糧食作物生產中，總產量排名第7位^［1］，其中中國是世界上最大的甘薯生產國^［2］。因甘薯具有高產穩產、耐熱抗旱、適應性強及營養豐富等特點^［3］，在保障我國糧食安全方面發揮了重要的作用^［4］。紅安苕是全國第一個授權的地理標志保護產品，因適宜紅安縣獨特的環境和氣候條件，已成為革命老區紅安“1+X”的農業支柱產業。紅安縣甘薯種植面積有1萬hm²，年產量達37萬t^［5］。由于長期無性繁殖，導致品質退化、產量降低^［6］，嚴重制約了紅安苕產業的高質量發展。

據報道，在全世界有30多種病毒侵染甘薯^［7］，我國報告了20種甘薯病毒^［8］，主要有甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯褪綠矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯潛隱病毒（sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯褪綠斑病毒（sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）和甘薯G病毒（sweet potato virus G，SPVG）等^［9］。盡早發現這些病毒并采取積極有效的防治措施是非常必要的，目前甘薯莖尖脫毒是防治病毒病最有效的方法^［10-11］。其原理是利用植物莖尖頂端分生組織中不含有病毒的特性，剝離莖尖，離體培養，再生出無病毒侵染的健康植株^［12］。

許多學者對甘薯脫毒進行了深入的研究，發現甘薯莖尖分生組織的再生效果受萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid，NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）等激素的影響較大^［13］，適合的激素濃度配比才能獲得最佳效果^［14］；脫毒后的再生苗需要檢測，PCR技術可以檢測到微量的病毒樣本，其靈敏性是傳統ELISA方法的1 000倍以上，具有簡單、穩定，不受環境影響的優勢^［15］；傳統的甘薯組培苗移栽采用的是帶根移栽的方式，需要進行洗根等處理，費時費工，而不帶根移栽可以有效規避上述問題，并且該方法已經在馬鈴薯上有成熟的應用^［16］。鑒于此，筆者以紅安主栽品種為試驗材料，研究適合的甘薯組培脫毒及病毒檢測體系，篩選優良株系和改進組培苗移栽方式，以期在源頭上為紅安縣的甘薯優質種苗生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

該研究用于莖尖脫毒的材料由湖北黃安苕生物科技有限公司和紅安縣瑞灃種植養殖專業合作社提供，分別為紫檀紅、姜牌紅、騎龍紅、西瓜紅、龍薯9號、商薯19號、煙薯25號、鄂薯6號、瑞薯4號、粉薯、紫薯1和紫薯2。

SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV、SPVG 5種病毒的甘薯陽性對照毒源植株，由河南省農業科學院張振臣研究員惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 莖尖脫毒及培養。

選取擬脫毒主栽品種具有典型性狀、完好、無病蟲害的薯塊，催芽后取莖尖部，在40倍解剖顯微鏡下剝取0.2～0.4 mm的莖尖分生組織，放在含有0.2 mg/L NAA（萘乙酸）和1.0 mg/L 6-BA（6-芐氨基嘌呤）的MS培養基上培養，置于20 ℃，相對濕度70%，光照時間16 h/d，光照強度2 000 lx條件下，誘導芽的分化。觀察莖尖膨大和再生出芽情況，從而對比不同品種在分化培養基上的再生效果。

1.2.2 病毒檢測。

采用RT-PCR技術進行病毒檢測，具體方法參照劉訓龍^［17］報道的方法進行。引物序列如表1所示。

PCR具體的反應體系為：樣本cDNA 1 μL，病毒的上、下游引物各0.5 μL，Mix 5 μL，用ddHO補足至總體積10 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后，取8 μL的PCR擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓150 V，電泳后將膠塊放置在凝膠成像儀上觀察拍照，將呈陽性的樣品測序，測序結果在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網站上進行BLAST序列比對，判斷引物特異性擴增出的產物是否為目標片段。

為了進一步檢測引物對SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的靈敏性，尋找病毒檢測的極限，對cDNA模板原液進行10倍濃度梯度稀釋，稀釋后分別為原液濃度的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍，將稀釋液作為擴增模板，在相同反應體系及反應條件下再進行PCR擴增。

1.2.3 脫毒品系田間比較試驗。

將獲得的檢測無病毒株系移栽到大田，栽培地點在湖北紅安縣龍潭寺村，種植方式如下：100 cm壟距、埋5節、6萬棵/hm²的密度、33.35 cm株距，每壟雙行種植，每小區重復4次，田間種植120 d后進行測產。甘薯根據不同用途，對商品薯大小的分級標準也不同，鮮食蒸煮精品薯質量需控制在100～250 g、烘烤精品薯質量需控制在250～500 g，淀粉加工精品薯質量需控制在500 g以上。收獲時測量各分級標準下的產量，分級標準為<100 g、>100～250 g、>250～500 g、>500 g，最終保留符合原品種的典型性狀且商品率高的株系。

1.2.4 脫毒種薯（苗）的繁育。

將篩選出的優良株系對應的組培苗進行組培擴繁，于3月上旬，在大棚基質槽中按12 cm×12 cm的株行距移栽，待苗長至45 cm以上時剪取4～5節莖段再擴繁，按15 cm×15 cm的株行距在基質大棚內扦插擴繁，擴繁的苗于6月中旬后剪取節段用于田間生產。9月中下旬，剪取棚苗4～5節莖段生產微型薯，11月下旬可采收薯塊。

1.2.5 組培苗不同洗苗和移栽方式對比試驗。

組培苗的移栽設置了帶根移栽和不帶根移栽2種方式。帶根處理，進行洗根和修根（留1 cm根）操作；不帶根處理，直接從培養基上部約0.5 cm處剪斷植株，并將苗子簡單沖洗一下。試驗設置5次重復，每重復100瓶，每瓶2棵苗子，記錄用時。

采用穴盤移栽，穴盤規格為27.5 cm × 35.00 cm。帶根移栽處理A1，不帶根移栽處理A2；每孔移栽棵數包括B1處理（1棵）、B2處理（2棵）、B3處理（3棵）。采用完全隨機設計，試驗設置3次重復，每重復3盤，每盤30棵苗子。B1處理株行距為4.58 cm × 5.00 cm，B2處理株行距為5.83 cm × 6.88 cm，B3處理株行距為13.75 cm × 6.88 cm。28 d后統計成活率、株高、莖粗和節間數。

1.2.6 數據分析方法。

試驗數據先采用Excel 2021軟件初步統計分析；百分數采用“百分數反正弦（sin^-1y）轉換表”轉換后再分析；采用DPS 5.0軟件進行Duncan’s新復極差法顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種甘薯莖尖分化效果

將剝離的甘薯莖尖放置在上述莖尖培養基中培養，7 d左右的時間，莖尖有明顯變化，開始膨大、變綠，30 d左右誘導出大量愈傷組織，2～3個月開始由愈傷組織分化成植株。

由表2可知，在莖尖培養基下，愈傷率較高的是紫檀紅、紫薯2、西瓜紅、龍薯9號、煙薯25號、濟薯25號、商薯19號，為100%，最低的是粉薯，為40.00%；植株率最高的是煙薯25號，為100%，最低的是紫薯1，為5.26%。從愈傷率和植株率來看，該莖尖培養基利于大部分品種成愈傷和成植株。

2.2 脫毒甘薯主要病毒檢測

以張振臣教授惠贈的甘薯陽性毒源植株為模板，利用設計好的特異性引物（表1）進行RT-PCR擴增，結果顯示PCR擴增后出現了預期特異目標帶，然后將擴增產物測序，產物序列在NCBI網站上進行BLAST序列比對，結果見圖1～5。同源性結果顯示，SPFMV為98.72%，SPCSV為99.37%，SPLV為98.19%，SPCFV為93.78%，SPGV為94.82%。

在相同反應體系及反應條件下再進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的檢測極限依次為10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3（圖6）。

2.3 脫毒品系比較試驗

紫檀紅屬于鮮食蒸煮型品種，100～250 g為其商品薯重范圍。120 d后收獲“紫檀紅”薯塊，分級結果見表3。由表3可知，甘12品系在該范圍內優于其他品系，且在其他分級范圍內也是最優品系。

粉薯為淀粉加工型品種，>500 g為其商品薯重范圍，120 d后收獲粉薯薯塊，分級結果見表4。由表4可知，粉薯2-2品系在該范圍內明顯優于其他品系，且在其他分級范圍內也是較優品系。

2.4 紅安主栽甘薯品種三級苗繁育體系的建立

將組培苗與扦插擴繁苗的結薯情況對比發現，由組培苗發育長成的薯塊小而癟，有的甚至沒有發育出薯塊（圖7）。

結合上述特征進行甘薯脫毒種薯繁育體系的探究，建立紅安主栽甘薯品種三級苗繁育體系（圖8）：一級苗為脫毒組培苗，是脫毒甘薯繁育體系的源頭，直接影響種薯增產提質的效果，關系到脫毒甘薯能否可持續健康發展下去；二級苗為溫網室基質苗，這一級苗主要是脫毒組培苗在基質苗床中進行大量擴繁，用作大田生產繁育種苗，其繁殖系數比組培條件下大大提高，二級苗可直接生產微型薯（原原種），從組培苗到生產用種可以在1年內完成；三級苗為網棚大田苗，微型薯（原原種）在溫室網棚中催芽，為三級苗，然后移栽在大田里繁育生產用種（原種和良種）。

2.5 組培苗不同洗苗和移栽方式對比試驗分析

由表5可知，組培苗不同洗苗方式在洗苗速率方面差異顯著，不帶根處理的速率要顯著快于帶根處理，采用不帶根處理可提升生產效率。

移栽28 d后測量各指標結果見表6。由表6可知，在成活率方面，各個處理間無顯著差異；在株高方面，A1B1、A1B2和A1B3處理顯著優于其他處理組合；在莖粗方面，A1B1、A1B2和A1B3處理間無顯著差異，且A1B1和A1B3處理顯著優于其他3個處理；在節間數方面，A1B1、A1B2和A1B3處理間無顯著差異，且A1B1處理顯著優于其他3個處理。

3 結論與討論

莖尖脫毒是目前防治甘薯病毒病最有效的措施^［18］，而合適的激素配比是脫毒成功的重要因素之一。董芳等^［19］發現，將湘薯15號和湘薯19號的莖尖外植體培養在不同6-BA和NAA組合下，植株率最高的植物激素配比為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NNA和MS+2.0 mg/L 6-BA+0.67 mg/L NNA，分別為40.7%和57.8%。阮先樂等^［20］發現，豫薯12植株率最高的植物激素配比為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NNA，植株率為72.3%。該研究以紅安12個主栽品種為試驗材料，對比不同品種在分化培養基上的再生效果，從成愈傷率和成植株率的結果來看，不同的甘薯品之間存在差異，這與胡琳琳等^［9］的研究結果一致。除粉薯愈傷率較低，僅40%外，其他品種的愈傷率均在70%以上，紫檀紅、粉薯、紫薯2、西瓜紅、龍薯9號、煙薯25號和騎龍紅的植株率均在58%以上，說明該莖尖培養基利于大部分品種成愈傷和成植株。

采用RT-PCR技術進行病毒檢測，關鍵是獲得特異性引物。趙冬蘭等^［21］設計了SPFMV特異性引物，進行RT-PCR檢測，擴增產物測序結果與報道序列同源性達98.6%，可以確定擴增產物為SPFMV病毒基因片段；該試驗針對5種主要病毒設計的引物，擴增條帶符合預期，擴增產物測序結果與報道序列同源性均在93%以上，表明所得引物可靠。

該試驗將SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG這5種病毒的cDNA模板進行10倍梯度濃度稀釋，最終結果顯示5種病毒的檢測極限依次為10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3。說明在病毒濃度較低時，該方法也可以檢測出病毒，這與薛超^［22］的研究結果一致，但是對于SPCSV的引物設計可做進一步優化。

在優良株系篩選方面，主要目的是淘汰地上部生長異樣、產量低及結薯性狀不佳的株系^［23］，保留符合原品種的典型性狀且商品率高的株系，但是由于各品種的脫毒時間和脫毒后的成苗時間不同，該試驗目前只完成了紫檀紅“紫檀紅”和“粉薯”的篩選，后續將完成剩下幾個品種的評比篩選試驗。

在繁育體系方面，組培苗的薯塊小而癟，有的甚至沒有發育成薯塊，可能是由于前期組培苗不適應由組培環境換至大田環境，主要進行營養生長，根系深扎，汲取營養，所以不宜用組培苗直接生產種薯。甘薯是通過塊根催芽和藤蔓扦插進行繁殖的，但整個繁殖期間容易遭受病毒侵染。該研究的三級繁育體系可在1年內獲得微型薯（原原種），省去了微型薯繁育原種的中間環節，節省了成本，減少了病毒侵染的機會。

在組培苗移栽方式方面，主要目的是提升移栽效率，優化繁育體系。試驗結果顯示，不帶根處理的洗苗速率是帶根處理的近3倍；每孔移栽棵并不影響苗子生長；帶根移栽處理雖在前期生長具有優勢，但是二者在成活率方面無顯著差異，因育苗階段只要苗子健壯就可移栽。因此，可采用不帶根、每孔種2顆或者3棵的方式育苗，降本增效。

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