建立一種適合本實驗室快速檢測產KPC酶肺炎克雷伯菌的方法

【摘要】目的運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF MS）檢測產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP），篩選并驗證其特征峰，建立一種適用于本實驗室快速檢測產KPC酶型CRKP的方法。方法收集臨床耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌39株，運用PCR方法檢測出其中23株產KPC酶，再采用MALDI-TOF MS技術檢測KPC酶陽性CRKP菌株，得到質譜圖后用Flex Analyst軟件分析篩選出其中特征峰，并進行重復性實驗和臨床驗證評估。結果綜合篩選出產KPC酶CRKP最佳特征峰為m/z 6432，特征峰驗證實驗和重復性實驗的特異性和敏感性分別為96.67%和100%。臨床驗證評估特異性和敏感性分別為92.31%和100%。結論利用MALDI-TOF MS技術可檢出產KPC酶CRKP的最佳特征峰為m/z 6432，經實驗證實該特征峰特異性和敏感性高，可為臨床快速診斷和治療產KPC酶CRKP提供理論基礎。

【關鍵詞】基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術；特征峰；肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶

中圖分類號：R446.1文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.08.011

Establishment of a suitable method for rapid detection of KPC

producing Klebsiella pneumoniae in our laboratory

TENG Yuanji， YI Xueli， CHEN Xiaoying， LUO Bin， WANG Chunfang

（Department of Clinical Laboratory， Affiliated Hospital of Youjiang

Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveTo detect Klebsiella pneumoniae carbapenemase （KPC） producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP） by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）， and to screen and verify its characteristic peak， so as to establish a suitable method for rapid detection of KPC-producing CRKP in our laboratory. Methods39 clinical strains of CRKP were collected， and 23 of them were detected to produce KPC by PCR. MALDI-TOF MS technology was used to detect KPC-positive CRKP strains， Flex Analyst software was used to analyze and screen out their characteristic peaks after the mass spectrum was obtained， and then repeatable experiments and clinical verification evaluations were carried out. ResultsThe best characteristic peak of KPC-producing CRKP was m/z 6432. The specificity and sensitivity of the validation experiment and the repeatability experiment of characteristic peak were 96.67% and 100%， respectively. The specificity and sensitivity of clinical validation evaluation were 92.31% and 100%， respectively. ConclusionThe best characteristic peak of KPC-producing CRKP that can be detected by using MALDI-TOF MS technology is m/z 6432. It is proved by experiments that this characteristic peak has high specificity and sensitivity， which can provide a theoretical basis for rapid clinical diagnosis and treatment of KPC-producing CRKP.

【Keywords】matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; characteristic peak; carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP）; Klebsiella pneumoniae carbapenemase （KPC）

近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）在全球范圍內迅速蔓延。由于其高發病率和病死率、有限的治療選擇、長期住院需求以及高昂的治療費用，CRKP對公共健康構成了重大威脅［1］。目前，實驗室檢測產肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase， KPC）型CRKP主要依賴于藥敏實驗的表型篩選、16S rRNA測序、PCR檢測和序列分析等方法。然而，這些方法耗時長、操作復雜且成本高昂［2-3］。因此，探索一種更快速、簡便且準確的檢測產KPC酶CRKP的實驗方法顯得尤為必要。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年來發展起來的一種新型軟電離質譜技術。該技術利用高分辨質譜分析對細菌蛋白組學進行深入解析，適用于病原微生物的鑒定、分類和耐藥機制研究，具有操作簡便、快速、準確、高敏感性和高通量等優點［4］。因此，本研究旨在利用MALDI-TOF MS檢測技術，建立一種適用于本實驗室的快速檢測產KPC酶CRKP的實驗方法，并期望能將此檢測方法推廣開來。

1資料與方法

1.1菌株來源選取本院檢驗科微生物實驗室在2020年4月至2022年8月期間收集的39株CRKP。同時，選取了最近的5株非CRKP菌株（包括ATCC700603）作為陰性對照。

1.2試劑和儀器TE緩沖液由Biosharp生物科技有限公司提供。甲酸和乙腈由賽默飛世爾科技（中國）有限公司供應，而α-氰基-4-羥基-肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid， CHCA）基質則購自法國Bio Mérieux公司。PCR引物和擴增試劑盒的供應商是寶生物工程（大連）有限公司。血平板、中國蘭平板和巧克力平板均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。MALDI-TOF MS和VITEK 2-c8gxcj/KP3bMM/mFwoeGheTAsIqfN4VoMuhbIlrT27M8=ompact系統由法國Bio Mérieux公司提供。電泳儀及全自動凝膠成像系統則購自Biorad（美國）公司。

1.3方法

1.3.1菌株耐藥基因檢測⑴ 菌株預處A/NDl/TAYh8hH5iqhmX+nyYmKqvzcVGItV0hfXOCXiI=理：先將之前收集的CRKP菌株在室溫下復蘇，并轉種至血平板上。隨后在35 ℃條件下孵育16～24小時，選取單個菌落，制備成4麥氏濃度（大約1.2×109 cfu/mL）的菌懸液以備后續使用。⑵ 菌株DNA提取（煮沸法）：取200 μL TE Buffer緩沖液，加入100 μL的菌懸液，充分振蕩混合后，于100 ℃煮沸13分鐘，然后置于4 ℃條件下保存備用。⑶ 利用PCR技術檢測CRKP菌株中的KPC耐藥基因：根據相關文獻設計碳青霉烯酶耐藥基因的引物，其名稱及序列（5'→3'）為：KPC-R： CGCCCAACTCCTTCAGCAACA 和 KPC-F： GCGGAACCATTCGCTAAACTC，預期擴增產物長度為340 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。⑷ PCR反應體系：總體積為25 μL，包括上下游引物各0.5 μL，Premix Taq 12.5 μL，模板（提取的細菌DNA）5 μL，以及ddH2O 6.5 μL。⑷ PCR反應條件：首先在94 ℃下預變性10分鐘，接著進行30個循環，每個循環包括98 ℃下10秒，55 ℃下30秒，以及72 ℃下30秒。⑸ 使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳法（使用1×Tae緩沖液，加入5 μL DNA）檢測PCR擴增產物。若檢測到約340 bp的PCR產物，則表明該分離株為KPC基因陽性。

1.3.2MALDI-TOF MS 質譜檢測菌株預處理（乙醇-甲酸-乙腈提取法）：⑴先將之前收集的CRKP在室溫下復蘇，并轉種至血平板中，隨后在35 ℃下孵育16～24小時以備使用。⑵在0.5 mL離心管中加入15～20 μL無水乙醇，使用1 μL的一次性接種環挑取單個菌落，與無水乙醇充分混合（通過渦旋振蕩5～10秒以重懸菌液）。⑶在菌懸液中加入15～20 μL的70%甲酸，進行15～20秒的渦旋震蕩，接著加入15～20 μL的乙腈，再次進行15～20秒的渦旋震蕩。⑷取1～2 μL的菌懸液涂布于靶板上，待其完全干燥后，加入1 μL的CHCA基質液，自然干燥后進行上機檢測，以觀察并收集特征峰。質譜儀的參數設置為：m/z范圍在2000～20 000之間，激光強度為85%，使用質控菌株ATCC8739大腸埃希菌進行校準。

1.3.3特征峰篩選實驗對10株產KPC酶的CRKP（A組）、5株非產KPC酶的CRKP（B組）以及5株非CRKP（包括ATCC700603）（C組）這三組菌株進行了質譜鑒定分析。首先，對A組菌株進行了歸類比對，并利用Flex Analyst軟件進行分析，同時輔以肉眼觀察，以篩選出最佳的特征峰。其次，從A、B、C三組中各選出鑒定度達到99%的5株菌株（A組2株，B組1株，C組2株，包括ATCC700603）進行進一步的歸類比對，觀察候選特征峰的特異性。最后，確定產KPC酶CRKP的最佳特征峰。

1.3.4特征峰驗證和重復性實驗遵循上述操作指南，使用MALDI-TOF MS技術對10株CRKP進行檢測并獲取相應的質譜圖譜。在此過程中，仔細分析以確定是否存在產KPC酶CRKP的特異性峰。選取那些展現出產KPC酶CRKP特異性峰的菌株，采用乙醇-甲酸-乙腈提取法對這些菌株的單個菌落進行裂解處理。隨后，取1 μL的裂解液均勻涂抹于靶板上，并對每個菌株進行三次重復實驗，分別涂抹于三個不同的孔位。通過分析特征峰的峰值，評估其重復性并計算重復率。

1.3.5臨床驗證評估選取日常臨床工作中用MALDI-TOF MS檢出的肺炎克雷伯菌（含CRKP）共53株，分析觀察其檢測圖譜中是否存在產KPC酶CRKP最佳特征峰，并對所有菌株進行相關耐藥基因檢測（步驟同1.3.1），最后計算特征峰的特異性和敏感性。

2結果

2.1菌株耐藥基因檢測結果提取39株CRKP的DNA后，進行PCR擴增及0.01 agarose電泳分析（圖1），在340 bp處出現一條均一條帶，結果符合產KPC酶基因條帶大小，因此最終確定有23株CRKP產KPC酶。

2.2MALDI-TOF MS 質譜檢測特征峰的篩選將A組質譜峰值進行歸類比對，用Flex Analyst軟件及肉眼觀察分析篩選得出m/z 6432為最佳特征峰（圖2a）。從A、B、C三組中各挑選出鑒定度99%的5例菌株（A組2株，B組1株，C組2株，含ATCC700603 KPN）進行歸類比對，發現 m/z 6432為產KPC酶CRKP特征峰（圖2b）。

2.3特征峰驗證和重復實驗選取10株確定產KPC酶CRKP進行驗證和重復性實驗，肉眼觀察到10株CRKP均存在m/z 6432特征峰，敏感性為100%（10/10）。每株CRPK重復3次鑒定，肉眼觀察到有29個m/z 6432特征峰，特異性96.67%（29/30）。

2.4臨床驗證評估收集2021年1月—2021年8月肺炎克雷伯菌（含CRKP）53株，用MALDI-TOF MS鑒定并分析圖譜結果，同時進行PCR測序分析，其中產KPC酶CRKP 12株，非該型別CRKP 4株，其余非CRKP 37株。肉眼觀察MALDI-TOF MS鑒定圖譜是否存在m/z 6432特征峰，結果顯示其特異性92.31%（12/13），敏感性為100%（12/12）。見表1。

3討論

產KPC酶的CRKP是一種具有極高危險性的革蘭陰性腸桿菌科細菌，其耐藥性極強［5］。常規抗生素對CRKP的療效不佳，導致患者治療選擇受限，住院時間延長，治療成本增加，以及病死率上升，這給公共衛生帶來了嚴峻挑戰［6］。因此，在臨床微生物學中，快速檢測產KPC酶菌株顯得至關重要。MALDI-TOF MS作為一種迅速發展的技術，在臨床、科研和工業領域已得到廣泛應用［7］。

在本項研究中，我們運用乙醇-甲酸-乙腈提取法對菌株蛋白質進行分離，并通過MALDI-TOF MS技術獲取了敏感株和CRKP的質譜圖。經過分析，我們注意到僅在產KPC酶的肺炎克雷伯菌中出現了m/z 6432的特征峰。對碳青霉烯類敏感的肺炎克雷伯菌進行圖譜分析時，并未發現相同的m/z 6432特征峰。后續的重復性試驗和臨床驗證進一步確認了CRKP中存在m/z 6432特征峰。因此，在臨床實踐中，我們可以通過檢測單株肺炎克雷伯菌的質譜圖中是否存在m/z 6432特征峰來快速識別產KPC酶的菌株。這一方法顯著縮短了CRKP的檢測時間，為臨床早期預防和治療CRKP提供了重要依據。MALDI-TOF MS技術自引入臨床檢驗實驗室以來尚不足15年，但其優勢已日益顯現，國內外對該技術的研究也在持續深入［8］。例如，國內學者余佳佳等［9］的研究報告指出，利用MALDI-TOF MS技術檢測ST11型產KPC-2肺炎克雷伯菌時，發現了m/z 4521的特征峰。GAIBANI等［10-11］的研究發現，在產KPC酶型肺炎克雷伯菌株中檢測到了m/z 11109特征峰，進一步分析顯示，該特征峰對應P019蛋白基因，該基因通常與轉座子Tn4401a亞型相關，并廣泛存在于產KPC酶型的肺炎克雷伯菌中。然而，攜帶P019基因的肺炎克雷伯菌主要流行于日本地區，在其他國家較為罕見，因此在本次實驗中，我們未在待測菌株中檢測到m/z 11109特征峰。由于菌株遺傳背景的差異性以及流行地區地域環境的影響［12］，不同實驗室檢測到的同種細菌特征峰可能存在差異。因此，確定適合本實驗條件下的特征峰是本研究的關鍵所在。

MALDI-TOF MS技術不僅廣泛應用于臨床中對常見革蘭陰性桿菌（例如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等）的耐藥基因檢測，還適用于對常見革蘭陽性球菌、厭氧菌、罕見菌以及疑難菌的耐藥基因檢測［8］。例如，EDWARDS-JONES等人首次報道了利用MALDI-TOF MS技術成功檢測出MSSA和MRSA的特征峰，而GRIFFIN等人則報道了該技術能夠檢測出攜帶vanB基因的萬古霉素耐藥屎腸球菌（VRE）［13-14］。此外，NAGY等人［15］利用MALDI-TOF MS技術識別出cfiA基因，這是編碼第二類脆弱擬桿菌碳青霉烯酶的特異性基因。該方法能夠迅速檢測并區分脆弱擬桿菌與脆弱芽孢桿菌，極大地便利了臨床對罕見及疑難菌種的檢測。

綜合以上分析，本研究采用MALDI-TOF MS技術篩選出適用于本實驗室的產KPC酶CRKP的特征峰m/z 6432，并通過多種方法驗證了其可靠性，確認了該特征峰具有顯著的臨床應用潛力。同時，我們期望這一方法能夠促進其在各實驗室的廣泛應用。然而，本研究也存在一些局限性，例如未對本次CRKP進行KPC酶亞型分析，未進行CRKP同源性分析，以及收集的樣本數量有限等。基于本研究的成果，我們將進一步運用MALDI-TOF MS技術，深入且多維度地開展探索性研究，旨在為臨床常見型別肺炎克雷伯菌的早期診斷、治療和流行病學研究提供堅實的理論支持。參考文獻［1］ KARAISKOS I， GALANI I， PAPOUTSAKI V， et al. Carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae： implication on future therapeutic strategies［J］. Expert Rev Anti Infect Ther， 2022，20（1）：53-69.

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（收稿日期：2023-12-22修回日期：2024-04-25）

（編輯：梁明佩）