“海黃”牡丹香葉醇合酶基因PsGES的克隆及功能驗證

摘要：[目的]探究植物釋放的萜類化臺物合成代謝的機理，為進一步解析牡丹萜類合酶基因家族的生物學功能提供理論依據(jù)。[方法]以芳香型牡丹品種“海黃”（Paeonia×iemoinei High Noon）為材料，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序所得片段，克隆得到PsGES基因。同時利用瞬時表達方法將PsGES基因過表達載體注射進煙草葉片和“鳳丹”花瓣中驗證基因功能。[結(jié)果]該結(jié)構(gòu)基因的完整CDS序列長897 bp，編碼298個氨基酸，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有較高的保守性，有1個保守結(jié)構(gòu)域Terpene-cyclase_plant_C1。PsGES基因在盛開期花瓣中表達量最高且明顯高于其他器官。亞細胞定位分析表明PsGES主要定位于葉綠體中。通過GC-MS方法可檢測到煙草葉片和“風丹”花瓣中香葉醇的釋放，同時煙草葉片和“鳳丹”花瓣中PsGES基因呈現(xiàn)高表達。[結(jié)論]本研究表明PsGES基因在植物體內(nèi)調(diào)控香葉醇的合成。

關(guān)鍵詞：牡丹；香葉醇；香葉醇合酶基因；基因克隆；功能驗證

中圖分類號：S685.11 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）04-0052-10

牡丹（Paeon/a suffruticosa Andr）是我國的傳統(tǒng)名花，花大色艷，兼?zhèn)湫巍⑸⑾闳兀且环N非常受歡迎的觀賞植物，在園林中占有重要地位。牡丹有1 500多個品種，栽植范圍廣，其中‘海黃’（Paeonia×Iemornei High Noon）是黃色系、晚開、芳香型牡丹品種。花香即小分子的揮發(fā)性物質(zhì)，是觀賞植物的重要觀賞性狀之一，目前可以利用頂空固相微萃取來采集揮發(fā)物，再通過氣相色譜·質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)物成分進行鑒定。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物合成并釋放m的多種揮發(fā)物中萜類化合物和脂肪酸衍生物占主導地位，其中萜類化合物是‘墨紅’玫瑰（Rosa Crimson Glory）、百合（Lillum）、桂花（Osmanthus fragrans （Thunb.） Lour）、蠟梅（Chimonanthus praecox （L.） Link）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis）等觀賞植物的主要花香成分。

近年來，牡丹花香的相關(guān)研究逐漸引起關(guān)注。不同牡丹品種之間的香氣成分存在較大差異，其中萜類化合物是牡丹花香揮發(fā)物中最主要的成分。Li等首次分析了30個牡丹品種的花香成分，共鑒定出146種揮發(fā)性物質(zhì)，根據(jù)聚類分析將其花香分為木香（以羅勒烯為主）、玫瑰香（以香茅醇為主）、鈴蘭香（以芳樟醇為主）、酚香（以1，3，5-三甲氧基苯為主）和一種未知香型（以十五烷為主）。Zhang等對4種牡丹（鳳丹、紫斑牡丹、滇牡丹、黃牡丹）的花香化合物進行分析，共鑒定出67種化合物，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，將其代謝途徑分為萜烯類代謝途徑與苯基，苯丙烷類代謝途徑。Li等認為LIS和MYS分別調(diào)控合成芳樟醇和月桂烯，二者的差異表達導致‘黃冠’比‘鳳丹’呈現(xiàn)更濃的香氣。Li等通過不同來源的牡丹種與品種花香成分及轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)Pd TPS1、Pd TPS2、Pd TPS4參與芳樟醇合成，隨后驗證PdTPS1和尸dTPS4是決定芳樟醇的物種特異性和品種特異性排放的關(guān)鍵基因，這項研究進一步揭示了牡丹花香的差異機理。本實驗室前期研究結(jié)果表明，“海黃”作為芳香型牡丹品種，單萜類化合物是其特有香氣的主要來源。香葉醇作為其中的單萜類化合物之一，在植物體內(nèi)生物合成的主要途徑是甲基赤蘚醇磷酸（MEP）途徑。MEP途徑是在質(zhì)體中以丙酮酸、磷酸甘油醛為底物生成單萜類化合物和二萜類化合物。本研究對“海黃”牡丹中的香葉醇合酶基因PsGES功能進行了探索，探究該基因的生物學功能，為進一步探索牡丹中萜類合酶基因家族的生物學功能提供科學依據(jù)。