HPLC-MS法同時檢測魚肉中32種獸藥殘留

摘 要：用PLS-A固相萃取小柱處理魚肉樣品，采用高效液相色譜-串聯質譜法對魚肉中的32種獸藥殘留進行測定。實驗優化了樣品提取方法、色譜條件，并研究了方法的線性范圍、準確度、精密度以及基質效應。結果表明，32種獸藥的回收率在75.3%～114.7%，檢出限為1.0 μg·kg-1，相對標準偏差均小于15%（n=6），32種獸殘在1～100 ng·mL-1線性關系良好，相關系數均高于0.991。該方法準確度高、精密度好，可為魚肉中32種獸藥殘留的檢測提供技術支撐。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS）；獸藥殘留；PLS-A；魚肉

Simultaneous Determination of 32 Veterinary Drugs in Fish by High performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Yanlong， HUANG Leipeng， HAN Xuegong， WANG Zhaoquan

（Changyi Center for Inspection and Testing， Changyi 261300， China）

Abstract： In this experiment， a PLS-A solid-phase extraction column was used to treat fish meat samples， and high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to determine the residues of 32 veterinary drugs in fish meat. The experiment optimized the sample extraction method and chromatographic conditions， and studied the linear range， accuracy， precision， and matrix effects of the method. The results showed that the recovery rates of 32 veterinary drugs ranged from 75.3% to 114.7%， with a detection limit of 1.0 μ g·kg-1 and a relative standard deviation of less than 15% （n=6）， there was a good linear relationship between the 32 animal residues in the range of 1～100 ng·mL-1， with correlation coefficients higher than 0.991. This method has high accuracy and good precision， and can provide technical support for the detection of 32 veterinary drug residues in fish meat.

Keywords： high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS）; veterinary drug residues; PLS-A; fish

我國在畜牧養殖領域使用較多的獸藥主要有磺胺類、五氯酚酸鈉、孔雀石綠類、β受體激動劑類、四環素類、氯霉素類和喹諾酮類等化合物[1]。而藥物濫用是造成畜牧產品污染的主要原因之一。藥物殘留通過代謝途徑進入動物肌肉等組織中，最終通過食品鏈進入人體，這不僅會引發過敏反應，還可能增加人體對藥物產生抗藥性的風險。目前，獸藥殘留的檢測方法通常基于獸藥種類進行分類，這造成了檢測方法的多樣性和前處理方法的不統一[2]。大多數檢測方法的前處理過程煩瑣，且回收率較低，此外，開發能同時檢測多種獸藥殘留的液相色譜-質譜法面臨一定的挑戰[3]。鑒于實驗室人員有限、樣品種類多、檢測項目復雜以及檢測工作量大等現狀，在本方法中，樣品處理采用迪馬科技PLS-A固相萃取小柱，無須進行活化和平衡步驟，且提取液直接通過小柱，能夠有效去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質干擾物。該方法簡便、快速，能同時檢測國家食品安全監督抽檢實施細則中規定的32種獸藥殘留，其不僅縮短了檢測周期，還在降低檢測成本的同時大幅提升了檢測效率[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）；甲酸（色譜純）；屈臣氏專業蒸餾水；90%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；10%乙腈水溶液；32種獸藥標準品（濃度為100 μg·mL-1）。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Ultra液相色譜質譜聯用儀；C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；GTCS-2013B垂直振蕩器；KQ-700DE型數控超聲波清洗器；TGL-20M低溫離心機；EA32型多功能樣品濃縮儀。

1.3 標準溶液配制

標準品溶液（100 μg·mL-1）。混合標準品工作液（1.0 μg·mL-1）：取各標準品儲備溶液50 μL于5 mL容量瓶，用乙腈定容至5 mL。混合標準品工作液（0.1 μg·mL-1）：取500 μL混合標準品工作液于5 mL容量瓶，用乙腈定容至5 mL。

1.4 基質匹配標準曲線的制備

精密量取0.1 μg·mL-1混合標準工作液10 μL和30 μL，以及1.0 μg·mL-1混合標準工作液10 μL、20 μL、50 μL和100 μL，分別加入6份經提取和凈化的樣品空白中，50 ℃水浴氮氣吹干，加10%乙腈水溶解殘余物并定容至1 mL，配制成濃度為1 ng·mL-1、3 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的基質匹配系列混合標準溶液，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.5 樣品處理

取2.50 g（精確到0.01 g）樣品，加入10 mL 90%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）提取，振蕩5 min，超聲5 min，5 000 r·min-1離心5 min，取出上清液加入PLS-A柱中，接收4 mL流出液；將流出液在50 ℃水浴條件下氮吹至0.5 mL左右，用10%乙腈水溶液定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后，待測。

1.6 儀器條件

1.6.1 正離子模式

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A相為乙腈，C相為添加0.1%甲酸的水溶液；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫見表1。

（2）質譜條件。離子模式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監測模式；電噴霧電壓：3 500 V；霧化器壓力：40 arb；輔助氣壓力：10 arb；氣簾氣壓力：0 arb；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。

1.6.2 負離子模式

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A相乙腈，C相水；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫見表1。

（2）質譜條件。離子模式：電噴霧離子源；掃描方式：負離子模式；檢測方式：多反應監測模式；電噴霧電壓：-2 800 V；霧化器壓力：40 arb；輔助氣壓力：10 arb；氣簾氣壓力：0 arb；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。32種獸藥的質譜參數表見表2。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

分別采用乙腈、乙酸乙酯和90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液進行樣品提取。由表3可知，與乙酸乙酯相比，乙腈的提取效率較高、成本更低，且用含水的乙腈提取液可明顯提升喹諾酮類、四環素類獸藥的提取效率；當使用90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作為提取溶劑時，32種獸藥及其代謝物的回收率均可維持在75.3%～114.7%。因此，選擇90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作為本實驗提取液。

2.2 流動相的確定

本實驗在正離子模式下選擇乙腈∶水、甲醇∶水和乙腈∶0.1%甲酸水作為流動相。有機相為乙腈時，各物質均能實現較好分離且柱壓較低；水相為0.1%甲酸水時，可改善各物質峰型提高響應值。因此，選擇乙腈∶0.1%甲酸水作為流動相。

2.3 方法檢出定量限、回收率、精密度

在優化條件下，將1.4的系列混合標準溶液上機測定，以特征離子峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線。分別以3倍信噪比和10倍信噪比時的質量濃度來定義方法檢出限和方法定量限。由表4可知，32種獸藥化合物在1～100 ng·mL-1范圍內線性關系良好，相關系數r均在0.991以上；

32種獸藥化合物的方法檢出限為1.0 μg·kg-1，定量限為3 μg·kg-1，符合獸藥殘留檢測標準。

對樣品進行加標（加標水平為1 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-1）回收實驗。由表4可知，回收率（采用基質匹配標準溶液定容）為75.3%～114.7%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.4%～11.9%。結果表明此方法精密度和準確度均符合獸藥殘留檢測標準。

2.4 基質效應

在液相色譜-質譜聯用中，基質效應是決定檢測結果是否準確的影響因素之一，較強的基質效應對結果可產生較大的影響[5]。基質效應為基質標與溶劑標的比值，由表5可知，諾氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、四環素和土霉素5種化合物存在離子增強作用，其他27種化合物均存在離子抑制作用。

3 結論

本研究開發的方法通過合并和簡化前處理步驟，避免了對固相萃取柱的活化過程，實現了對多種獸藥殘留的同時檢測。這種方法不僅縮短了前處理時間，還降低了檢測成本。它能夠在確保準確性的同時提高檢測速度，簡化操作過程。此外，該方法還滿足了同時處理多批次、多獸殘樣品的需求，符合現代食品安全檢測的高效率和高準確性要求。

參考文獻

[1]劉培勇，張惠，米之金，等.兩步液液萃取-固相萃取凈化結合高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中11種磺胺類獸藥殘留[J].色譜，2019，37（10）：1098-1104.

[2]王一涵，王展華，陳萬勤，等.固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定豬肉中14種大環內酯類獸藥殘留[J].分析測試學報，2019，38（10）：1247-1253.

[3]李華，楊娟，陳黎.超高液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中8種喹諾酮類獸藥殘留的不確定度評定[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（8）：3237-3243.

[4]方從容，高潔，王雨昕，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中125種獸藥殘留[J].色譜，2018，36（11）：1119-1131.

[5]ORTELLI D，COGNARD E，JAN P，et al.Comprchensive fast multiresidue screening of 150 veterinary drugs in milk by ultra-performance liquid chromatogapby coupled to time of flight mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2009，877（23）：2363-2374.