帝斯曼在中國布局的主要酵母相關專利技術綜述

摘 要：【目的】通過對荷蘭皇家帝斯曼集團在中國布局的酵母相關專利信息進行分析，了解其關于宿主菌酵母及其表達產物的技術信息，為我國相關創新主體研發工作的開展提供技術啟示。【方法】通過智慧芽專利數據庫檢索帝斯曼在中國布局的主要酵母相關的專利申請，并對檢索結果進行統計和分析。【結果】帝斯曼在中國專利制度建立之初就開始布局酵母相關專利，且其涵蓋的技術領域較廣，并形成了較為完善的專利保護體系。【結論】帝斯曼結合分子生物學手段和合成生物學方法，優化外源蛋白在工業菌株畢赤酵母中的表達，為我們提供了相關的技術方案，同時也為我國相關創新主體的研發工作提供了技術啟示。

關鍵詞：帝斯曼；酵母；專利分析

中圖分類號：Q819 文獻標志碼：A 文章編號：1003-5168（2024）16-0130-05

DOI：10.19968/j.cnki.hnkj.1003-5168.2024.16.026

A Review of the Main Yeast-related Patent Technologies of DSM in China

HOU Sicong1 SHI Chaoshuo2 LI ji1

（1.Beijing RisingMark Intellectual Property Agency， Beijing 100071，China;

2.School of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract：[Purposes] By analyzing the yeast-related patent information of DSM in China， this paper aims to understand its technical information on host yeast and its expression products， providing technical inspiration for the development of related innovative entities in China.[Methods] By using the Patsnap patent database to search for the main yeast-related patent applications of DSa7df9b3b258e1f74ad35807af099ad0dM in China， this paper conducts statistical and analytical analysis of the search results.[Findings] It was found that DSM began to lay out yeast related patents from the beginning of the establishment of the Chinese patent system， and it covers a wide range of technical fields， and a relatively complete patent protection system. [Conclusions] DSM combined molecular biology and synthetic biology methods to optimize the expression of exogenous proteins in the industrial strain Pichia pastoris， which provides relevant technical solutions for us， and also provides technical inspiration for the research and development of related innovative bodies in China.

Keywords： DSM; yeast; patent analysis

0 引言

酵母（yeast） 是最早被人類馴化利用的微生物，其在食品、飲料、飼料、工業乙醇等領域得到廣泛應用［1-2］。面對海量的信息，專利信息檢索分析能夠從技術、法律、經濟信息等方面，有效地反映出最新的科研開發及技術創新水平［3-5］。例如，陳瑩等［6］從專利分析的角度，揭示了全球特殊酵母工業應用領域技術創新的發展態勢以及各類特殊酵母的應用優勢，為我國特殊酵母工業應用領域科研決策和科研工作提供了參考。

荷蘭皇家帝斯曼集團擁有100多年的歷史，在全球范圍內活躍于健康、營養和材料領域，其產品被廣泛應用于食品和保健品、個人護理產品、醫藥和醫療設備、飼料、汽車和運輸、涂料和油漆、建筑、電子電氣、生命防護、替代能源以及生物基材料等終端市場。

目前，帝斯曼在全球擁有近3.2萬件專利，僅在中國就布局了3 000件以上，涉及生物、化學、醫學等多個技術領域。本研究利用智慧芽專利數據庫，采用申請人結合關鍵詞和分類號的方式進行檢索，重點分析帝斯曼在中國申請的酵母相關專利申請趨勢、熱點技術領域，包括維生素A制備、乙醇生產、生物油制備、二羧酸制備和甜菊醇生產等相關專利技術，以期為我國相關創新主體提供有價值的信息參考。

1 申請趨勢分析

帝斯曼酵母在中國的相關專利申請量呈波動變化趨勢，如圖1所示。從專利申請的數量上來看，在2020年之前，帝斯曼中國專利申請量處于穩步緩慢的增長趨勢，可以看出帝斯曼未曾停止相關領域的研發。但根據對帝斯曼酵母相關中國專利的進一步分析，發現其審中專利占比近23%，而審中專利能從一定程度上反映出創新主體的研發活力和研發熱點。帝斯曼與酵母相關的研發熱點技術領域主要集中在生物燃料，如乙醇；生物油；生物化學品與生物材料，如二羧酸；生物過程法生產維生素與抗生素，如維生素A、維生素D3和維生素E等方面。

2 技術領域分析

為了更具體地了解和分析帝斯曼酵母相關的研究熱點以及在中國布局的技術熱點，對檢索到的相關專利主分類號進行統計與分析，如表1所示。

帝斯曼酵母在中國申請量最多的分類號集中在C12N （微生物或酶；其組合物；繁殖、保藏或維持微生物；變異或遺傳工程；培養基）小類下的3個大組分類號： C12N9/00（酶；酶原； 其組合物，制備、活化、抑制、分離或純化酶的方法）占比18%、C12N15/00（突變或遺傳工程； 遺傳工程涉及的DNA或 RNA，載體（ 如質粒）或其分離、制備或純化； 所使用的宿主）占比14% 和 C12N1/00 （微生物本身，如原生動物；及其組合物）占比13.7%；C12P（發酵或使用酶的方法合成目標化合物或組合物或從外消旋混合物中分離旋光異構體）小類下的兩個大組分類號：C12P7/00 （含氧有機化合物的制備）占比15%和C12P19/00 （含有糖殘基的化合物的制備）占比5%。可見，帝斯曼酵母相關的中國專利涉及的分類號較多，表明其涉足的技術領域較廣。

通過對相關專利中的酵母作用進行分析統計，發現酵母在近73%的專利中是作為生產菌株的，其次是含酵母的常規培養基、酵母提取物、利用酵母自身的基因等。將酵母作為生產菌株包括直接以酵母細胞作為宿主菌或者對酵母細胞自身基因修飾以后將其作為宿主菌。下文結合帝斯曼主要產品對其布局的中國專利技術發展路線進行詳細梳理。

2.1 維生素A相關專利技術分析

帝斯曼開發了全新的生物基工藝生產維生素A。該工藝可以使用一種專門研制的酵母菌株將可再生碳源轉化為維生素A，屬世界首創。本文對維生素A及其一類的化合物包括視黃醛、視黃醇、3-脫氫視黃醇、視黃酸、這些化合物的異構體以及視黃基酯相關專利進行詳細分析。

1997年，帝斯曼在中國最早提出了一件維生素A相關的專利，涉及一種酶促酰化方法CN1169473A。隨后在2000年，帝斯曼布局了首件將酵母作為宿主菌表達β、β-胡蘿卜素15、15′-二加氧酶cDNA以裂解β-胡蘿卜素生成維生素A的專利CN1269366A。2004—2013年間，帝斯曼先后提交了5件關于生產類異戊二烯化合物的甲羥戊酸激酶、用于產生類胡蘿卜素的胡蘿卜素羥化酶和乙酰轉移酶的專利申請。直至2017年，帝斯曼同日提交了5件關于生產維生素A的專利申請，保護能產生胡蘿卜素的酵母菌、酶促方法以及維生素A生產方法，尤其是CN111108194A，能將90％的視黃醛轉換成視黃醇。2019年，專利CN113227365A將乙酰轉移酶在耶氏酵母屬或酵母屬的宿主細胞中異源表達，能夠以葡萄糖為碳源提高乙酸視黃酯的產量，同時增加總類視黃醇的量。2020年，專利CN114127273A保護具有催化β-胡蘿卜素轉換成反式視黃醛的活性的酶，在產生類胡蘿卜素/類視黃醇的耶氏酵母屬或酵母屬中表達，提高反式視黃醛的產率，從而提高維生素A的生產率。同年，專利CN114901816A將耶氏酵母屬LIP8對應的內源酶活性降低或消除，使其以甘油三酯油為碳源，生產總類視黃醇的視黃醇乙酸酯的百分比增加。

可見，帝斯曼在中國提交的專利申請中，有關維生素A制備的專利申請主要致力于維生素A生產方法中的重要中間體/前體的生物生產方法，特別是通過參與視黃醇、視黃醇乙酸酯和/或維生素A產生的（異源）酶在宿主細胞中的表達，或者對宿主菌進行基因修飾再表達該類酶來提高重要中間體/前體的產率，從而進一步提高維生素A的產量。并且首次提出了在合適的培養條件下以可再生碳源（如葡萄糖、甘油三酯油等）進行發酵來生產維生素A。

2.2 乙醇生產相關專利技術分析

日益嚴重的資源短缺和環境惡化，使人們越來越意識到可持續發展與科學發展觀并行的發展觀念很重要，因而節能環保的綠色生產方式也越來越受到關注［7］。作為補充甚至替代化石燃料的新型清潔可持續性的能源生物乙醇也成為帝斯曼研發的重點。

帝斯曼在2000年以后開始布局生物發酵制備乙醇的相關專利。2003年首次提出了將木糖作為碳源進行乙醇發酵的酵母細菌（CN100448996C）。2005—2009年，又申請了9件關于木糖、戊糖發酵的專利，其通過對酵母細胞的改變最終能將木糖發酵轉化為乙醇。2010年，CN112029804A是包含阿拉伯糖異構酶（AraA）、L-核酮糖激酶（AraB）和L-核酮糖-5-P-4差向異構酶（AraD）基因的酵母菌，在耗盡葡萄糖后能夠將阿拉伯糖以厭氧方式發酵半乳糖。同年，還申請了無甘油的乙醇發酵生產的專利（CN102712895B），保護一種缺乏NADH依賴的甘油合成所需的酶的酵母菌株。2012年，帝斯曼提出了一種由乙酸和甘油生產乙醇的工程化酵母菌株（CN104126011B），通過使用經基因修飾的酵母細胞將包括己糖、戊糖、乙酸和甘油的培養基發酵為乙醇，同時能夠有效地提高甘油利用率。之后，帝斯曼提出了具有改善作用的戊糖轉化的細胞（CN112195145A），該細胞能夠在葡萄糖的作用下縮短發酵中包含戊糖和己糖的糖混合物的發酵時間。2015—2019年，帝斯曼又提出了多件利用產醇酵母菌酶促水解木質纖維素材料和發酵糖的方法（CN112553266A、CN107429265A、CN111225982A、CN112204151A）的專利，以及能夠提高產物收率同時降低甘油產量的技術效果的重組酵母細胞相關專利（CN111032854A、CN109312296A、CN110088275A、CN111148840A、CN110088288A）。2018年，帝斯曼發明了一種親本多肽的變體，該專利中的重組酵母在厭氧的條件下能夠將含阿拉伯糖的玉米秸稈、玉米淀粉生產為乙醇。 兩年后，帝斯曼又提出了一種新的用于生產乙醇的方法，通過優化酵母細胞內源基因，在厭氧的條件下將葡萄糖或阿拉伯糖轉化為乙醇，同時增加阿拉伯糖轉換的量和/或速率。

從以上分析可知，帝斯曼從開始利用轉化的酵母宿主細胞單獨發酵木糖或戊糖生產乙醇，逐漸轉向使用重組酵母菌株從糖組合物中發酵生產乙醇，再到無甘油的乙醇發酵生產和由乙酸和甘油生產乙醇，直至由木質纖維素材料制備糖和/或發酵產物的整合方法等，一直致力于生產乙醇的菌株及其在轉化方面的效果的研發。尤其是生物乙醇和纖維素乙醇方面的研發在過去的20年里取得了巨大突破。近幾年，帝斯曼開發了可同時高效利用復合碳源的重組酵母，解決了復合碳源的高效利用以及葡萄糖抑制酵母碳源利用的技術問題；基于自有的核心生物轉化技術（包括酶水解和發酵碳五/碳六先進酵母等），使得纖維素乙醇生產成本持續降低。

2.3 生物油制備相關專利技術分析

微生物油脂（SCO）又被稱為單細胞油脂，是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳源、氮源，輔以無機鹽生產的油脂產品。通過人為地篩選和培育產油微生物，可以得到γ-亞麻酸（GLA）、α-亞麻酸（ALA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等功能性脂肪酸。帝斯曼是全球主要的微生物油脂生產企業之一。

帝斯曼從2008年開始在中國布局生物油及其制備相關專利。CN113846129A首次提出采用包含纖維素作為碳源的原料經異養發酵培養假菌界（Stramenopile）微生物，其中生物油中約11%～99％的不飽和脂肪酸是多不飽和脂肪酸，油脂酵母解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）也適用于該工藝。2011年，帝斯曼布局了3種酵母菌株（CN103210080B、CN107794230B）：ATCC登錄號PTA-11615（菌株28428）、ATCC登錄號PTA-11616（菌株29404）和ATCC登錄號PTA-11617（菌株29794），使用該3種菌株分離的微生物或其混合物在培養基中生長即可產生微生物油。2014年，又布局了3件用于從微生物細胞中獲得微生物油的方法專利（CN105939710B、CN105960235B、CN106061475B），其中微生物細胞不限于酵母細胞，具體獲得微生物油的方法包括裂解細胞以形成裂解細胞組合物然后從裂解細胞組合物中回收油。直至2017年，帝斯曼提出了一種新的從微生物細胞中提取含有PUFA的油的有效方法（CN109477122A），包括在進行破乳之前從細胞發酵液或裂解的細胞組合物中去除水。這種方法具有減少破乳時間和減少鹽的使用的益處，通過該方法可以從微生物細胞中回收包含一種或多種PUFA的微生物油。

帝斯曼有關生物油的生產技術包括利用酵母細胞自身的特性在由蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、油、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、纖維素、木質纖維素及其組合中選擇碳源的存在下進行發酵產生微生物油，以及通過裂解一個或多個微生物細胞獲得生物油。

2.4 二羧酸制備相關專利技術分析

二羧酸，如蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、富馬酸和己二酸是大量化學品的潛在前體，其在藥物、化妝品、食物、飼料或化學工業中有大量應用。

帝斯曼從2008年開始在中國布局生物法制備二羧酸的專利。2008年11月14日，帝斯曼同日提交了4件專利申請（CN104818224A、CN101903522B、CN101896606B、CN101978063B）用于酵母菌表達三羧酸循環關鍵酶來制備二羧酸。2009年，帝斯曼又布局了有關在低pH下發酵生產二羧酸的方法專利（CN102089436A、CN107267562A、CN107267561A），包括在低于有機酸最低pKa的pH值下，在存在含碳水化合物的底物和少量氧時發酵酵母，所述pH下二羧酸中至少有50％以酸性形式存在。2014年，帝斯曼與合作伙伴羅蓋特合作申請了在包含合適發酵培養基的容器中發酵經基因遺傳修飾的細胞制備二羧酸的方法專利（CN112143762A、CN105378093A）。同年，帝斯曼提出了關于延胡索酸還原酶的專利申請（CN105814198A、CN112094826A），這是一種具有延胡索酸還原酶活性的變體多肽，該變體多肽的酵母細胞發酵可以顯著提高二羧酸如琥珀酸的產量。2016和2017年，帝斯曼分別布局了用于二羧酸生產的宿主細胞相關專利： CN108431215A公開的宿主細胞在其基因組中包含至少一種遺傳修飾，該遺傳修飾導致至少一個催化輔因子（NADH、NADPH或FADH2）氧化的酶促步驟的缺陷；CN109689864A公開的宿主細胞包含突變的蘋果酸脫氫酶，其可以提高二羧酸的產量。

可見，帝斯曼一直致力于通過對重組宿主細胞進行遺傳修飾來提高二羧酸產量的研究。

3 總結與展望

綜上所述，帝斯曼在中國專利制度建立之初就開始布局酵母相關專利，且涵蓋的技術領域較廣。該公司圍繞與酵母相關的主要產品如維生素A、生物乙醇、生物油、二羧酸等的生產技術路線布局了多件專利，在生產菌株、產品制備方法方面已經形成了較為完善的專利保護體系，這為國內酵母行業相關企業提供了很好的技術啟示。

近年來，中國酵母行業發展迅速，且有了很多自主研發技術，帝斯曼在中國布局的酵母相關專利，為我國相關企業提供了相關技術創新的方法和新的思路。同時，中國企業應加強海外專利布局，提升國際市場競爭力，提高專利質量的同時均衡專利布局技術領域，充分利用專利信息，通過專利信息預測技術發展趨勢，有效規避專利侵權風險。

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