紅仁核桃內種皮多酚提取工藝研究

摘 要：紅仁核桃是我國重要的經濟樹種，有豐厚的營養價值和廣闊的市場前景，其內種皮富含酚類物質，為獲得較高的多酚提取率而開展研究，旨在得到一組最佳多酚提取工藝組合方案。

以紅仁核桃內種皮為研究對象，先采用單因素試驗后，再采用正交試驗進行提取工藝條件優化，同時采用Folin-Ciocaileu法對核桃內種皮中總酚進行檢測，以多酚得率為評價指標，通過正交分析從而得出在本試驗中四個考察因素下最優的一組工藝組合。通過試驗建立的沒食子酸標準曲線回歸方程為A=1.039 3C+0.019 8，R+2=0.991 4，其在試驗范圍內質量濃度與吸光度值表現出良好的線性關系。通過單因素試驗，選取70℃為紅仁核桃內種皮多酚提取最適溫度水平選取60∶[KG-*2]1作為紅仁核桃內種皮多酚提取最適液固比條件選取2 h作為紅仁核桃內種皮多酚提取最適時間采用45%的乙醇濃度做為最佳提取條件。在單因素試驗基礎上，篩選出四個考察因素，即乙醇體積分數、液固比、提取溫度及提取時間設計三水平正交試驗。得出四因素的影響大小順序為：提取溫度gt;液固比gt;乙醇體積分數gt;提取時間。當提取條件為乙醇體積分數45%、

液固比為60 mL∶[KG-*2]1 g、提取溫度為70℃、時間為2 h時，紅仁核桃內種皮多酚提取率最高。進行重復驗證試驗三次，最后取平均值得到此條件下紅仁核桃內種皮多酚提取率為27.93%，此條件為紅仁核桃內種皮多酚提取最佳工藝條件。本試驗獲得的紅仁核桃內種皮多酚提取工藝方法提取率高，提取效果理想，可作為紅仁核桃內種皮多酚提取方法的參考。

關鍵詞：紅仁核桃內種皮多酚提取單因素試驗正交試驗

中圖分類號：Q819" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）08-0030-07

Technology for Extraction of Polyphenols from Inner Seed Coat of Red Kernel Walnut

XU Feili+1， REN Jiayu+1， WANG Danfeng+2， FANG Qing+1， WANG Lei+1， JIA Guolun+1， CHANG Liang+1， GUO Yaodong+1

（1. College of Health Management， Shangluo University， Shangluo， Shaanxi 726000， China

2. College of Biopharmaceutical and Food Engineering， Shangluo University， Shangluo， Shaanxi 726000， China）

Abstract： Red kernel walnuts are an important economic crop in China， known for their rich nutritional value and market potential. The inner seed coat of the red kernel walnut contains a high amount of phenolic substances. This study aims to optimize the extraction process to achieve a higher yield of polyphenols. Initially， single-factor experiments were conducted， followed by an orthogonal experiment to refine the extraction process. The Folin-Ciocalteu method was used to measure the total phenol content， with the polyphenol yield as the evaluation index. Through orthogonal analysis of four factors， the optimal extraction conditions were determined. The results showed that the regression equation for the standard curve of gallic acid， established through experiments， was A=1.039 3C+0.019 8， R+2=0.991 4， indicating a good linear relationship between mass concentration and absorbance value within the experimental range. The optimal conditions identified through single-factor experiments were 70°C as the extraction temperature， a liquid-solid ratio of 60∶[KG-*2]1， an extraction time of 2 hours， and a 45% ethanol concentration. Based on these single-factor experiments， four factors were selected for further examination： ethanol volume fraction， liquid-solid ratio， extraction temperature， and extraction time. A three-level orthogonal experiment was designed. The order of influence of the four factors was found to be： extraction temperature gt; liquid-solid ratio gt; ethanol volume fraction gt; extraction time. The optimal extraction conditions were identified as 45% ethanol volume fraction， 60∶[KG-*2]1 （mL） liquid-solid ratio，70℃" extraction temperature， and 2 hours extraction time. Under these conditions， the extraction rate of polyphenols from the inner seed coat of the walnut was 27.93%. In conclusion， the extraction method optimized in this study yields a high extraction rate and ideal extraction effect， providing a valuable reference for extracting polyphenols from the inner seed coat of red kernel walnuts.

Key words： Red kernel walnut Endotesta Polyphenol extraction Single-factor experiment Orthogonal experiment

核桃是我國重要的經濟樹種[1]，早在2 000多年前我國就已開始種植，其栽培種植技術已十分成熟。我國已成為世界上最大的核桃種植國，其生產地以云南、陜西、新疆為主，具有很高的經濟效益和社會效

益[2，3]。核桃營養價值豐厚[4]，還具有降血脂等多種保健功能，對人體起積極的抗氧化作用。與普通核桃相比，紅仁核桃更是重要的經濟樹種，因其內種皮富含花色苷而具有獨特的營養價值，因而具有很好的發展前景，如加以充分開發利用，將可以有效帶動當地鄉村經濟發展。關于紅仁核桃的研究尚處在初級階段，研究空間廣闊。目前，紅仁核桃主要以小規模種植為主，隨著對紅仁核桃研究的深入，未來也會逐步實現大規模種植，紅仁核桃渾身是寶，關于其內種皮多酚提取利用等更多紅仁核桃的研究也會更具現實意義。本研究通過篩選出紅仁核桃內種皮多酚的最佳提取工藝，為當地紅仁核桃的進一步深加工利用、減少核桃多酚資源的浪費提供參考資源。

核桃內種皮即核桃仁表面附著的外表皮。研究表明，核桃內種皮集中了核桃內部大多數多酚類物質[5，6]。核桃內種皮多酚具有顯著的營養保健功能，如抗氧化作用[7]、抗心腦血管疾病[8，9]、抗腫瘤[10，11]、緩解肝臟損害[12，13]、調節血脂和血管功能[14，15]、清除體內自由基、抗衰老[16]、阻止微生物致病因子的產生[17]、改善脾淋巴細胞活性、T細胞亞群數等[18]，還可以有效運用到阿爾茨海默病的治療中[19]。核桃內種皮不僅可以用來泡水喝，在一定程度上緩解身體疲勞，還具有保護血管健康，增強腸胃蠕動力，治療便秘等多種功效。同時，由于核桃內種皮中的某些物質會相互作用導致蛋白質產生沉淀，同時伴隨一定的苦澀味，從而對食品的味道和顏色造成一定的損害，因此，在食品工業生產中常將核桃內種皮作為廢料處理[20]，從而導致大量核桃資源的流失。未來如何將核桃內種皮變廢為寶是一項重要又值得研究的課題。

紅仁核桃是美國加利福尼亞大學于1978年雜交育成的一種獨特的核桃，其內種皮為紅色，且營養價值高于普通品種核桃[21]，因此引起國內外學者的廣泛重視。紅仁核桃內種皮中富含大量的酚類及黃酮類化合物，具有重要的營養和開發應用價值。

核桃多酚的提取和純化一直是國際研究的熱點之一。傳統溶劑提取法主要以一定濃度的乙醇為提取劑，采用水浴或索氏抽提對多酚進行提取超聲輔助溶劑提取法，是在有機溶劑提取的基礎上增加了超聲波處理微波輔助溶劑提取法，是在有機溶劑提取的基礎上增加了微波處理酶法復合超聲輔助法，仍處在實驗室研究階段亞臨界提取法，以亞臨界水為提取劑，此法更適合于核桃殼中有效成分的提取閃式提取法，是一種新型提取技術，主要通過高速攪拌和高壓作用，在短時間內將核桃中的多酚物質提取出來。在核桃多酚的提取過程中，可以結合實際情況，采用多種方法相結合的方式進行優化，以實現高效、節能且環保的多酚提取。目前，核桃多酚的提取和純化技術已經取得了顯著的進展[22，23]。然而，由于核桃多酚的組成復雜，其完全分離和純化仍然具有挑戰性，因此這一領域仍有許多研究需要進行。

目前，我國對核桃內種皮多酚的提取工藝還處在研究階段，研究人員一般采用甲醇、乙醇為提取液，同時加入少量酶類、螯合劑等用以提高多酚提取率。本文從紅仁核桃內種皮中多酚的提取工藝入手，對提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、液固比4個因素進行優化，探究最優的一組提取工藝組合，從而獲得最佳提取率。通過試驗研究，最終確定一種理想的紅仁核桃內種皮多酚提取率的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅仁核桃（滇彩甄選農產品店提供），破殼取仁，剝取內種皮后室溫條件下自然干燥，粉碎過0.85 mm孔徑的篩網，放置備用。

紫外-可見分光光度計（UV759S，上海習仁科學儀器有限公司）。搖擺式高速粉碎機（DFY-500C，溫嶺市林大機械有限公司）、四孔恒溫水浴鍋（HH-S4，鞏義市予華儀器有限責任公司）、電冰箱（BCD-328WDGF，青島海爾股份有限公司）、萬分之一電子天平（CP114，奧豪斯儀器有限公司）。沒食子酸（北京索萊寶科技有限公司），福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司），無水乙醇、碳酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的建立 用電子天平稱取0.005 g沒食子酸標準品，置于50 mL容量瓶中溶解定容，即可得到100 mg/L沒食子酸標準溶液，即配即用。用移液管分別準確吸取標準溶液0.1～0.8 mL共8份于10 mL具塞試管內，再分別加水補足至1 mL，輕輕搖動，使溶液混合均勻后加入10%福林酚試劑5.0 mL，5 min后再加入7.5% Na-2CO-3溶液4.0 mL，搖勻后室溫避光反應1 h，在波長765 nm處測定吸光度值，繪制沒食子酸標準曲線[24]。

1.2.2 多酚類含量的測定 多酚類化合物的測定采用Folin-Ciocaileu（福林酚試劑）比色法[25]。

樣品溶液：取干燥的核桃內種皮粉末0.20 g，置于150 mL平底燒瓶中，加入一定體積的60%乙醇，恒溫水浴兩次，每次30 min，抽濾，合并濾液并用蒸餾水定容至50 mL，用移液管精確量取上述樣品溶液1.0 mL，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，得樣品溶液。

采用1.2.1方法測定紅仁核桃內種皮中多酚提取液吸光度值，通過1.2.1繪制出的標準曲線計算各樣品溶液多酚得率，計算公式如下：

多酚得率（%）=m-1/m-2×100

式中，m-1為樣品溶液中多酚的含量（g）m-2為紅仁核桃內種皮樣品質量（g）。

1.3 試驗步驟

1.3.1 單因素試驗 溫度：用電子天平稱取0.2 g干燥的核桃內種皮5份分別置于150 mL平底燒瓶中，保持乙醇體積分數（60%）、液固比（60 mL∶[KG-*2]1 g）、提取時間（60 min）等因素一致，同時設置50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃ 5個溫度梯度，各樣品均提取2次后抽濾，合并浸提液，按標準曲線建立方法，測定吸光度值，用福林酚比色法測定樣品溶液中多酚含量，在試驗范圍內探究提取溫度對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響[26，27]。

液固比：按上述試驗步驟，將液固比設置為40∶[KG-*2]1、60∶[KG-*2]1、80∶[KG-*2]1、100∶[KG-*2]1四個梯度，溫度為上述確認最佳溫度水平，各樣品均浸提2次后抽濾，合并浸提液，按標準曲線建立方法，測定吸光度值，用福林酚比色法測定樣品溶液中多酚含量，在試驗范圍內探究液固比對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響。

提取時間：按上述試驗步驟，保持其余變量不變，溫度及液固比為上述步驟已經確認的最佳水平，將提取時間設置為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h五個梯度，各樣品均浸提2次后抽濾，合并浸提液，按標準曲線建立方法，測定吸光度值，用福林酚比色法測定樣品溶液中多酚含量，在試驗范圍內探究提取時間對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響。

乙醇體積分數：按上述試驗步驟，其余變量均按照上述步驟已經確認的最佳水平，將乙醇體積分數設置為40%、45%、60%、75%、90%五個梯度，各樣品均浸提2次后抽濾，合并浸提液，按標準曲線建立方法，測定吸光度值，用福林酚比色法測定樣品溶液中多酚含量，在試驗范圍內探究乙醇體積分數對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響。

1.3.2 正交試驗 準確稱取干燥的核桃內種皮0.2 g于150 mL平底燒瓶中，以單因素試驗結果為依據，以4個因素設計L9（34）正交試驗，以多酚得率為評價指標，每個組合設3個重復，取平均值作為多酚得率。優化紅仁核桃內種皮多酚提取工藝。正交試驗因素及水平如表1所示。通過SPSS26.0分別對提取溫度等4個因素與多酚提取率之間的關系進行分析。

1.3.3 正交試驗驗證 重復驗證正交試驗得到的最優組合，考察最優提取條件下結果的穩定性，最后取平均值，得到最優提取條件下的多酚得率。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

設置吸光度值A為縱坐標，沒食子酸質量濃度C為橫坐標，繪制沒食子酸的標準曲線，進行回歸分析。結果如圖1所示：

沒食子酸標準曲線回歸方程為A=1.039 3C+0.019 8，R+2=0.991 4，其在試驗范圍內，質量濃度與吸光度值表現出良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度對多酚得率的影響 按1.3.1試驗方法，控制其余變量一致，提取溫度對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響見圖2。

由圖2可知，其余條件不變，溫度為50～90℃的范圍內，多酚得率逐漸上升，原因可能是在較高溫度下，溶質中多酚物質擴散速度增加，分子運動劇烈，導致氫鍵更易破裂，從而加快多酚的溶出和擴散速率，因而酚類化合物浸出率逐漸升高[28]。70℃時多酚提取率達到最高，為27.52%，溫度達到80℃時，多酚得率隨著溫度的升高開始呈下降趨勢，這可能是因為在過高溫度下，多酚的氧化程度增加使得活性多酚含量減少的緣故[29]，因此，選取70℃作為紅仁核桃內種皮多酚提取的最適溫度。

2.2.2 液固比對多酚得率的影響 按1.3.1試驗方法，控制其它變量一致，液固比對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著液固比增大，紅仁核桃內種皮得率呈現先增后降的趨勢，液固比為60∶1時，多酚得率達到峰值，為26.89%。原因可能是隨著提取液體積的增多，酚類物質擴散的壓力差變大，使其在提取液中的溶解度變大，多酚得率也隨之增大但如果繼續增大溶劑比例，后續壓力差變化小，導致酚類化合物擴散速率降低，同時，隨著溶液總體積增大，使得濃度變小不利于酚類物質提取[30]，因此選取60∶1作為紅仁核桃內種皮多酚提取的最適液固比。

2.2.3 提取時間對多酚得率的影響 按1.3.1試驗方法，控制其他變量一致，提取時間內對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著提取時間的延長，多酚提取率呈先上升后下降的趨勢，120 min時達到峰值，此時提取率為27.21%。原因可能是起初隨著時間的延長，有利于酚類物質的溶出，因此，多酚得率呈上升趨勢，并在2 h時達到峰值。隨后，提取率呈下降趨勢，這可能是由于隨著時間的延長，多酚類物質發生了縮合反應，或被氧氣氧化所致[31]，因此，選取2 h作為紅仁核桃內種皮多酚提取的最適時間。

2.2.4 乙醇體積分數對多酚得率的影響 按1.3.1試驗方法，控制其他變量一致，乙醇濃度對紅仁核桃內種皮多酚得率的影響見圖5。

由圖5可知，當乙醇體積分數在40%～45%區間時，隨著體積分數的增加，多酚得率提高。乙醇體積分數為45%時，多酚得率達到峰值，此時提取率為27.52%，乙醇體積分數在45%～60%區間時，核桃內種皮多酚得率開始呈下降趨勢。原因可能是乙醇體積分數的增加使紅仁核桃內種皮多酚溶解度增加，從而利于提取，表現為提取率升高。此后，隨著乙醇體積分數的升高，導致有機溶劑與多酚極性差異增大[32]，因此，多酚提取率降低。故選取45%作為紅仁核桃內種皮多酚提取的最佳乙醇體積分數。

2.3 正交試驗結果

在以上單因素試驗基礎上，篩選出四個考察因素，即乙醇體積分數（A）、液固比（B）、提取溫度（C）及提取時間（D）設計三水平正交試驗。K為每個因素各個水平下的指標總和，r為極差，Kmax為每個因素各個水平下指標總和的最大值，運用SPSS26.0進行數據分析，結果見表2。

根據表2中極差數值，上述四因素的影響大小為：提取溫度gt;液固比gt;乙醇體積分數gt;提取時間，即提取溫度對多酚得率的影響最大，其次為液固比和乙醇體積分數，而提取時間對多酚得率的影響最小。其中條件A-2B-2C-2D-2為核桃內種皮多酚提取中的最優提取工藝參數，即乙醇體積分數為45%，提取時間為120 min，液固比為60 mL∶[KG-*2]1 g，溫度為70℃。

按正交分析所得最優工藝條件組合，進行驗證試驗，三次驗證試驗多酚平均得率為27.93%。

3 討論

張春梅[33]等對云南漾濞地區的新鮮核桃進行多酚提取研究，結果表明溫度70℃、時間60 min、液固比60 mL∶[KG-*2]1 g）、乙醇體積分數45%時，該品種核桃內種皮多酚的得率最大為25.05%，本研究多酚得率為27.93%，比其高出2.88%。同時，張春梅等通過正交分析試驗得出，提取溫度對多酚得率的影響最大，本研究結論與此一致。周曄等[34]通過對“娘青”品種核桃進行超聲波提取研究發現，核桃內種皮粉在100 W超聲波下，53℃，55 min，液固比58 mL∶[KG-*2]1 g 時，為其最佳提取條件，此條件下多酚得率為30.7%，比本研究所用方法多酚得率高出2.77%。試驗結果存在差別的原因，除了可能與試驗提取方法、核桃品種、產地有關外，還可能與研究條件、環境不一致等誤差因素也有關系。

張天財等[35]通過對云南地區核桃各部分多酚化合物含量進行測定，表明核桃內種皮（21.73%）中含量最高，其次為核桃青果皮（6.37%）和核桃殼（2.92%），而核桃仁（0.77%）中含量最低，可以看出核桃內種皮多酚含量明顯高于其他部分。本研究核桃內種皮多酚得率27.93%，也是對此結論的一方面證實，說明核桃內種皮多酚確實具有重要的研究價值。研究人員可以充分發揮核桃內種皮這一資源優勢，進一步開發出更多商品，提高產品附加值。

賈淑平等[36]采用復合酶-超聲波技術，用纖維素酶和果膠酶提取核桃青皮多酚，效果較好。鄭曉寧等[37]采用乙醇作為提取劑，利用微波萃取技術從胡桃青皮中萃取酚類物質，同時加入適量六偏磷酸鈉，發現多酚產出量比常規對照溶劑提取法有所提高。李笑笑[38]利用酸化乙醇超聲提取法發現，當鹽酸濃度為0.05 mol/L，提取溫度為65℃，提取時間為10 min時，核桃仁多酚提取率最大，達96%， 提取效果理想。這些多酚類物質的提取方法，尤其是提取率很高的方法，未來也可以嘗試應用在核桃內種皮或其他部位的提取上。

4 結論

本研究以紅仁核桃內種皮為試驗原料，采用單因素法和正交法，研究了提取劑乙醇濃度、液固比例、提取時間、提取溫度對內種皮粉中多酚提取率的影響。通過正交分析確認了各因素的最佳水平，得到了紅仁核桃內種皮多酚最佳提取工藝參數（提取溫度70℃、時間2 h、液固比60 mL∶1 g、乙醇體積分數45%）。通過比較極差，確定了四種因素對多酚提取率的影響順序為：提取溫度＞液固比（mL∶g）＞乙醇體積分數＞提取時間，且通過正交試驗驗證了在此最佳提取工藝條件下，紅仁核桃內種皮多酚提取率為27.93%。總的來說，本研究得到的紅仁核桃內種皮多酚提取方法切實可行，較為理想，有一定的參考性。

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基金項目：商洛學院保健食品開發研究項目（18SCX005）商洛學院博士科研啟動基金項目（20SKY030）。

第一作者簡介：許飛利（1979-），女，講師，博士，研究方向：食品營養與安全。