采用高效液相色譜法同時(shí)測定醋延胡索中延胡索乙素和延胡索甲素的含量

【摘要】目的：開發(fā)一種高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定醋延胡索中延胡索乙素和延胡索甲素的含量。方法：采用HPLC法，色譜柱選用Kromasil 100-5-C18柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.0）（55∶45），流速：1.0 mL·min-1，波長：280 nm下檢測，柱溫：30℃。結(jié)果：在該色譜條件下，兩個對照品均達(dá)到基線分離，線性關(guān)系良好（r>0.9995，n=5）；平均加樣回收率為96.90%～ 100.05%，RSD為0.7%～1.9%。結(jié)論：該檢測方法簡便、靈敏、穩(wěn)定、可靠，可作為醋延胡索的質(zhì)量控制方法之一。

【關(guān)鍵詞】醋延胡索；高效液相色譜；延胡索乙素；延胡索甲素

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.05.012

【基金項(xiàng)目】浙江省藥品監(jiān)管系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022021）。

Simultaneous Determination of Tetrahydropalmatine and Corydaline in Vinegar-steamed Corydalis Rhizoma by HPLC

WANG Weiqian1， LYU Linfeng2， JIANG Yonghai1， XIE Zheyu1， ZHONG Ningyuan1*

（1.Shaoxing Institute for Food and Drug Control， Shaoxing 312071， China； 2.Shaoxing Zhenyuan Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces Co.， Ltd.， Shaoxing 312000， China）

Abstract： Objective： To develop a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of tetrahydropalmatine and tetrahydropalmatine in vinegar yanhusuo. Method： HPLC was used， with Kromasil 100-5-C18 column as the chromatographic column. The mobile phase was methanol 0.1% phosphoric acid solution （adjusted to pH 6.0 with triethylamine） （55： 45）， with a flow rate of 1.0 mL·min-1and detection at a wavelength of 280 nm. The column temperature was 30℃. Result： Under the chromatographic conditions， both control samples achieved baseline separation with a good linear relationship （r>0.9995， n=5）； the average recovery rate was 96.90%～100.05%， and the RSD was 0.7%～1.9%. Conclusion： This detection method is simple， sensitive， stable， and reliable， and can be used as one of the quality control methods for vinegar yanhusuo.

Keywords： vinegar corydalis yanhusuo； HPLC； yanhusuo yi su； yanhusuo jia su

醋延胡索是罌粟科紫堇屬植物延胡索的干燥塊莖，經(jīng)切片、加醋炒制后烘干而成的中藥[1-2]。成品為不規(guī)則的圓形厚片，微具醋香氣。醋延胡索的延胡索乙素含量測定已列入《中華人民共和國藥典》2020年版第一部中，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控指標(biāo)較為單一，需要建立較為高效、準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)[3]。

延胡索中的延胡索甲素、延胡索乙素均屬于在生源途徑中為單一來源的異喹啉類生物堿，可能是其他幾種基核結(jié)構(gòu)類型生物堿的前體物質(zhì)[4]。從成分占有量來看，延胡索甲素、延胡索乙素占比較高，是延胡索的主要成分[5]。綜合上述分析，將延胡索的質(zhì)量指標(biāo)定為延胡索乙素和延胡索甲素。本研究依據(jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，為了給醋延胡索的質(zhì)量指標(biāo)提供檢驗(yàn)依據(jù)，建立同時(shí)測定醋延胡索中延胡索乙素及延胡索甲素含量的高效液相色譜法。

1儀器與試藥

1.1儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司），F(xiàn)ESCO17微量離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司），XS206十萬分之一電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；MILLI-Q ADVANTAGEA10超純水儀（MILLIPORE）。

1.2試藥

10批醋延胡索飲片（S1～S10）；延胡索乙素（中檢院，110726-202020，含量99.3%），延胡索甲素（安譜，批號2251578，含量99.2%）；色譜純甲醇，分析純的甲酸等試劑，水為超純水。

1.3中藥材的鑒定

樣品采自浙江磐安、新昌、諸暨，按《中華人民共和國藥典》2020年版第一部，由紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院呂林鋒副主任中藥師進(jìn)行性狀檢測，鑒定均為正品延胡索。具體信息見表1。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備

精密稱取延胡索乙素和延胡索甲素對照品各10 mg，以甲醇為溶劑稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為46μg/mL、50μg/mL的混合對照溶液。

2.2供試品溶液的制備

精密稱取醋延胡索粉末（過三號篩）0.5 g，置于燒瓶中，精密吸取50 mL濃氨試液-甲醇（1∶20）混合溶液，先稱定重量，經(jīng)過1 h浸漬后再加熱回流1 h，冷卻后再稱重，用濃氨試液-甲醇（1∶20）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加入甲醇溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件

色譜柱型號：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（以三乙胺調(diào)pH值至6.0）（55∶45）；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm。以延胡索乙素峰計(jì)，理論板數(shù)不低于3000。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取延胡索乙素、延胡索甲素混合對照溶液與醋延胡索供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得，見圖1。

2.4.2線性范圍考察

用甲醇溶解稀釋精密稱取的延胡索乙素和延胡索甲素對照品，置于10 mL容量瓶中，搖勻，得對照品儲備液，精密量取對照品儲備液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.0092、0.0231、0.0461、0.0923、0.1846 mg/mL的延胡索乙素對照品溶液和質(zhì)量濃度為0.0108、0.0271、0.0542、0.1083、0.2166 mg/mL的延胡索甲素對照品溶液，注入液相色譜儀，測定含量。以濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，延胡索乙素：Y=8.6228X-5.7925（r=0.9998），延胡索甲素：Y=7.2178X+10.655（r=0.9995），兩個對照品線性關(guān)系良好，符合含量測定要求。

2.4.3精密度試驗(yàn)

精密吸取延胡索乙素和延胡索甲素混合對照溶液10μL注入液相色譜儀內(nèi)，測定平行6次的峰面積，RSD為0.8%（延胡索乙素）、1.0%（延胡索甲素）。結(jié)果符合規(guī)定，表明儀器具有良好的精密度。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品0.5 g，依照“2.2”項(xiàng)下方法制備，測定平行6次的含量，計(jì)算數(shù)據(jù)。延胡索乙素的含量為0.071%，RSD為1.5%；延胡索甲素的含量為0.078%，RSD為1.6%。結(jié)果符合規(guī)定，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品0.5 g，依照“2.2”項(xiàng)下方法制備，在0、4、8、12、24 h分別測定含量。延胡索乙素的RSD為1.7%、延胡索甲素的RSD為1.0%。結(jié)果符合規(guī)定，表明24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.25 g的已知含量樣品6份，加入相匹配的對照品，依照“2.2”項(xiàng)下方法制備，同“2.3”項(xiàng)下色譜條件一致，依據(jù)峰面積并計(jì)算加樣回收率，見表2。

2.4.7樣品含量測定

參考《中華人民共和國藥典》2020年版第一部“醋延胡索含量”項(xiàng)測定10批樣品，設(shè)定按干燥品計(jì)算，延胡索乙素（C21H25NO4）不少于0.040%，延胡索甲素（C22H27NO4）不少于0.030%，見表3。

3結(jié)果

3.1指標(biāo)成分的選擇

醋延胡索是延胡索藥材經(jīng)切片后加醋炒制，再烘干而得。參照《中華人民共和國藥典》2020年版第一部，僅以延胡索乙素單一成分作為質(zhì)控指標(biāo)，不能對藥材的整體質(zhì)量進(jìn)行綜合評定。劉昌孝院士提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Marker）概念[6]。延胡索中的主要成分是原小檗堿型生物堿[7]，具有活血、行氣、止痛的作用。延胡索甲素和延胡索乙素是其代表成分，從而推斷它有可能是另一種具有代表性生物活性的單體，因?yàn)檠雍骷姿鼐哂蓄愃朴谘雍饕宜氐幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)。本研究選擇了比現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)更全面地反映醋延胡索內(nèi)在質(zhì)量的延胡索甲素作為新含量指標(biāo)，并建立了對其質(zhì)量控制有利的 HPLC含量測定法。

3.2檢測波長的選擇

經(jīng)紫外吸收及純度檢測對比對照品溶液和供試品溶液，結(jié)果表明2個成分均在280 nm有最大吸收波長，同藥典中延胡索的定量指標(biāo)一致，故依舊選擇280 nm作為檢測波長。

4結(jié)束語

本研究建立了高效液相色譜測定方法同時(shí)測定醋延胡索中延胡索乙素、延胡索甲素的含量。該方法為醋延胡索質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和擴(kuò)大產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了參考依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，且具有操作簡單、準(zhǔn)確實(shí)用、結(jié)果可靠的優(yōu)勢，有利于深入研究醋延胡索質(zhì)量控制。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2020年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

[2]林源，魏雨辰，李曉東，等.醋蒸延胡索質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2022，40（1）：57-61.

[3]張鐵軍，許浚，韓彥琪，等.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）研究：延胡索質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中草藥，2016，47（9）：1458-1467.

[4] LISCOMBE D K，F(xiàn)ACCHINI P J.Molecular cloning and characterizationoftetrahydroprotoberberinecis-Nmethyltransferase，anenzymeinvolvedinalkaloid biosynthesis in opium poppy[J]. Journal of Biological Chemistry，2007，282（20）：14741.

[5]張鐵軍，許浚，韓彥琪，等.中藥大品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究的思路與實(shí)踐[J].天津中醫(yī)藥，2017，34（1）：4-12.

[6]劉昌孝，陳士林，肖小河，等.中藥質(zhì)量標(biāo)志物（QMarker）：中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的新概念[J].中草藥，2016，47（9）：1443-1457.

[7] YANG W，ZHANG Y，WU W，et al.Approaches to establish Q-markers for the quality standards of traditional Chinese medicines[J].Acta Pharmaceutica Sinica B，2017（4）： 439-446.

【作者簡介】

王偉倩，女，1993年出生，主管藥師，碩士，研究方向?yàn)橹兴帣z驗(yàn)。通信作者：鐘寧遠(yuǎn)，女，1986年出生，主管藥師，碩士，研究方向?yàn)橘|(zhì)量科技管理，ningyuan_123@163.com。

（編輯：侯睿琪）