參苓白術湯中5種成分HPLC含量測定方法研究

摘要：目的 建立參苓白術湯中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和甘草苷、甘草酸銨的含量測定方法。方法 建立高效液相色譜法分別測定參苓白術湯中人參皂苷Rg1、Re、Rb1和甘草苷、甘草酸銨的含量并進行方法學考察。結果 在所建立色譜條件下，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、甘草苷、甘草酸銨分別在29.79～297.85 μg·mL-1，21.76～217.57 μg·mL-1，22.87～228.66 μg·mL-1，9.79～195.80 μg·mL-1，57.85～1156.92 μg·mL-1范圍內均呈現出良好的線性關系，其RSD值均大于0.9990；加樣回收率分別為99.00%、101.56%、99.06%、104.89%和104.00%，RSD分別為2.85%、2.99%、2.31%、1.03%和0.62%。 結論 所建立的高效液相色譜檢測專屬性高，線性關系、精密度、穩定性均良好，可用于參苓白術湯中人參皂苷Rg1、Re和Rb1以及甘草苷、甘草酸銨的含量測定。

關鍵詞：參苓白術；湯劑；高效液相色譜法；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；甘草苷；甘草酸銨

中圖分類號：R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）09-0075-04

參苓白術散源于《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、炒白術、山藥、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、炒桔梗和炙甘草配伍而成，具有益氣健脾、滲濕止瀉之功，是歷代調脾之主方［1］，可用于脾胃虛弱，食少便溏，氣短咳嗽，肢倦乏力的治療。除散劑外，臨床和科研中還常使用參苓白術的湯劑、丸劑、顆粒劑等劑型以適應不同需要。但目前僅可見散劑、丸劑和顆粒劑的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）含量測定方法的文獻報道，未見湯劑的含量測定方法的報道［2-7］。故本研究建立了兩種HPLC檢測方法分別應用于參苓白術湯中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量測定以及甘草苷、甘草酸銨的含量測定，以期為參苓白術湯的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀（美國安捷倫）；Secura2250分析天平（德國賽多利斯）；Cf16RXII離心機（日本日立工機）。

1.2 試劑與藥品 人參皂苷Rg1對照品（批號：PS012772）、人參皂苷Re對照品（批號：PS012036）、人參皂苷Rb1對照品（批號：PS012770）、甘草苷（批號：PS011508）、甘草酸銨（批號：PS011619），均購置于成都普思生物科技股份公司。中藥材（人參，批號：230401；茯苓，批號：230601；炒白術，批號：230301；山藥，批號：230203；炒白扁豆，批號：230302；蓮子，批號：230201；炒意苡仁，批號：230402；砂仁，批號：230506；炒桔梗，批號：230105；炙甘草，批號：230601）購自于云南慧慈藥業有限公司，經鑒定為正品。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6～250 mm，5 μm）；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：20℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序：0～20 min，5% A→19% A；20～30 min，19% A；30～75 min，19% A→20% A；75～85 min，20% A→30% A；85～125 min，30% A→35% A。

2.1.2 甘草苷、甘草酸銨 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6～250 mm，5 μm）；檢測波長：237 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：20℃；進樣量：5 μL；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～6 min，22% A；6～7 min，22% A→33% A；7～31 min，33% A→39% A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 按2020年版中國藥典參苓白術散原處方比例（人參∶茯苓∶炒白術∶山藥∶炒白扁豆∶蓮子∶炒薏苡仁∶砂仁∶炒桔梗∶炙甘草配伍比例為4∶4∶4∶4∶3∶2∶2∶2∶2∶4）稱取藥材。人參加10倍量水浸泡過夜后回流提取1 h，紗布過濾；再加10倍量水提取1 h，紗布過濾。其他藥材混合后亦回流提取兩次，第一次加10倍量水浸泡1 h后回流提取1 h，紗布過濾；第二次加10倍量水回流提取1 h，紗布過濾。所有濾液混合，減壓濃縮至1 g生藥/mL。濃縮液4500 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 人參皂苷Rg1、Re、Rb1混合對照品溶液：精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1 0.5957 mg、Re 0.4351 mg、Rb1 0.4573 mg的混合對照品溶液，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液：精密稱取甘草苷和甘草酸銨對照品適量，加甲醇制成每1 mL含甘草苷0.1958 mg和甘草酸銨1.1569 mg的混合對照品溶液，用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 專屬性考察 取混合對照品溶液、供試品溶液按“2.1”項下的色譜條件進行HPLC檢測，分別記錄各成分的色譜圖，考察分析方法專屬性，檢測結果表明專屬性良好。詳見圖1、圖2。

2.4 線性關系考察 分別精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rb1混合對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mL置于5 mL容量瓶中，甲醇定容。分別精密量取甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液0.1、0.3、0.5、1.0、2.0 mL置于2 mL容量瓶中，甲醇定容。按“2.1”項下色譜條件進行分析。以待測成分濃度（X，μg/mL）為橫坐標，以對應峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程及相關系數（r），結果見表1。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下人參皂苷Rg1、Re、Rb1混合對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果人參皂苷Rg1、Re、Rb1峰面積RSD值分別為0.11%、0.68%和0.72%，表明儀器精密度良好。

精密吸取“2.2.2”項下的甘草苷、甘草酸銨混合對照品溶液5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果甘草苷和甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.97%和0.86%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗（中間精密度試驗） 精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件于0、3、6、12、24、48 h分別進樣測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積，RSD值分別為2.35%、2.71%、1.31%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1.2”項下色譜條件于0、3、6、12、24 h分別進樣測定甘草苷和甘草酸銨的峰面積，RSD值分別為0.44%和0.25%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 按“2.2.1”項平行制備6份供試品溶液，分別進樣10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積，依據“2.4”項中的線性回歸方程計算6份供試品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。結果顯示人參皂苷Rg1、Re、Rb1平均含量分別為117.30 μg /g、80.42 μg /g、144.75 μg /g，RSD值分別為1.70%、0.81%和1.75%，表明該方法的重復性良好。

按“2.2.1”項平行制備6份供試品溶液，分別進樣5 μL，按“2.1.2”項下色譜條件測定甘草苷和甘草酸銨的峰面積，依據“2.4”項中的線性回歸方程計算6份供試品中甘草苷和甘草酸銨含量。結果顯示甘草苷和甘草酸銨平均含量分別為46.94 μg/g、290.44 μg/g，RSD值分別為2.22%和1.16%，表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的參苓白術湯6份，按照1∶1比例加入人參皂苷Rg1、Re和Rb1對照品，按“2.2.1”項制備供試品溶液，并按“2.1.1”項色譜條件進行分析。計算回收率，人參皂苷Rg1、Re和Rb1的平均回收率分別為99.00%（RSD=2.85%），101.56%（RSD=2.99%），99.06%（RSD=2.31%），表明該方法準確性良好。結果見表2。

取已知含量的參苓白術湯6份，按照1∶1比例加入甘草苷、甘草酸銨對照品，按“2.2.1”項制備供試品溶液，并按“2.1.2”色譜條件進行分析。計算回收率，甘草苷和甘草酸銨的平均回收率分別為104.89%（RSD=1.03%），104.00%（RSD=0.62%），表明該方法準確性良好。結果見表2。

2.9 含量測定 按“2.2.1”項制備供試品溶液2份，按“2.1”項色譜條件測定含量。結果見表3。

3 討論

參苓白術散是健脾滲濕經典方劑，除散劑外、還常使用湯劑、丸劑、顆粒劑等劑型以適應不同的臨床和科研需要。目前僅見文獻報道散劑、丸劑和顆粒劑的含量測定方法，未見湯劑含量測定方法的報道［2-7］。故本研究擬開發參苓白術湯的含量測定方法并進行方法學考察。

人參為該方君藥，其中人參皂苷Rg1、Re、Rb1為其主要活性成分，《中華人民共和國藥典》（2020年版）中也將這三個指標作為人參的含量測定指標成分。又通過查閱《中華人民共和國藥典》（2020年版）和文獻［2-9］，選取甘草中的甘草苷與甘草酸銨，與人參皂苷Rg1、Re、Rb1一同作為該方的含量測定指標成分。此外，本研究嘗試在一個色譜條件下同時分析5種成分，但因3種人參皂苷成分和2種甘草成分結構性質的差異，分離度不佳，故開發了2種分析方法分別測定，以得到更好的分離效果。本研究還對色譜柱進行了考察，在同樣色譜條件下Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6250 mm，5 μm，Agilent）色譜柱對上述5種成分的分離效果優于Zorbax SB-C18（4.6250 mm，5 μm，Agilent），故選擇使用前者。

綜上所述，本研究所建立的參苓白術湯中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的HPLC含量測定方法以及甘草苷、甘草酸銨的HPLC含量測定方法專屬性高，線性關系、精密度、準確度、穩定性均良好，可用于參苓白術湯中上述5種成分的含量測定，可為參苓白術湯的質量控制提供參考。

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（收稿日期：2024-03-08）