骨通貼膏（熱壓法）毒理學實驗研究

【摘要】

目的：探討系統評價骨通貼膏（熱壓法）的用藥安全性。方法：通過急性毒性試驗、皮膚刺激和過敏試驗、小鼠嗜多染紅細胞微核試驗進行骨通貼膏安全性評價。結果：以骨通貼膏（熱壓法）樣品分別給大鼠完整及破損皮膚局部外貼，含膏漿2000 mg/kgBW的一次性限量急性皮膚毒性試驗，未見出現明顯急性皮膚毒性反應。樣品對家兔完整及破損皮膚均無刺激性；樣品對豚鼠皮膚為無致敏性；微核試驗用藥組與陰性對照組比較，微核發生率無顯著差異（P＞0.05）。結論：骨通貼膏（熱壓法）對試驗動物皮膚無刺激，不致敏，無吸收中毒，亦無潛在的致突變作用。

【關鍵詞】

熱塑性橡膠；骨通貼膏；急毒；過敏；致突變

【中圖分類號】R285

【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）16-0016-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.16.zgmzmjyyzz202416005

Experimental Study on Toxicology of Gutong Plaster （Hot Pressing Method）

CHEN Yufeng1WU Chaoquan2MO Yuhuan2NONG Xueduo2ZENG Sen3

1.Guilin Huarun Tianhe Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guilin 541000，China;

2.Guangxi Institute for Food and Drug Control，Nanning 530000，China;

3.Guilin Tianhe Pharmaceutical Yiwei Co. ， Ltd.， Guilin 541000，China

Abstract：

Objective To systematically evaluate the safety of Gutong Plaster （ hot pressing method ）. Methods The safety of Gutong Plaster was evaluated by acute toxicity test， skin irritation and allergy test， mouse polychromatic erythrocyte micronucleus test. Results The samples of Gutong Plaster （ hot pressing method ） were applied to the intact and damaged skin of rats， and no obvious acute skin toxicity was observed in the one-time limited acute skin toxicity test containing 2000 mg/kg BW paste. The sample had no irritation to the intact and damaged skin of rabbits.The sample was non-allergic to guinea pig skin; there was no significant difference in the incidence of micronucleus between the micronucleus test group and the negative control group （ P>0.05 ）. Conclusion Gutong Plaster （ hot pressing method ） has no irritation， no sensitization， no absorption poisoning， and no potential mutagenic effect on the skin of experimental animals.

Keywords：

Thermoplastic Rubber; Gutong Plaster; Acute Toxicity; Allergy; Mutagenesis

骨通貼膏是采用消炎、擴張毛細血管、滲透功能強的天然藥物，同時輔助透皮吸收促進劑，運用現代技術加工制成的外用貼劑。主要成分有丁公藤、麻黃、當歸、干姜、白芷、海風藤、乳香、三七、姜黃、辣椒、樟腦、肉桂油、金不換、薄荷腦。輔料為橡膠、氧化鋅、松香、羊毛脂、黃凡士林、月桂氮卓酮等［1］。用于治療骨質增生、肩周炎、頸（腰）椎病、風濕、關節炎、腰椎間盤突出等各種慢性骨病［2］。有祛風散寒、活血通絡、消腫止痛的功效，對各種慢性骨病引起的局部疼痛、腫脹、麻木重著，或屈伸不利，或活動受限有較好的療效［3-5］。

骨通貼膏等中藥貼膏作為藥物透皮制劑，與散劑等傳統內服劑型相比，有使用方便、可以避免首過效應、提高患者順應性等優點［6］。以往骨通貼膏使用的輔料為煙片膠，是天然橡膠，有異性蛋白，易導致過敏、皮膚刺激。近年來，企業對產品進行創新升級，采用熱塑性橡膠作為骨通貼膏的基質材料，經過物理加熱捏合而制成新型的骨通貼膏，其具有黏性適中、對皮膚的牽拉刺激作用小、過敏率低等特點，且熱塑性橡膠性質穩定，不與主藥起反應。為確保臨床用藥安全，課題組對其進行了多項毒理實驗，現將實驗結果報道如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1檢測樣品骨通貼膏（熱壓法，批號：221103，桂林華潤天和藥業有限公司，制劑每貼面積為7 cm×10 cm，含膏漿1.7～1.8 g/100 cm2），外用，貼于患處，每日1次。臨床按成人每日用2貼計。人推薦日劑量為2.33 cm2/kg 體重（膏漿0.042 g/kg 體重）或體表面積88.0 cm2/m2體表面積（膏漿1.58 g/m2體表面積）。空白貼膏（熱塑性橡膠制成，不加藥物，批號：20211222，桂林華潤天和藥業有限公司）用于皮膚刺激性、過敏性實驗和小鼠嗜多染紅細胞微核試驗基質對照用。

1.1.2對照品2， 4-二硝基氯代苯（上海試劑一廠），用70%乙醇配成1%（致敏誘導用）及0.1%（激發反應用）兩種濃度供試，用于皮膚過敏性實驗致敏和激發用；環磷酰胺，購于上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3動物來源急性皮膚毒性試驗：SD大鼠，SPF級，♀♂各半，體重260～300 g，廣西壯族自治區食品藥品檢驗所提供，生產許可證號：SCXK桂2022-0001。多次皮膚刺激性試驗：新西蘭兔，普通級，♀♂各半，體重2.5～2.8 kg，廣西壯族自治區食品藥品檢驗所提供，生產許可證號：SCXK桂2022-0001。皮膚過敏性試驗：Hartley豚鼠，普通級，♀♂各半，體重252～290 g，廣西壯族自治區食品藥品檢驗所提供，生產許可證號：SCXK桂2022-0001。小鼠嗜多染紅細胞微核試驗：小鼠，SPF級，♀♂各半，體重30～35 g，廣西壯族自治區食品藥品檢驗所提供，生產許可證號：SCXK桂2022-0001。

1.1.4儀器及其他顯微鏡，JJ2000電子天平，PL3001-S電子天平，CP224S型電子天平，ACS-30電子計價秤等。

1.2方法

1.2.1急性皮膚毒性試驗方法取上述大鼠100只（♀♂各半），每鼠背部及兩側皮膚用電動毛剪去毛，范圍約10 cm×6 cm。24 h后按體重隨機均分為5組，每組20只（♀♂各半）：空白對照組、樣品完整皮膚組、樣品破損皮膚組、基質對照完整皮膚組、基質對照破損皮膚組。破損皮膚造型方法：以75%乙醇消毒去毛區皮膚，用消毒手術刀在去毛區表皮劃“井”形傷口，每刀口長約2 cm，以滲血為度。兩組動物均給予受試藥物：按動物體重給予貼膏，給藥劑量為2000 mg/kg，參照樣品含膏漿重量計算相對應貼膏面積并將貼膏敷貼于去毛區皮膚區域，覆蓋一層醫用膠布，并用膠帶包扎固定，持續24 h后除去包扎和膠布，用溫水洗去皮膚藥物。觀察給藥期間及至藥后14 d大鼠的局部及全身反應等情況。

1.2.2多次皮膚刺激性試驗方法取健康無皮疾的新西蘭家兔24只（♀♂各半），每只家兔背部脊柱左、右兩側各1個區域皮膚去毛，每側范圍約4 cm×4 cm。24 h后按體重隨機均分為4組（每組6只，♀♂各半）：樣品完整皮膚組、樣品破損皮膚組、基質對照完整皮膚組、基質對照破損皮膚組。破損皮膚造型方法：以75%乙醇消毒去毛區皮膚，用消毒手術刀在兩側去毛區表皮劃“井”形傷口，每刀口長約2 cm，以滲血為度。各組動物均給予相應受試藥物：將樣品貼膏及基質對照分別剪成3 cm×3 cm的試樣，敷貼于各兔左側去毛區皮膚（面積為4 cm×4 cm），用醫用膠布及膠帶包扎固定；右側去毛區皮膚不做處理作為空白對照，5 h后除去試樣，于除去試樣1 h后觀察敷貼部位的皮膚反應，評分；從第二天開始，每次敷貼前觀察皮膚評分后，用電動毛剪剪毛，敷貼5 h后除去試樣，于除去試樣1 h后觀察敷貼部位的皮膚反應，評分。連續敷貼14 d，每次除去藥物后1 h，每次給藥前及末次敷貼去除藥物1 h、24 h、48 h、72 h（共30個觀察點），觀察皮膚反應并評分，評分按參考文獻［7］中“皮膚刺激反應評分標準”評分記錄。首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內每天每只動物刺激積分均值，并按參考文獻［7］“皮膚刺激強度評價標準”判定皮膚刺激強度。

1.2.3皮膚過敏性試驗方法取豚鼠60只（♀♂各半），每鼠背部脊柱右側皮膚去毛，范圍約4 cm×4 cm。24 h后按體重隨機均分為受試藥物組（20只，♀♂各半）、基質對照組（20只，♀♂各半）、陰性對照組（10只，♀♂各半）、陽性對照組（10只，♀♂各半），分組后即致敏給藥：將試藥敷貼或涂敷于左側去毛區皮膚上；受試藥物組敷貼有藥膏藥（分別制成3 cm×3 cm試樣），陰性對照組不作處理，陽性對照組敷貼1% 2， 4-二硝基氯苯（用0.5 mL溶液浸濕3 cm×3 cm的滅菌紗布塊后貼敷），并用醫用膠布及膠帶包扎固定；6 h后除去包扎和試藥；第7天、第14天分別同法致敏給藥各1次。于首次致敏給藥第27天，每鼠背部脊柱左側皮膚去毛，范圍約4 cm×4 cm，并于第28天激發給藥：按前述方法將對應試藥（陽性組為0.1% 2， 4-二硝基氯苯）分別敷貼或涂敷于對應各組動物的左側去毛區皮膚，并用醫用膠布及膠帶包扎固定；6 h后除去包扎和試藥，觀察即時、24 h、48 h、72 h局部皮膚的紅斑、水腫等情況，按參考文獻［7］主動皮膚過敏試驗（ACA）試驗的“皮膚過敏反應程度的評分標準”進行評分，并綜合計算動物組“致敏率”，按參考文獻［7］主動皮膚過敏試驗（ACA）試驗的“皮膚致敏性評價標準”對“致敏強度”進行評價，見表1、表2。測定開始時和結束時的動物體重。當受試物組動物出現皮膚反應積分≥2，判定該動物出現過敏反應陽性。

1.2.4小鼠嗜多染紅細胞微核試驗方法選用小鼠60只，分為6組，每組10只，雌雄各半，每鼠背部脊柱左側皮膚去毛，范圍約4 cm×4 cm。設樣品三個劑量組，分別為高劑量組（4 cm×4 cm）、中劑量組（3 cm×3 cm）、低劑量組（2 cm×2 cm）；另設基質對照組（3 cm×3 cm）、陰性對照組和陽性對照組。給予受試物方式：將不同規格試藥敷貼于左側去毛區皮膚上，并用醫用膠帶包扎固定；6 h后除去包扎和試藥，每日1 次，連續7 d給予受試物，兩次給受試物的間隔時間為24 h。陰性對照組不作任何處理，為空白對照。陽性對照組通過灌胃方式給予環磷酰胺（1 mg/mL），給藥體積為為20 mL/kg，末次給予受試物后6 h，處死動物。取股骨骨髓涂片，在顯微鏡下觀察，每只動物計數2000個嗜多染紅細胞（PCE）中有微核的細胞數，計算微核率（‰）；計數200個紅細胞（RBC）數以及PCE數，計算PCE/RBC比值。

1.2.5統計學分析數據采用SPSS 16.0統計軟件進行處理，雌雄分別統計，以均數加減標準差表示。對符合正態分布且方差齊的數據，則進行單因素方差分析和多重比較（SNK-q檢驗）；對不符合正態分布或方差不齊的數據，則進行非參數檢驗（Kruskal-Wallis秩和檢驗）。其中， 遺傳毒性試驗結果中，微核率的比較使用泊松分布法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1急性皮膚毒性試驗以骨通貼膏（熱壓法）樣品分別給大鼠完整及破損皮膚局部外貼，含膏漿2000 mg/kg BW（按體重用藥劑量計，產品相當于日臨床用量的48倍；按單位體表面積用藥量計，此量為日臨床用量的4倍）的一次性限量急性皮膚毒性試驗，未見出現明顯急性皮膚毒性反應。各組大鼠去除貼劑后未見給藥區皮膚紅斑和水腫；給藥后14 d內各組大鼠的外觀、行為、眼和粘膜、四肢活動、進食、排泄及呼吸、循環、自主神經、中樞神經系統等均未見明顯異常；無死亡現象；未見對體重有明顯影響，體重增長正常；破損皮膚組動物于6 d后傷口愈合良好。

2.2多次皮膚刺激性試驗樣品對完整、破損皮膚組的試驗區刺激性反應平均分值均與對照區側相近，完整皮膚組試驗區、對照區每天每只動物平均總分值分別為0分、0分，破損皮膚組試驗區、對照區每天每只動物平均總分值分別為0分、0分；熱塑性橡膠基質對完整、破損皮膚組的試驗區刺激性反應平均分值均與對照區側相近，完整皮膚組試驗區、對照區每天每只動物平均總分值分別為0分、0分，破損皮膚組試驗區、對照區每天每只動物平均總分值分別為0分、0分。提示骨通貼膏及空白貼膏對家兔完整皮膚及破損皮膚均無刺激性，未見引起皮膚粗糙增厚或變薄，破損皮膚愈合良好，與對照區側比較無顯著差異。

2.3皮膚過敏性試驗對于骨通貼膏樣品，按標準評價，認為樣品對豚鼠皮膚具有無致敏性。其組內最高反應分值為0分，與空白對照組反應相同，故認為樣品所致豚鼠皮膚過敏反應程2.4小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗受試物各劑量組嗜多染紅細胞數在總紅細胞中比例與陰性對照組的差異均在20%以內，差異無統計學意義（P>0.05），表示骨通貼膏（熱壓法）對小鼠骨髓細胞增殖無不良影響。雌性小鼠陽性對照組微核發生率高于陰性對照組（P<0.05），雌性小鼠各劑量組與陰性對照組比較無顯著性差異（P>0.05）。雄性小鼠陽性對照組微核發生率高于陰性對照組（P<0.05），雄性小鼠各劑量組與陰性對照組比較無顯著性差異（P>0.05），表明骨通貼膏（熱壓法）在小鼠骨髓細胞微核試驗中為陰性結果。結果見表4。

3討論

熱塑性橡膠，簡稱TPE，又稱熱塑性彈性體，是一類在常溫下顯示橡膠彈性、受熱時呈可塑性的高分子材料。熱塑性橡膠具有普通硫化膠的類似物性，相似的結構（均為聚異戊二烯結構），但不需硫化，可與熱塑性樹脂一樣，用普通塑料加工方法成型，制品可回收再加工而不失其基本性能。骨通貼膏基質骨架材料為高分子聚合物，無以往天然橡膠貼膏基質中的高蛋白類物質和不飽和松香酸，可減少皮膚過敏反應［8］。熱塑性橡膠黏接強度高并且低敏、低刺激、皮膚相容性好、載藥量大并且適應熱熔或溶劑型涂布，可配置成適宜人體皮膚生物學和透濕性要求而且不易過敏的新型基質［9］。這種新型材料的開發，給橡膠工業帶來重大革新。它打破了橡膠和塑料之間的傳統界限，在節能、省力和防止環境污染方面，更具經濟和社會效益。

骨通貼膏熱壓法生產過程分為捏煉、混合、涂膠、收卷、分切和包裝幾個工序。熱壓法生產橡膠膏劑與溶劑法相比：不使用溶媒，無易燃易爆揮發性物體，安全、環保，廠房占地面積小，揮發性藥物損失少，生產效率高，投資少［9-10］。中藥的毒性與無毒性是中醫中藥理論的重要組成部分。古代和現代醫生對同一種中藥的毒性有不同的描述，給臨床用藥帶來了一定的難度。究其原因，一方面可能是中藥毒性的客觀判定標準較少，且中藥毒性的影響因素很多。例如配伍是否合理，用量是否合適，炮制工藝是否得當，劑型是否合適，這些都能影響藥物的毒性。此外，中藥的產地、用藥部位、采收時間、貯存條件等對中藥的毒性也有一定的影響［11］。研究人員常運用急性毒性實驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、單次皮膚刺激試驗和大鼠致畸試驗等試驗進行中藥及保健食品安全性評價［11-12］。骨通貼膏（熱壓法）采用熱塑性橡膠為輔料基質，運用熱壓法生產，輔料發生了改變，為確保臨床用藥安全，課題組對其進行了急毒、刺激、過敏和誘變實驗研究，實驗結果顯示骨通貼膏（熱壓法）對實驗動物皮膚無刺激、不致敏、無吸收中毒，亦無潛在的誘變作用，表明臨床應用安全可靠，為臨床用藥提供了科學依據。

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（收稿日期：2023-11-08編輯：劉斌）