超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究板栗皮槲皮素類物質(zhì)消化前后的組成差異

摘 要：黃酮類物質(zhì)是植物次級代謝產(chǎn)物，能夠抑制胰脂肪酶活性，具有潛在的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用。槲皮素屬于黃酮類物質(zhì)中的黃酮醇類，因此，研究槲皮素及其糖基化衍生物在體內(nèi)的消化機(jī)制，對開發(fā)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能產(chǎn)品具有重要意義。本試驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，分析了板栗皮槲皮素類物質(zhì)經(jīng)過模擬人體消化體系后的組成變化。結(jié)果表明，板栗皮樣品中的槲皮素類物質(zhì)含量在消化后顯著降低（P＜0.05），差異代謝物分析顯示，下降較為顯著的是槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，在模擬胃腸消化后分別降低了94.08%（板栗內(nèi)皮）和90.88%（板栗外皮）。綜上，板栗皮槲皮素類物質(zhì)在消化過程中穩(wěn)定性較差，未來可采用納米顆粒負(fù)載等方式對其進(jìn)行包埋，以提高其生物利用率。

關(guān)鍵詞：板栗皮；黃酮類物質(zhì)；槲皮素；體外消化；差異代謝物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號：S664 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）02-0018-08

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.02.005

Study on the Composition Differences of Quercetin Substances

in Chestnut Peel before and after Digestion by UPLC-MS/MS

ZHANG Wen1，2，3，4， LEI Sichao1，2，3，4， ZHONG Shuyan1，2，3，4， LIU Yiyan1，2，3，4， YANG Fang1，2，3，4*

（1. School of Environmental Ecology and Biological Engineering， Wuhan Institute of Technology， Wuhan 430205， China; 2. Key Laboratory of Green Chemical Process （Wuhan Institute of Technology）， Wuhan 430205， China;

3. Engineering Research Center of Phosphorus Resources Development and Utilization of Ministry of Education， Wuhan 430205， China; 4. Hubei Key Laboratory of Novel Reactor and Green Chemical Technology，

Wuhan 430205， China）

Abstract： Flavonoids are secondary metabolites of plants， which can inhibit pancreatic lipase and" have potential function of regulating lipid metabolism. Quercetin belongs to flavonols in flavonoids. Therefore， it is of great significance to study the digestive mechanism of quercetin and its glycosylated derivatives in vivo to improve the research and development of functional products regulating lipid metabolism. This experiment used a widely targeted metabolomics technique of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） to analyze the composition changes of quercetinsubstances in chestnut peel after simulated human digestion system. The results showed that there was a significant difference in the content of quercetinsubstances in chestnut skin samples before and after digestion （P＜0.05）. Differential metabolite analysis showed that the content of quercetin substances in chestnut skin decreased significantly before and after digestion， with quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside decreased by 94.08% chestnut pellicle and 90.88% chestnut shell after simulated gastrointestinal digestion， respectively. In summary， the stability of quercetinsubstances in chestnut peel was poor during digestion. In the future， nanoparticle loading and other methods can be used to embed them to improve their bioavailability.

Keywords： Chestnut skin; flavonoids; quercetin; in vitro digestion; differential metabolites; UPLC-MS/MS

我國是板栗的原產(chǎn)國且是世界第一生產(chǎn)大國，目前在板栗產(chǎn)業(yè)中，板栗加工企業(yè)以果肉初加工為主，且板栗外殼多以燃燒和自然腐爛的方式處理，易對環(huán)境造成污染。板栗殼中含有豐富的槲皮素及其衍生物，包括槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、蘆丁等多種物質(zhì)。槲皮素類物質(zhì)屬于黃酮類物質(zhì)中的黃酮醇類[1]，有抗氧化[2]、抗癌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]和清除自由基[6]等作用，還具有保護(hù)心血管[7]、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、增加冠脈血流量等功能，是一種良好的天然功能因子[8]，在藥物開發(fā)[9]、食品保鮮[10-12]與功能性食品開發(fā)[13]等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。

相關(guān)研究表明，槲皮素在自然界中主要與葡萄糖等分子結(jié)合形成糖苷鍵后以糖綴合衍生物的形式存在，由于糖的親水性，槲皮素糖苷在水中表現(xiàn)出比槲皮素更好的溶解度，提高了槲皮素的生物利用率[14]，研究結(jié)果表明，糖類的修飾使槲皮素在抗氧化能力上也有一定的提升[15]。目前，大部分的研究集中在槲皮素對淀粉酶、α-葡萄糖苷酶等消化酶的抑制作用上[16]，但是關(guān)于其在人體胃腸消化情況的研究較為少見。因此，本試驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，研究板栗皮槲皮素類物質(zhì)在胃腸道模擬消化體系中的組成變化，為板栗皮槲皮素類物質(zhì)調(diào)節(jié)等脂質(zhì)代謝功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

板栗，品種為‘紅光油栗’，產(chǎn)地湖北羅田。

胃蛋白酶（≥2 500 U/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 U/mg），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、乙酸（色譜級），默克化工技術(shù)（上海）有限公司；無水乙醇（分析純）、豬膽鹽，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

THZ-100 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超高效Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 液相色譜（UPLC），島津公司；Applied Biosystems 6500 Q TRAP 串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS），島津公司；FW80 型高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；MM400研磨儀，Retsch 公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Alpha 1-4LD plus 凍干機(jī)，德國 Christ 公司；ML-204/02 型精密電子天平（精度：0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GZX-9030 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 ，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 板栗外皮和板栗內(nèi)皮提取物的制備

采用蘇云霞等[17]的提取工藝提取板栗皮中的多酚。將收集好的板栗皮用蒸餾水洗凈，置于干燥箱（45～50 ℃）中除去板栗皮中的水分，將板栗皮粉碎后過 50目篩得到板栗內(nèi)皮與板栗外皮，準(zhǔn)確稱取一定量的板栗外皮與板栗內(nèi)皮，按照板栗殼粉末∶70%乙醇溶液1∶15（g/mL）的料液比，在 60 ℃ 下震蕩 90 min后得粗提液，冷卻后進(jìn)行真空抽濾，而后在 40 ℃ 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，對得到的粗提液進(jìn)行冷凍干燥，得到板栗外皮提取物（chestnut shell extract，CSE）以及板栗內(nèi)皮提取物（chestnut pellicle extract，CPE）。

1.2.2 體外模擬胃腸消化模型

（1）模擬胃消化

胃消化液配制：準(zhǔn)確稱取 0.4 g 胃蛋白酶溶于 90 mL、9 mg/mL的 NaCl 溶液中，用 1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié) pH至2～2.3[18]。

模擬胃消化試驗：吸取16 mL 胃消化液加入上述消化液樣品中，37 ℃震蕩（250 r/min）2 h，用1 mol/L" NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 至7～7.5，終止胃消化反應(yīng)。

（2）模擬小腸消化

腸消化液配制：準(zhǔn)確稱取 225 mg 胰蛋白酶和 225 mg豬膽鹽溶于 90 mL、9 mg/mL的 NaCl溶液中，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 至 7～7.2，即為腸消化液[19]。

模擬腸消化試驗：吸取 20 mL 上述腸消化液加入上述消化液樣品中， 37 ℃條件下100 r/min震蕩2 h，得到腸消化代謝物。

消化后的樣品在4 ℃下于冷凍離心機(jī) 8 000 r/min離心 10 min，取上清液低溫保存[20]。得到胃腸消化后的板栗外皮代謝物（digested chestnut shell extract，DCSE），胃腸消化后的板栗內(nèi)皮代謝物（digested chestnut pellicle extract，DCPE）。

1.2.3 樣品前處理

取上述處理得到的CSE、CPE、DCSE、DCPE樣品進(jìn)行冷凍干燥，研磨 1.5 min，分別稱取 100 mg 上述樣品，加入1.0 mL甲醇水溶液（甲醇∶水=7∶3），完全溶解后放入4 ℃冰箱過夜，其過程中渦旋 3 次，以提高其提取率。10 000 g離心 10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，所得樣品存于-20 ℃冰箱，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.2.4 高效液相色譜條件

色 譜 柱 ：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；流動相：A 相為乙酸水溶液（ 0.04%乙酸），B 相為乙酸乙腈溶液（0.04%乙酸）。洗脫梯度 ：0～11.0 min時， A 相由 95% 降至5%；11.0～12.0 min時，A 相為5%；12.0～12.1 min時，A 相由 5% 升至 95%；12.1～15.0 min時，A 相為95%。

1.2.5 質(zhì)譜條件

參考金玉娥等[21]的方法，儀器質(zhì)量校準(zhǔn)和儀器調(diào)優(yōu)分別在 LIT 和 QQQ 模式下于 100 μmol/L和10 μmol/L聚丙二醇溶液中進(jìn)行，電噴霧離子源溫度：500 ℃；離子噴霧電壓 ：5 500 V；離子源簾氣：25 psi；碰撞氣體（氮氣）：5 psi。按要求設(shè)置參數(shù)后進(jìn)行多次反應(yīng)監(jiān)測（MRM），得到 QQQ 掃描。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

樣品通過UPLC-MS/MS分析得到相關(guān)數(shù)據(jù)，通過Analyst 1.6.3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，為確保定性定量的準(zhǔn)確性，對檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)顯示合格后，使用統(tǒng)計軟件 Statistix 9 進(jìn)行方差分析和多重比較分析 （Duncan分析）。并使用 TBtools 軟件繪制不同槲皮素組分的聚類分析熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差分析

從表 1 可以看出，CSE、DCSE、 CPE和 DCPE中含量最高的前5種槲皮素類化合物中都含有槲皮素、二氫槲皮素（花旗松素）、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（金絲桃苷）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時消化后槲皮素、二氫槲皮素（花旗松素）和槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷*的含量顯著下降（P＜0.05）。

2.2 代謝前后差異組分聚類分析

使用TBtools 軟件對樣品進(jìn)行聚類分析并繪制聚類熱圖。圖中橫坐標(biāo)代指樣品名稱，縱坐標(biāo)代指代謝物名稱，每種樣品在一個單獨的列中，每種槲皮素組分由一個單獨的行表示；顏色代表相關(guān)系數(shù)值大小，深色表示高濃度，淺色表示低濃度。

圖1顯示，對數(shù)據(jù)歸一化處理后，除槲皮素-3-O-β-D-木糖-（1→2）-β-D-半乳糖苷外，CSE槲皮素類物質(zhì)含量均較高，且互相之間含量的差距不大，消化前為深色并規(guī)則聚集，消化后顯示淺色。由此可知，除槲皮素-3-O-β-D-木糖-（1→2）-β-D-半乳糖苷外，CSE槲皮素類物質(zhì)含顯量著高于DCSE的槲皮素類物質(zhì)含量。

圖1 CSE和DCSE不同槲皮素組分的層次聚類分析熱圖

Fig.1 Hierarchical cluster analysis heat map of different quercetin components in CSE and DCSE

圖2 CPE和DCPE不同槲皮素組分的層次聚類分析熱圖

Fig.2 Hierarchical cluster analysis heat map of different quercetin components in CPE and DCPE

圖2結(jié)果顯示，CPE槲皮素類物質(zhì)含量均較高，CPE的聚類情況與CSE相似，DCPE的槲皮素類物質(zhì)含量明顯低于CPE的槲皮素類物質(zhì)含量。由此可得，體外消化對槲皮素類物質(zhì)含量影響較大。

2.3 代謝差異物分析

2.3.1 板栗外皮消化前后槲皮素類物質(zhì)中的代謝差異物

由表 2可得，DCSE較CSE的槲皮素類物質(zhì)含量除槲皮素-3-O-β-D-木糖-（1→2）-β-D-半乳糖苷外均顯著降低（P＜0.05），其中槲皮素-5-O-葡萄糖醛酸苷降低程度最高，達(dá)91.77%；槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷次之，達(dá)90.88%；槲皮素-3-O-（2''-沒食子酰）-β-D-半乳糖苷與槲皮素 3-O-β-D-新橘皮糖苷均達(dá)87.50%；槲皮素-7-O-（6''-O-丙二酰基）-β-D-葡萄糖苷、3，7-二-O-甲基槲皮素、槲皮素-O-阿魏酰戊糖苷、槲皮素分別為 85.88%、85.62%、84.56%及79.20%。

2.3.2 板栗內(nèi)皮消化前后槲皮素類物質(zhì)中的代謝差異物

由表 3可得，DCPE較CPE的槲皮素類物質(zhì)含量均顯著降低（P＜0.05），其中槲皮素-3-O-（2-O-α-L-吡喃鼠李糖酰）-β-D-吡喃半乳糖苷*降低程度最高，達(dá)99.99%；槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷次之，達(dá)94.08%；槲皮素-7-O-（6''-O-丙二酰基）-β-D-葡萄糖苷、3，7-二-O-甲基槲皮素、槲皮素-O-阿魏酰戊糖苷*、槲皮素分別為 84.26%、86.12%、84.44%及76.16%。

3 小結(jié)

本試驗以板栗皮提取物中的槲皮素類物質(zhì)為研究對象，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析得到對應(yīng)代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，研究板栗皮槲皮素類物質(zhì)在模擬人體消化過程中代謝物種類和含量的變化。通過Duncan 多重比較分析、方差分析以及聚類分析得出，板栗皮中的槲皮素類物質(zhì)含量在消化后顯著下降，消化前后板栗皮中槲皮素類物質(zhì)含量下降較為顯著的是槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，在模擬胃腸消化后分別降低了94.08%（板栗內(nèi)皮）和90.88%（板栗外皮）。板栗內(nèi)皮經(jīng)消化后，板栗外皮槲皮素類物質(zhì)中槲皮素-5-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（2''-沒食子酰）-β-D-半乳糖苷*等31種槲皮素類化合物均顯著降低，板栗外皮經(jīng)消化后，板栗內(nèi)皮槲皮素類物質(zhì)中槲皮素-3-O-（2-O-α-L-吡喃鼠李糖酰）-β-D-吡喃半乳糖苷*、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-7-O-（6''-O-丙二酰基）-β-D-葡萄糖苷等32種槲皮素類化合物均顯著降低。

因此，板栗皮槲皮素類物質(zhì)在消化過程中穩(wěn)定性較差，未來可采用納米顆粒負(fù)載等方式對其進(jìn)行包埋，以提高其生物利用率。

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收稿日期：2023-09-17

基金項目：湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（S202310490021）；武漢工程大學(xué)校長基金資助項目（XZJJ2023049）

第一作者簡介：張文（2003—），男，在讀本科，專業(yè)為食品科學(xué)與工程

*通信作者簡介：楊芳（1978—），女，教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物與功能因子的研究與教學(xué)工作