阿膠多肽的組成及功能研究進展

關(guān)鍵詞： 阿膠；阿膠多肽；免疫調(diào)節(jié)；抗氧化；補血；抗腫瘤

中圖法分類號： Q51 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）02-0288-07

阿膠產(chǎn)業(yè)是醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，山東阿膠產(chǎn)業(yè)在全國具有明顯優(yōu)勢，產(chǎn)業(yè)規(guī)模占全國70%，在國內(nèi)外影響力越來越大，已經(jīng)成為山東省中醫(yī)藥和醫(yī)養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)的名片［1］。阿膠是以馬科動物驢的干皮或鮮皮為主要成分經(jīng)煎煮、濃縮而制成動物膠，在提高紅細胞數(shù)量、補氣補血、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用［2］。阿膠中蛋白質(zhì)含量在60%～80%，主要由膠原蛋白、血清白蛋白等相對分子量較大的蛋白質(zhì)組成［3］。這些大分子量蛋白質(zhì)不易被人體直接吸收從而產(chǎn)生“滋膩礙胃”的問題，導(dǎo)致生物利用度低從而降低了阿膠的保健作用［4］。越來越多的研究表明，采用生物酶解技術(shù)分解阿膠中的大分子蛋白質(zhì)形成的阿膠多肽，能被機體吸收且有良好的生物相容性。特別是分子量lt;3 000 Da 的阿膠多肽在免疫調(diào)節(jié)、補血升白、抗氧化、緩解老年癡呆癥等方面具有重要的保健作用［5-9］。因此，阿膠多肽成為阿膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展和升級的新增長點。近年來，許多學(xué)者利用不同檢測方法和各種組學(xué)技術(shù)，探究阿膠多肽的形成規(guī)律進一步闡明其發(fā)揮保健功效的分子基礎(chǔ)和調(diào)控作用機制。

1 阿膠多肽的組成和性質(zhì)

阿膠中的主要成分是蛋白質(zhì)，包括Ⅰ型膠原蛋白（COLIα1、COLIα2）、Ⅱ型膠原蛋白（COLIIα1）和血清白蛋白（ALB）等大分子量蛋白［10］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，COLI 和COLII 蛋白存在NC1 保守結(jié)構(gòu)域和大量Pro 富集區(qū)，具有結(jié)合金屬離子的能力。ALB 蛋白存在Ca2+和Zn2+離子結(jié)合位點，該蛋白具有結(jié)合DNA、腸桿菌素、脂肪酸、磷酸吡哆醛等物質(zhì)的能力，這可能是其發(fā)揮響應(yīng)細胞饑餓、維持線粒體定位和負調(diào)控凋亡過程的重要原因（表1）。阿膠蛋白質(zhì)在生物酶的分解作用下形成分子量不同的阿膠多肽，是阿膠發(fā)揮藥理作用和保健效果的關(guān)鍵因子［11］。褚夏燕等［12］使用胰蛋白酶酶解阿膠，然后利用高pH 反相色譜預(yù)分離的方法結(jié)合nano LC-Q-Exactive-MS/MS 多肽分析技術(shù)對酶解得到的阿膠多肽物質(zhì)進行分離和質(zhì)譜鑒定，共分離鑒定出2291 個馬屬多肽序列。進一步地，通過Max Quant 軟件結(jié)合蛋白數(shù)據(jù)庫、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了255 個含有美拉德修飾的多肽。在數(shù)據(jù)庫中進行BLAST對上述多肽的蛋白歸屬進行對比分析，發(fā)現(xiàn)所檢出的多肽源于678 個馬屬蛋白（表2）。上述肽段平均氨基酸數(shù)量11，平均相對分子量1130，經(jīng)酶解后阿膠分子量顯著減小。這些信息為深入了解阿膠多肽的序列組成和效應(yīng)物質(zhì)提供了新的線索和關(guān)鍵信息。

最近，王瑩雪等［9］將阿膠置于含有胃蛋白酶的人工胃液和含有胰蛋白酶的人工腸液中進行消化，對得到的阿膠多肽進行LC-MS/MS 分析，獲得519 種活性多肽，其分子質(zhì)量在661.4～2 851.4 Da 之間，主要為COLI、COLII 和ALB 蛋白的酶解產(chǎn)物，酶解產(chǎn)生的阿膠多肽通過結(jié)合結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、β-分泌酶（BACE1）和氨基肽酶（APN）等重要的活性酶在降低血壓、改善阿爾茲海默癥、抑制腫瘤等方面發(fā)揮重要作用（表3）。上述研究結(jié)果為篩選具有特殊保健作用和藥理效果的活性多肽提供了參考。

2 阿膠多肽的保健作用

2.1 免疫調(diào)節(jié)

胸腺、脾等免疫器官，淋巴細胞、吞噬細胞等免疫細胞，抗體、淋巴因子等免疫活性物質(zhì)在機體不同層級的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。前期的研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度阿膠多肽顯著提高脾細胞抗體生成，促進血清溶血素含量提高1.07～1.21 倍，脾淋巴細胞的增殖能力提高1.36 倍，細胞免疫功能提升1.26～1.30 倍從而提高小鼠免疫機能［13］。另外，阿膠能夠提高斑馬魚因化療藥物處理后導(dǎo)致的中性粒細胞的數(shù)量減少和促進吞噬細胞功能［14］。不同動物實驗表明，阿膠在不同條件下能夠提高機體的免疫能力。

目前越來越多的研究表明，阿膠多肽在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能中起重要作用。付英杰等［15］使用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理阿膠溶液，分級超濾后得到不同分子量的阿膠多肽濾液。對腹腔注射氫化可的松復(fù)制免疫低下小鼠模型，分別給予腹腔注射1 000～3 000 Da阿膠多肽，灌胃lt;5 000 Da阿膠多肽。給藥6 d 后，前者處理可顯著提升血紅蛋白，其作用高于后者，但提升紅細胞計數(shù)和白細胞計數(shù)的作用則與阿膠相當(dāng)。同時，阿膠多肽通過不同給藥途徑均可顯著增加受試小鼠的脾重指數(shù)，表現(xiàn)出免疫增強作用［16］。梁榮等［5］采用了胰蛋白酶和胃蛋白酶處理阿膠得到大量分子量＜3 000 Da 的阿膠多肽。對健康小鼠分別用阿膠和阿膠多肽灌胃處理后發(fā)現(xiàn)，阿膠多肽能夠提高小鼠的抗缺氧能力、耐寒能力、游泳時間、胸腺和脾臟指數(shù)。曲媛鑫等［17］研究了小分子量阿膠多肽對對免疫功能的影響。對小鼠進行灌胃14 d 后，與模型組比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的阿膠多肽顯著提高免疫功能低下小鼠血清溶血素含量。3.00、1.50 g/kg 的阿膠多肽顯著提高小鼠耳廓腫脹度。3.00 g/kg 顯著提高小鼠T 淋巴細胞、輔助性T細胞和遲發(fā)超敏性T細胞占淋巴細胞的比例。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，與低、中劑量（0.18、和0.35 g/kg）相比，高劑量（1.05 g/kg）組具有最佳的增加小鼠血清溶血素水平、增強小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和促進小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖的能力；而中劑量組小分子阿膠肽能明顯增加小鼠脾細胞抗體生成的效果［18］。上述結(jié)果表明，阿膠多肽通過提高體液免疫和細胞免疫功能，對小鼠免疫功能發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

2.2 提高紅細胞和白細胞數(shù)量

阿膠被稱為補血圣藥，具有提高紅細胞數(shù)量、增加白細胞和改善貧血的作用［19-21］。越來越多的研究使用不同方法制備阿膠多肽，探索其升高紅細胞和白細胞數(shù)量的機制。Xiao等［22］研究發(fā)現(xiàn)，模擬人體消化過程酶解阿膠得到分子量＜5 000 Da阿膠多肽A和5 000～8 000 Da阿膠多肽B。A和B均可促進貧血小鼠外周血白細胞和紅細胞的升高，且前者效果優(yōu)于后者。阿膠多肽可能與保護貧血小鼠造血微環(huán)境及造血干細胞，刺激髓外造血器官相關(guān)造血細胞因子表達有關(guān)［23］。Li等［24］采用了液質(zhì)聯(lián)用成功從阿膠中分離出2 條具有補血功能的多肽序列（APGAPGAPGPVGPGPAGK 和VPGPMGPSGPR），為阿膠多肽發(fā)揮補血作用提供了分子證據(jù)。

Zhang 等［25］發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶分解阿膠后形成的分子量3 700 Da 左右的阿膠多肽能顯著提高血虛模型小鼠的血紅蛋白和紅細胞計數(shù)。同時，還能提高白細胞減少模型小鼠的白細胞計數(shù)、紅細胞和血紅蛋白水平。上述結(jié)果說明阿膠多肽且具有顯著的補血升白作用。

為了研究阿膠多肽的活性成分與補血功能之間的關(guān)系，曹叢叢等［6］采用利用固定化金屬親和層析分離獲得鐵螯合肽。通過分析螯合物的物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，螯合鐵離子的阿膠多肽分子質(zhì)量集中分布在180～2 000 Da，通過質(zhì)譜鑒定得到4條多肽序列，分別為LRGPRGDQGPVGRA、GPAGPIGPV、LQGMPGERG和AGPPGADGQPGAK。肽段氨基酸殘基的羧基和氨基與鐵離子形成結(jié)構(gòu)相對致密的螯合物。上述結(jié)果，有助于科學(xué)評價阿膠多肽的補血作用。

2.3 抗氧化

體內(nèi)的自由基與DNA、蛋白質(zhì)、脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)會引起細胞損傷和組織及器官功能下降，是引發(fā)一系列慢性疾病和衰老的重要原因［26］。研究發(fā)現(xiàn)，動物來源的膠原肽在直接清除自由基、螯合促氧化金屬離子、調(diào)節(jié)產(chǎn)ROS氧化酶、增強抗氧化防御系統(tǒng)、細胞保護作用、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面比許多其他蛋白質(zhì)來源的抗氧化肽能有效地發(fā)揮作用［27］。

近年來，關(guān)于阿膠多肽抗氧化作用的報道越來越引起人們的關(guān)注。XU 等［28］使用堿性蛋白酶制備高抗氧化阿膠多肽，發(fā)現(xiàn)分子量小于3000Da 多肽對.OH自由基的清除能力更強，表現(xiàn)出更高的清除DPPH自由基能力。另外，阿膠多肽加入銀杏葉提取物進行能夠提高阿膠多肽的抗氧化活性。進一步分析阿膠多肽的一級和二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的占比分別為42.40%、30.4%和46.8%。由此推測阿膠的二級結(jié)構(gòu)與高抗氧化性密切相關(guān)［29］。樊雨梅等［7］采用不同生物酶處理阿膠，發(fā)現(xiàn)分子量lt;900 Da 的阿膠多肽可清除DPPH、ABTS 自由基和減輕H₂O₂誘導(dǎo)的成纖維細胞的氧化損傷，且阿膠多肽的保健效果優(yōu)于阿膠。上述研究表明，阿膠多肽作為小分子混合物，氨基酸組成、分子量大小、二級結(jié)構(gòu)與其抗氧化能力有相關(guān)性。

2.4 抗腫瘤作用

阿膠在抗腫瘤方面已有廣泛的應(yīng)用，比如復(fù)方阿膠漿聯(lián)合個性化綜合護理改善了宮頸癌化療致骨髓抑制及癌疲乏癥狀［30］。與對照組相比服用復(fù)方阿膠漿的患者外周血象指標(biāo)、中醫(yī)癥狀積分、KPS評分及免疫功能指標(biāo)等方面優(yōu)于前者［31］。王瑩雪等［9］在人工胃液和腸液處理的阿膠產(chǎn)物中分離了519種阿膠多肽，通過Discovery Studio（DS）2017 R2軟件篩選了10 個可與抗腫瘤靶標(biāo)APN（Aminopepti-dase N，氨基肽酶N）發(fā)生不同程度結(jié)合的阿膠多肽［32］，分別是ASGPMPR、PAGPAGPR、PQGVQG GK、ASGPAGPR、PAGPTGAR、MGLMGPR、ADGVAGPK、NGLTGAK、TGEQGDR和ANGLTGAK，具有潛在的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的候選物。通過進一步分析APN活性位點和與多肽之間的作用力，預(yù)測候選物中ADGVAGPK多肽是阿膠模擬胃腸道消化產(chǎn)物中最值得深入研究的抗腫瘤肽。

2.5 改善阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease， AD）

AD即原發(fā)性癡呆癥，是一種與年齡高度相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，占老年性癡呆癥患者總數(shù)的70%左右，嚴重影響生活質(zhì)量和健康。AD發(fā)病機制主要有膽堿能學(xué)說、β 淀粉樣蛋白毒性學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等［33］。Li 等［34］將阿膠置于人工制備的胃液、膽汁和十二指腸液中模擬其在胃和小腸中的消化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿膠多肽能夠抑制神經(jīng)生長因子分化神經(jīng)元PC12 細胞中的乙酰膽堿酯酶（AChE）活性，阻止H2O2誘導(dǎo)的AChE 異常惡化，增加了PC12 細胞的腎上腺素活性并增強了β 淀粉樣蛋白清除。人工胃液和腸液處理的阿膠產(chǎn)物中與AD發(fā)病關(guān)鍵因子乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（BChE）和β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（BACE1）的分子對接結(jié)果中，有23 個阿膠多肽與受體AChE對接成功，41 個多肽與BACE1 對接成功，其中22 個均可與AChE和BACE1 發(fā)生不同程度結(jié)合［35］。其中，阿膠多肽SGLDGAKG 序列與AChE 和BACE1 結(jié)合的－CDOCKER_Energy 值均為最高，被認為是最具潛力的抗老年癡呆肽［9］。上述研究結(jié)果表明，阿膠多肽對于AD 具有改善作用，有助于預(yù)防和治療老年癡呆癥。

2.6降低老年高血壓

有研究表明，黃連阿膠湯在治療老年高血壓并發(fā)失眠和老年原發(fā)性高血壓伴焦慮癥方面有較好的效果［36-37］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）是降血壓的靶標(biāo)。體外消化阿膠產(chǎn)物中有42個阿膠多肽可以與ACE 發(fā)生不同程度的結(jié)合，具有潛在的ACE抑制活性［38，39］。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，與ACE結(jié)合值最高的3 個多肽依次為KGETGLR、TGEQGDR 和VQLSGEEK，可以作為ACE 抑制劑的候選物。通過生物信息學(xué)分析ACE活性位點和與上述3 條多肽之間的作用力，阿膠多肽KGETGLR被認為是最具潛力的降壓肽。上述結(jié)果為阿膠多肽降血壓提供了研究線索。

3結(jié)論

阿膠被不同生物酶分解形成不同長度和活性的阿膠多肽［9-12］。近年來大量分析研究已表明，阿膠多肽在免疫調(diào)節(jié)［13-18］、補血升白［22-25］、抗氧化［7，28-29］、抗腫瘤［9，32］、改善AD［9，34-35］、降低老年高血壓［36-39］等方面發(fā)揮保健作用。然而，目前的研究多在體外或使用動物模型研究阿膠多肽的形成規(guī)律和保健功能，未明確阿膠多肽如何在人體內(nèi)的變化規(guī)律和的具體調(diào)節(jié)機制。另外，阿膠多肽發(fā)揮保健作用是否與依賴阿膠中糖類、揮發(fā)性物質(zhì)、無機鹽、脂類及脂肪酸某一成分還是多種成分協(xié)同仍不清楚，有關(guān)阿膠多肽免疫調(diào)控作用的分子機制尚未清晰。毛驢全基因組測序工作已經(jīng)完成［40］，Uniprot 等生物學(xué)信息學(xué)平臺中有毛驢蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，借助蛋白質(zhì)組學(xué)［41］、代謝物組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等交叉學(xué)科的研究方法和技術(shù)，為今后深入研究阿膠多肽的保健功能提供了新思路。