液相色譜-串聯質譜法前處理技術在食品中硝基咪唑類藥物檢測中的應用進展

摘 要：硝基咪唑類藥物具有抗菌和抗原蟲作用，但由于存在致突變和潛在致癌性，部分藥物種類在動物源食品中被禁止使用。在近幾年的監測檢驗中，硝基咪唑類藥物殘留超標現象時有發生，因此開發快速、高效、準確的硝基咪唑類藥物殘留檢測方法，對于實現對硝基咪唑類藥物的高效監管，進而有效確保食品安全具有重要意義。本文對食品中硝基咪唑類藥物的液相色譜-串聯質譜檢測方法中涉及的前處理技術進行了綜述，分析了各種前處理方法的特點和優勢，并對其發展方向進行展望。

關鍵詞：食品；硝基咪唑類藥物；液相色譜-串聯質譜法；前處理技術

Progress in the Application of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Pretreatment Technology in the Detection of Nitroimidazoles in Food

WU Qiongjing1， CHEN Cheng2， LI Hongbo3*

（1.Guangxi Zhuang Autonomous Region Analysis and Testing Research Center， Nanning 530022， China;

2.Guangxi Traditional Chinese Medicine School， Nanning 530022， China;

3.Zhumadian Product Quality Inspection and Testing Center， Zhumadian 463000， China）

Abstract： Nitroimidazoles have antimicrobial and antiprotozoal effects， but due to the presence of mutagenicity and potential carcinogenicity， some drug species are banned in foods of animal origin. In recent years， in the monitoring and inspection， the phenomenon of excessive nitroimidazole drug residues has occurred from time to time， so the development of rapid， efficient and accurate nitroimidazole drug residue detection methods is of great significance to achieve efficient supervision of nitroimidazole drugs， and then effectively ensure food safety. In this paper， the pretreatment techniques involved in the liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS） detection methods of nitroimidazoles in food are reviewed， the characteristics and advantages of various pretreatment methods are analyzed， and their development directions are prospected.

Keywords： food; nitroimidazoles; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; pretreatment technology

硝基咪唑類藥物（Nitroimidazoles，NDZs）種類較多，主要包括替硝唑（Tinidazole，TNZ）、甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、洛硝噠唑（Ronidazole，RNZ）、地美硝唑（Dimetridazole，DMZ）、異丙硝唑（Ipronidazole，IPZ）以及奧硝唑（Ornidazole，ONZ）等。因其具有抗原蟲活性、抗菌和抗病毒作用，常作為獸藥用于預防和治療畜禽動物滴蟲病和厭氧菌感染等疾病[1]。人體長期攝入硝基咪唑類藥物殘留超標的動物源性食品，可能會對身體健康造成損害，甚至引起癌變[2]。

我國農業農村部等相關部門已明確規定不得在動物源性食品中檢出硝基咪唑類藥物。《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[3]指出，甲硝唑和地美硝唑作為獸藥，允許治療使用，但應嚴格遵循休藥期規定。《中華人民共和國農業農村部公告 第250號》明確禁止在食品動物中使用洛硝達唑、替硝唑。同時農業農村部有關行業標準規定硝基咪唑類藥物在蜂蜜、蜂王漿及蜂王漿凍干粉等蜂產品中也不得檢出[4]。

目前，常用的硝基咪唑類藥物的儀器檢測方法是液質聯用法[5-7]。《中華人民共和國農業農村部公告 第594號》發布的多項標準中，硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法被明確為液質聯用法[8]，具體包括動物性食品中甲硝唑、羥基甲硝唑、地美硝唑和羥基地美硝唑殘留量檢測的制樣方法以及液相色譜-串聯質譜測定方法。

近年來，硝基咪唑類藥物殘留超標現象時有發生，如在農業農村部畜禽及蜂產品獸藥殘留監測結果通報中，2019年超標2批次、2020年超標1批次。為實現對硝基咪唑類藥物殘留的高效監管，本文以動物性食物中硝基咪唑類藥物的檢測前處理技術為核心，通過對硝基咪唑類藥物的國家標準檢測方法和國內外文獻報道檢測方法中涉及的樣品前處理技術進行整理和分析，總結出各類前處理技術的優劣勢，并對其發展方向進行展望。

1 固相萃取技術

20世紀70年代，固相萃取技術（Solid-Phase Extraction，SPE）被引入分析測試領域。與傳統的溶劑萃取技術相比，固相萃取技術可對樣品進行富集，具有回收率和富集倍數高、有機溶劑用量少，以及能處理微量樣品，易于實現自動化和無相分離操作等優點[9]。SPE操作步驟包括SPE柱活化、上樣、淋洗以及洗脫等。當樣品通過SPE柱時，目標化合物被固定相吸附，而雜質和其他干擾組分隨樣品溶液和淋洗液流出柱體，然后用對固定相有改性作用的溶劑進行洗脫，從而達到純化和富集的目的。適合硝基咪唑類藥物的固相吸附劑包括分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymer，MIP）、金屬有機框架（Metal Organic Framework，MOF）和其他吸附劑等。《食品安全國家標準 動物性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》

（GB 31658.23—2022）[8]中對殘留的硝基咪唑類藥物的前處理方法是乙酸乙酯提取，正己烷液液萃取除脂，固相萃取柱凈化。張遠等[10]在測定雞肉和雞蛋樣品中硝基咪唑類藥物過程中，采用MCX固相萃取小柱進行樣品凈化。歐陽小艷等[1]建立一種固相萃取結合高效液相色譜-串聯質譜法快速測定禽蛋中甲硝唑、洛硝噠唑、替硝唑、奧硝唑和二甲硝唑殘留的分析方法。禽蛋樣品經5%三氯乙酸溶液渦旋提取，MCX固相萃取小柱凈化。邱肖依等[6]以雞蛋中的25種咪唑類獸藥及其代謝物為研究對象，將雞蛋液經乙腈提取并濃縮后，采用HLB固相萃取柱凈化。林浩等[11]在國標方法的基礎上，采用混合陽離子交換柱凈化提取液，取得了較好的提取效果。王圓圓等[12]進行了鴨蛋樣品制備，并將樣品于超聲波條件下使用檸檬酸緩沖液和乙腈提取，減壓濃縮后，MCX固相萃取柱凈化。在同時測定豆芽、豆干、火鍋底料中喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類和四環素類42種抗生素藥物的研究中，蘇燕等[13]采用空白基質加標回收方式對比了HLB、MCX、PRiME HLB 3種不同填料的固相萃取小柱的凈化效果，結果表明，PRiME HLB小柱凈化效果最好。

綜上，SPE固相萃取技術在硝基咪唑的檢測中應用廣泛。固相萃取技術在凈化環節使用的有機溶劑相對較少、凈化效果好、基質效應不強以及定量準確，但在具體操作過程中，步驟較多，一般包括上樣、淋洗、洗脫，必要時還需要進行氮吹、復溶解等，因此在大批量樣品篩查檢驗中的使用受限。

2 磁性固相萃取技術

磁性固相萃取技術（Magnetic-Solid Phase Extraction，MSPE）是在SPE技術上經過創新改進而形成的一種新型樣品前處理技術。MSPE技術的主要原理是將磁性吸附劑加入樣品提取液中，對目標化合物進行充分吸附后，采用外部磁場將其迅速與樣品基質分離。YU等[14]合成了磁性氧化石墨烯納米復合材料，并將其作為吸附劑應用于MSPE。隨后采用MSPE-超高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蜜中硝基咪唑類藥物殘留，檢出限為0.003～0.080 μg·kg-1，定量限為0.009～0.300 μg·kg-1。WANG等[15]合成了高效吸附劑磁性三維棘皮球狀石墨化碳，其可從食物樣品中萃取3種硝基咪唑類藥物（甲硝唑、奧硝唑和替硝唑），然后用高效液相紫外檢測法進行定量測定。結果表明，該方法線性范圍較寬，檢出限低。XU等[16]采用簡易的一步法制備了一種由聯苯二甲酸鋯金屬有機骨架、氧化石墨和氧化鐵組成的新型復合材料，并將其用作磁性固相萃取吸附劑，用于蜂蜜中硝基咪唑和苯并咪唑的同時測定。結果發現，目標物的回收率在70.5%～103.4%，相對標準偏差低于12.9%（n=3），定量限為0.2～0.6 μg·kg-1。王釬釬[9]以咔唑為單體，制備了納米多孔有機聚合物（NOPs），并將磁性材料引入NOPs中，獲得磁性NOPs（M-NOPs），并以此為吸附劑建立了從牛奶樣品中同時萃取4種硝基咪唑類藥物的前處理方法。采用高效液相色譜儀對其進行測試，得出的檢測限在0.8～1.0 ng·mL-1，遠遠低于歐洲共同體參考局（European Community Bureau of Reference，BCR）提供的建議濃度（3.0 μg·L-1）。

綜上，MSPE是一種新型前處理技術，與SPE前處理技術相比，簡化了操作步驟、省時快速、無須離心過濾，同時減少了常規SPE裝柱和樣品上樣的操作，在食品樣品藥物殘留檢測中有廣闊的應用前景。

3 分子印跡技術

分子印跡技術（Molecular Imprinting Technology，MIT）指利用人工合成的交聯狀態的分子印跡聚合物（Molecular Imprinting Polymers，MIPs）模擬生物體中的抗原抗體相互作用，對目標物即模板分子進行特異性選擇識別的技術[17]。目前，該技術已在食品科學、材料化學、物理化學以及醫學等領域廣泛應用。GUO等[18]開發了一種固相萃取結合分子印跡技術的新型樣品凈化程序，用于從蜂蜜樣品中同時提取7種硝基咪唑藥物，并采用高效液相色譜串聯質譜（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）結合分子印跡固相萃取法同時測定蜂蜜中7種硝基咪唑類化合物。結果表明，在1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1加標水平下，目標物質的回收率在79.7%～110.0%，重復性相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）≤11.4%，日間精密度RSD≤15.2%。BUSTAMANTE-RANGEL等[19]應用分子印跡技術同時提取動物源樣品中硝基咪唑類和苯并咪唑類化合物。王旭峰等[20]采用分子印跡固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法測定水產品中15種硝基咪唑類藥物及其代謝物。樣品經乙酸乙酯提取，采用分子印跡固相萃取技術進行富集凈化，Kinetex C18色譜柱分離。該方法的檢出限和定量限分別為0.1～0.3 μg·kg-1和0.3～0.8 μg·kg-1，陰性樣品中平均加標回收率為83.6%～118%，相對標準偏差為2.7%～10.0%。

綜上，分子印跡技術能夠高效地選擇目標化合物進行富集，純化效果好、準確度高、成本較低，但存在用于印跡的分子種類不足、聚合物粒徑偏大、目標化合物不容易洗脫等問題。

4 QuEChERS技術

QuEChERS技術是2003年美國農業部的首席科學家Lehotay及德國的Anastassiades教授提出[21]。該技術的主要原理是制備好的樣品經有機溶劑提取后，用無機鹽類成分除水，然后用N-丙基乙二胺（Primary Secondary Amine，PSA）等吸附劑去除雜質，最終獲得上清液用于檢測分析。QuEChERS前處理技術發展迅速，已從水果和蔬菜中農藥殘留測定過程中的前處理發展到多種基質樣品中數百種農藥、獸藥和違禁添加物質殘留的分析[22]。倪楊等[23]采用QuEChERS技術同時測定蜂蜜中氯霉素、硝基咪唑類及其代謝物。實驗過程中，將蜂蜜樣品與超純水等比例混合，用乙腈溶液超聲提取，氯化鈉鹽析，上清液經C18和PSA吸附劑凈化處理，提取效果較好。王華等[24]采用QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜（Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）技術測定蜂蜜中4種硝基咪唑藥物殘留。YANG等[25]采用改進的QuEChERS法結合UPLC-MS/MS快速測定蜂蜜中多種抗生素殘留。BARBOSA-MEDINA等[26]采用QuEChERS技術結合UPLC-MS/MS測定非洲蜂蜜中新煙堿類化合物。解迎雙等[27]在豬肉中甲硝唑和恩諾沙星測定過程中，采用Sin-QuEChERS技術進行樣品前處理。姚璇等[28]采用QuEChERS結合UPLC-MS/MS法測定畜禽肉中的硝基咪唑類藥物。該方法可用于雞肉、牛肉、豬肉和羊肉中多種硝基咪唑類化合物的高通量定性篩查和定量分析。

在獸藥檢測領域中，尤其是硝基咪唑類藥物的前處理過程中，QuEChERS技術具備操作簡單、成本低、適用范圍廣等優點，但同時也存在凈化效率不高、基質效應明顯等問題[29-31]。

5 結語

食品樣品的基質較為復雜多樣，前處理技術的應用是樣品快速、準確定量的基礎和前提。近幾年，國家有關部門針對硝基咪唑類藥物殘留的檢測頒布了一系列標準規范，同時隨著研發人員在不同基質食品中的探索，硝基咪唑類藥物殘留檢測過程中的前處理方法得到了進一步發展。未來，相關人員還應繼續加大對在線前處理檢測技術、探針式定量技術、多種前處理技術一步式聯合應用等的研究力度，以確保測定結果的準確性，進而為消費者“舌尖上的安全”保駕護航。

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