Calhex231通過細胞焦亡改善大鼠心肌梗死面積及心肌纖維化

【摘要】目的 研究鈣敏感受體（CaSR）負性變構調節劑Calhex231是否能改善大鼠的心肌梗死（MI）面積和心肌纖維化。方法 健康Wistar大鼠隨機分為3組：sham組、MI組和MI+Calhex231組。TTC染色評估MI面積和壞死情況。Masson染色、免疫組織化學及電鏡檢查心肌纖維化、Ⅲ型膠原蛋白及成纖維細胞膠原合成情況。免疫熒光和Western blot檢測CaSR表達變化。Western blot檢測含 NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶-1（Casp-1）、gasdermin D（GSDMD）、GSDMD N-末端結構域（NT-GSDMD）和白細胞介素-1β（IL-1β）的蛋白表達變化。并采用免疫組織化學法評估NT-GSDMD和IL-1β的表達情況。結果 與sham組相比，MI組大鼠MI面積和纖維化明顯增加，心肌組織Ⅲ型膠原蛋白沉積和成纖維細胞膠原合成明顯增加，而且CaSR、NLRP3、Casp-1、GSDMD、NT-GSDMD和IL-1β表達水平也明顯升高。進一步免疫組織化學染色確認了NT-GSDMD和IL-1β表達增加。MI+Calhex231組與MI組相比較，Calhex231可抑制上述改變。結論 Calhex231可通過CaSR抑制細胞焦亡和Ⅲ型膠原蛋白沉積，改善大鼠MI面積和心肌纖維化，有助于Calhex231在心肌纖維化疾病中臨床轉化。

【關鍵詞】鈣敏感受體；細胞焦亡；心肌梗死；纖維化

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.04.020

Calhex231 Attenuates Rat Myocardial Infarction Size and

Fibrosis by Suppressing Pyroptosis

LIU Wenxiu，GUO Yutong，SUN Xue，SONG Linlin，LIU Yue，DING Xue

（Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，Heilongjiang，China）【Abstract】Objective Calcium-sensing receptor （CaSR） plays an important role in the development of myocardial infarction （MI）.Thus，we investigated whether Calhex231，a negative allosteric modulator of CaSR，could protect the myocardium in a rat MI model.Methods Wistar rats were randomly divided into three groups： sham，MI and MI+Calhex231.Myocardial infarct size and necrosis were assessed by TTC staining.Myocardial fibrosis，collagen Ⅲ and collagen synthesis of fibroblasts were examined by Masson staining，immunohistochemistry and electron microscopy.CaSR expression was detected by both immunofluorescence and Western blot analysis.Protein expression levels of the NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3），caspase-1 （Casp-1），gasdermin D （GSDMD），N-terminal domain of GSDMD （NT-GSDMD） and interleukin-1β （IL-1β） were detected by Western blot analysis.NT-GSDMD and IL-1β were also assessed by immunohistochemistry.Results Compared with those of the sham group，myocardial infarct size and fibrosis were obviously increased in the rats of the MI group.Collagen Ⅲ deposition and collagen synthesis of fibroblasts were evidently increased in myocardial tissues of the MI group compared with the sham group.The expression levels of CaSR，NLRP3，Casp-1，GSDMD，NT-GSDMD and IL-1β were significantly increased in the MI group compared with the sham group.The increased expression of NT-GSDMD and IL-1β was further confirmed by immunohistochemical staining.Moreover，Calhex231 administration inhibited all these alterations in the MI+Calhex231 group compared to the MI group.Conclusion Calhex231 reduced myocardial infarct size and fibrosis in rats，probably by inhibiting pyroptosis and collagen Ⅲ deposition via CaSR，which contributes to the potential clinical application of Calhex231 in myocardial fibrotic disease.

【Keywords】Calcium-sensing receptor；Pyroptosis；Myocardial infarction；Fibrosis

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是嚴重威脅人類健康的心血管疾病^[1]，是導致心力衰竭的主要原因。MI心肌細胞可促發心肌炎癥反應，含NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體形成，分泌細胞因子，如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α，進一步惡化MI和引發心臟纖維化。MI和MI后心肌纖維化是慢性心力衰竭病理生理基礎，危害患者預后^[2]。因此，改善MI面積和心肌纖維化是防治MI的重要研究方向和亟待解決的課題。

鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）是一種G蛋白耦聯受體，參與多種生理和病理過程，如細胞增殖、分化、凋亡和壞死等。CaSR還參與多種心血管疾病發病過程，例如：高血壓^[3]和心肌病^[4]等。近年來有研究表明，CaSR在急性MI^[5]和高糖誘導的心肌纖維化^[6]中發揮保護作用。Calhex231是CaSR的負性變構調節劑，可結合CaSR七次跨膜結構域的胞外部分E837殘基，此結合位點是遠離Ca²⁺的正構結合位點，從而阻止肌醇磷酸鹽活化和降低Ca²⁺濃度，發揮抑制CaSR活化作用^[7]。Calhex231可顯著改善高糖誘導的心肌纖維化^[4]和高血壓誘導的自發性高血壓大鼠主動脈纖維化過程^[3]。以往的研究^[8]表明，巨噬細胞中CaSR激活可促進MI心肌纖維化，應用Calhex231可通過巨噬細胞中自噬-NLRP3炎癥小體途徑改善MI后大鼠心肌纖維化。細胞焦亡是一種胱天蛋白酶-1（caspase-1，Casp-1）介導的炎癥所致的細胞死亡形式，典型特征是NLRP3炎癥小體和gasdermin D（GSDMD）蛋白激活^[9]。研究表明，細胞焦亡參與肝硬化^[10]、心肌炎癥^[11]和心肌纖維化^[12]的發病過程。研究顯示，大黃素^[11]、miR-135b^[13]、GDF11^[14]、二甲雙胍^[15]、CXADR樣膜蛋白^[16]可通過HOXA3/NLRP3或AMPK/NLRP3通路激活，減少MI后心肌細胞或心肌成纖維細胞焦亡，緩解MI引起的心肌損傷、纖維化和心功能障礙。大黃素可通過TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3炎癥小體途徑抑制細胞焦亡，減輕缺血再灌注性心肌損傷^[17]。但Calhex231在MI及其相關心肌纖維化中的保護作用及可能機制仍有待研究。

本研究旨在研究Calhex231是否對MI和MI誘導的心肌纖維化有保護作用，從而促進Calhex231在纖維化疾病中臨床轉化。

1 材料和方法

1.1 試劑和動物

Calhex231購于Sigma-Aldrich，NLRP3、Casp-1和IL-1β獲自Abcam，GSDMD和GSDMD N-末端結構域（N-terminal domain of GSDMD，NT-GSDMD）購于GeneTex，CaSR購于Alomone Labs，Ⅲ型膠原蛋白購于Proteintech，GADPH和其他二抗購于ZSGB-Bio。

Wistar大鼠[雄性，（200±20）g，無特定病原體級]購自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物中心。在動物中心室溫（22～25 ℃）、濕度（40%～50%）、12 h光照/黑暗交替環境下單籠飼養，自由飲水和進食。

1.2 動物模型和分組

通過結扎冠狀動脈左前降支誘導大鼠MI模型。Wistar大鼠隨機分為以下各組。（1）sham組（n=30）：除不結扎左前降支外，其余處理同MI大鼠；（2）MI組（n=50）：MI大鼠造模后注射與Calhex231同體積的溶劑（腹腔注射，每日1次，此溶劑不影響實驗結果^[3]）；（3）MI+Calhex231組（n= 40）：MI大鼠注射Calhex231（10 μmol/kg，腹腔注射，每日1次）。采用吸氧、保溫等措施降低術后死亡率。在3、7和14 d獲得心臟標本進行形態學、組織學和分子學實驗。

1.3 免疫熒光檢測CaSR表達

心肌組織在蔗糖梯度中脫水，切片進行抗原修復，與CaSR一抗（1：100）孵育過夜，洗滌后再與四甲基羅丹明異硫氰酸鹽標記的二抗孵育，細胞核和蓋玻片用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（1：20 000）染色，并使用免疫熒光顯微鏡拍照。采用Image-Pro Plus軟件進行綜合分析。

1.4 TTC檢測MI面積

處死大鼠后，立即取出心臟并用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈。將樣本切成2 mm切片，用1%TTC染色15 min，灰白色或白色心肌代表MI心肌，紅色心肌代表正常心肌。Image J 1.44p軟件分析大鼠心肌組織的MI面積，并使用MI面積百分比（%）表示。

1.5 蘇木精-伊紅染色法和Masson染色檢測MI和心肌纖維化

心肌標本固定、蠟化、切片后，采用蘇木精、伊紅、Masson三色試劑染色。纖維化表現為藍染膠原纖維。在光學顯微鏡下隨機選擇10個視野計算膠原面積，使用Image-Pro Plus軟件計算，纖維化面積/心肌面積表示纖維化程度。

1.6 免疫組織化學檢測Ⅲ型膠原蛋白、NT-GSDMD及IL-1β表達

免疫組織化學檢測Ⅲ型膠原蛋白、NT-GSDMD和IL-1β表達，心肌組織經固定、蠟化、切片，與抗Ⅲ型膠原蛋白一抗（1：100）、NT-GSDMD（1：100）、IL-1β（1：100）孵育后顯色。染成棕色顆粒者為陽性細胞。使用Image-Pro Plus軟件進行分析，并使用陽性靶面密度（positive target surface density，PTSD）進行統計作圖。

1.7 電子顯微鏡檢查心肌成纖維細胞活性和膠原沉積

心肌組織洗滌干凈后，2.5%戊二醛固定。然后，經Hank’s液洗滌、固定、脫水、包埋后，切成超薄切片，裝于銅網上，枸櫞酸鉛做對比處理。對實驗各組設盲的病理學家觀察并描述圖片。

1.8 免疫印跡檢測CaSR和細胞焦亡相關蛋白（NLRP3、Casp-1和IL-1β）表達

將心肌組織研磨成組織勻漿，裂解液裂解，收集上清液用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。采用10%～12%分離凝膠進行電泳后電轉移。聚偏二氟乙烯膜與抗CaSR（1：800）、NLRP3（1：1 000）、Casp-1（1：1 000）、GSDMD（1：1 000）、NT-GSDMD（1：1 000）、IL-1β（1：1 000）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1：1 000）的一抗孵育過夜，然后與堿性磷酸酶二抗（1：5 000）孵育1 h。采用Bio-Rad ChemiDoc^TM EQ密度計獲得條帶，并采用Image J進行分析。

1.9 統計學分析

所有數據使用±s表示。使用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據分析。對正態分布數據，采用單因素ANOVA和Bonferroni檢驗比較組間差異。對非正態分布數據，采用Mann-Whitney U檢驗評價兩組間差異，并使用Kruskal-Wallis檢驗比較多組間差異。Plt;0.05為差異有統計學顯著性。

2 結果

2.1 Calhex231降低MI大鼠心肌組織CaSR蛋白表達

如圖1 A、B所示，與sham組相比，MI組大鼠心肌組織CaSR陽性細胞百分比在3、7和14 d顯著增加。MI+Calhex231組CaSR陽性細胞百分比在相應時間點較MI組顯著下降（P均lt;0.001）。如圖1 C、D所示，CaSR蛋白表達在3、7和14 d時MI組大鼠心肌組織較sham組明顯上調；與相應時間點MI組相比，MI+Calhex23組CaSR蛋白表達顯著下調（P均lt;0.001）。

活2.2 Calhex231減少大鼠MI面積

MI組大鼠心肌組織TTC染色陽性面積（灰白色或白色）在3、7和14 d均較相應時間點sham組明顯增加（P均lt;0.001）。與3、7和14 d時MI組相比，Calhex231給藥顯著減少大鼠MI面積（Plt;0.05，圖2）。而且，大鼠心肌組織蘇木精-伊紅染色法染色結果提示MI后心肌組織炎癥明顯增加，Calhex231治療可明顯減輕心肌炎癥。

2.3 Calhex231抑制大鼠MI誘導心肌纖維化

Masson染色結果顯示，與sham組3、7和14 d相比，MI組相應時間點相對纖維化面積逐漸增大。與相應時間點MI組相比，MI+Calhex231組大鼠心肌纖維化沉積明顯減少（P均lt;0.001，圖3A、B）。

進一步Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學結果顯示，與sham組相比，MI組3、7和14 dⅢ型膠原蛋白沉積逐漸增多。與相應時間點MI組相比，MI+Calhex231組大鼠心肌Ⅲ型膠原蛋白沉積顯著減少（P均lt;0.001，圖3C、D）。

電鏡結果顯示，與sham組相比，MI組可見成纖維細胞粗面內質網和膠原沉積，而且成纖維細胞粗面內質網和膠原沉積從3 d開始增加，7 d達峰，14 d降低；Calhex231可明顯抑制成纖維細胞粗面內質網增加和膠原沉積（圖3E）。

2.4 Calhex231減少MI大鼠心肌組織焦亡

與sham組相比，MI后細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Casp-1、GSDMD、NT-GSDMD和IL-1β表達水平顯著升高。其中，NLRP3在MI 3 d時表達最強（Plt;0.001，圖4A、B），在7 d時表達最弱（Plt;0.01，圖4A、B）；Casp-1在7 d時表達最強（Plt;0.01，圖4A、B）和3 d時表達最弱（Plt;0.05，圖4A、B）；14 d時GSDMD和NT-GSDMD表達均最強（Plt;0.01，圖4A、C），在7 d時表達最弱（Plt;0.01，圖4A、C）；7 d時IL-1β表達最強（Plt;0.01，圖4A、C）和3 d時表達最弱（Plt;0.05，圖4A、C）。與相應時間點MI組相比，MI+Calhex231組大鼠心肌組織焦亡標志蛋白表達顯著下調（P均lt;0.05，圖4D～I）。

免疫組織化學染色也證實MI后心肌組織NT-GSDMD和IL-1β免疫陽性細胞數量顯著增加（Plt;0.01），給予Calhex231顯著降低相應時間點NT-GSDMD和IL-1β免疫陽性細胞數量（P均lt;0.05，圖5）。

3 討論

近年來，CaSR負變構調節劑Calhex231在心血管系統中的生物學效應越來越引起人們關注。本研究發現，Calhex231能改善MI大鼠MI面積和心肌纖維化，這可能與抑制細胞焦亡、Ⅲ型膠原蛋白沉積和成纖維細胞合成功能有關。

MI可引發炎癥反應和心肌纖維化，且持續過度炎癥和纖維化會導致心室重塑和功能障礙，表現為心力衰竭^[2]。本實驗^[8]表明，Calhex231治療可改善大鼠MI后過度的心肌纖維化，與筆者之前的報道相似。研究還發現，成纖維細胞粗面內質網從3 d開始增加，提示成纖維細胞合成功能增強，并可見少量膠原沉積；7 d時成纖維細胞合成功能達到高峰，有大量膠原沉積；14 d時成纖維細胞功能較7 d時下降，但已形成并存在大量膠原沉積。實驗進一步發現，MI后Ⅲ型膠原蛋白沉積增加，Calhex231可抑制成纖維細胞的合成功能和Ⅲ型膠原蛋白沉積。推測Calhex231可通過降低心肌成纖維細胞合成功能和膠原沉積，包括Ⅲ型膠原蛋白合成功能，降低MI誘導心肌纖維化程度。

以往有學者報道，Calhex231治療可以降低高血壓^[18]或糖尿病大鼠模型^[4]心肌組織中CaSR的表達。筆者前期研究^[19]發現，Calhex231處理可降低大鼠MI后不同時間點腹腔巨噬細胞CaSR表達。該實驗結果表明，Calhex231可降低MI大鼠心肌組織CaSR表達，然而，CaSR如何調節細胞焦亡仍不清楚。細胞焦亡可通過細胞破裂和炎性細胞因子釋放，引發炎癥級聯反應，促進MI和MI誘導心肌纖維化^[20]。MI時，氧化應激-NF-κB-GSDMD信號軸激活心肌細胞發生細胞焦亡，加重心肌損傷^[21]。該研究發現，在MI后不同時間點大鼠心肌組織焦亡相關蛋白（NLRP3、Casp-1、GSDMD、NT-GSDMD和IL-1β）的表達均明顯升高，而通過注射CaSR特異性抑制劑Calhex231可明顯抑制細胞焦亡相關蛋白的表達，這提示CaSR與細胞焦亡間有相關性。

本實驗在MI大鼠模型中觀察到，使用CaSR特異性抑制劑Calhex231可通過細胞焦亡改善大鼠MI面積及心肌纖維化，但具體的分子機制仍需進一步的動物或細胞實驗進行研究。

綜上所述，本研究表明，Calhex231可能通過CaSR抑制細胞焦亡和Ⅲ型膠原蛋白沉積，改善MI面積和MI導致的心肌纖維化，促進Calhex231在纖維化心臟病中臨床轉化。

參考文獻

[1]Reed GW，Rossi JE，Cannon CP.Acute myocardial infarction[J].Lancet，2017，389（10065）：197-210.

[2]Prabhu SD，Frangogiannis NG.The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction：from inflammation to fibrosis[J].Circ Res，2016，119（1）：91-112.

[3]Zhang X，Hong S，Qi S，et al.NLRP3 inflammasome is involved in calcium-sensing receptor-induced aortic remodeling in SHRs[J].Mediators Inflamm，2019，2019：6847087.

[4]Yuan H，Xu J，Xu X，et al.Calhex231 alleviates high glucose-induced myocardial fibrosis via inhibiting itch-ubiquitin proteasome pathway in vitro[J].Biol Pharm Bull，2019，42（8）：1337-1344.

[5]Ren Z，Yang K，Zhao M，et al.Calcium-sensing receptor on neutrophil promotes myocardial apoptosis and fibrosis after acute myocardial infarction via NLRP3 inflammasome activation[J].Can J Cardiol，2020，36（6）：893-905.

[6]Yuan H，Fan Y，Wang Y，et al.Calcium-sensing receptor promotes high glucose-induced myocardial fibrosis via upregulation of the TGF-β1/Smads pathway in cardiac fibroblasts[J].Mol Med Rep，2019，20（2）：1093-1102.

[7]Petrel C，Kessler A，Maslah F，et al.Modeling and mutagenesis of the binding site of Calhex 231，a novel negative allosteric modulator of the extracellular Ca²⁺-sensing receptor[J].J Biol Chem，2003，278（49）：49487-49494.

[8]Liu W，Sun J，Guo Y，et al.Calhex231 ameliorates myocardial fibrosis post myocardial infarction in rats through the autophagy-NLRP3 inflammasome pathway in macrophages[J].J Cell Mol Med，2020，24（22）：13440-13453.

[9]Jia C，Chen H，Zhang J，et al.Role of pyroptosis in cardiovascular diseases[J].Int Immunopharmacol，2019，67：311-318.

[10]Gaul S，Leszczynska A，Alegre F，et al.Hepatocyte pyroptosis and release of inflammasome particles induce stellate cell activation and liver fibrosis[J].J Hepatol，2021，74（1）：156-167.

[11]Bian Y，Li X，Pang P，et al.Kanglexin，a novel anthraquinone compound，protects against myocardial ischemic injury in mice by suppressing NLRP3 and pyroptosis[J].Acta Pharmacol Sin，2020，41（3）：319-326.

[12]Yue R，Zheng Z，Luo Y，et al.NLRP3-mediated pyroptosis aggravates pressure overload-induced cardiac hypertrophy，fibrosis，and dysfunction in mice：cardioprotective role of irisin[J].Cell Death Discov，2021，7（1）：50.

[13]Li A，Yu Y，Ding X，et al.MiR-135b protects cardiomyocytes from infarction through restraining the NLRP3/caspase-1/IL-1β pathway[J].Int J Cardiol，2020，307：137-145.

[14]Li Z，Xu H，Liu X，et al.GDF11 inhibits cardiomyocyte pyroptosis and exerts cardioprotection in acute myocardial infarction mice by upregulation of transcription factor HOXA3[J].Cell Death Dis，2020，11（10）：917.

[15]Zhang J，Huang L，Shi X，et al.Metformin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury and cell pyroptosis via AMPK/NLRP3 inflammasome pathway[J].Aging （Albany NY），2020，12（23）：24270-24287.

[16]Han X，Zhao ZA，Yan S，et al.CXADR-like membrane protein protects against heart injury by preventing excessive pyroptosis after myocardial infarction[J].J Cell Mol Med，2020，24（23）：13775-13788.

[17]Ye B，Chen XD，Dai SD，et al.Emodin alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting gasdermin D-mediated pyroptosis in cardiomyocytes[J].Drug Des Devel Ther，2019，13：975-990.

[18]Hong ST，Zhang X，Zhang XH，et al.Role of the calcium sensing receptor in cardiomyocyte apoptosis via mitochondrial dynamics in compensatory hypertrophied myocardium of spontaneously hypertensive rat[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，487（3）：728-733.

[19]Liu W，Zhang X，Zhao M，et al.Activation in M1 but not M2 macrophages contributes to cardiac remodeling after myocardial infarction in rats：a critical role of the calcium sensing receptor/NRLP3 inflammasome[J].Cell Physiol Biochem，2015，35（6）：2483-2500.

[20]Wang Q，Wu J，Zeng Y，et al.Pyroptosis：a pro-inflammatory type of cell death in cardiovascular disease[J].Clin Chim Acta，2020，510：62-72.

[21]Lei Q，Yi T，Chen C.NF-κB-Gasdermin D（GSDMD） axis couples oxidative stress and NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3 （NLRP3） inflammasome-mediated cardiomyocyte pyroptosis following myocardial infarction[J].Med Sci Monit，2018，24：6044-6052.

收稿日期：2023-08-29