粳高粱和糯高粱的非靶向代謝組學分析

摘 要：為探究不同品種高粱的代謝物差異及其對白酒釀造過程和白酒品質的潛在影響，本文通過非靶向代謝組學對川粱紅9號和東北粳高粱籽粒的代謝物差異進行分析。結果表明，兩種高粱中萜類、黃酮類、脂類及氨基化合物的含量和種類存在明顯的差異。這些差異可能通過調控發酵微生物的代謝活動，進而影響高粱白酒的發酵進程和風味物質的生成，最終導致其風味及品質的差異化。

關鍵詞：高粱品種；非靶向代謝組學；白酒釀造；風味

Non-Targeted Metabolomics Analysis of Non-Glutinous and Glutinous Sorghum

LI Qiang， ZHU Hui， WANG Ning*

（Sichuan Engineering Technology Research Center for Liquor-Making Grains，

Sichuan University of Science & Engineering， Yibin 644000， China）

Abstract： In order to investigate the metabolite differences of sorghum varieties and their potential effects on liquor brewing process and liquor quality， the metabolites of Chuanlianghong No.9 sorghum and northeast japonica sorghum were analyzed by non-targeted metabolomics. The results showed that there were significant differences in contents and types of terpenoids， flavonoids， lipids and amino compounds in two kinds of sorghum. These differences may affect the fermentation process and the production of flavor substances by regulating the metabolic activities of fermentation microorganisms， and ultimately lead to the difference of flavor and quality of sorghum liquor.

Keywords： sorghum variety; non-targeted metabolomictjLqSQZgMfB+KHYCBp5nCA==s; Baijiu brewing; flavour

高粱是釀造白酒的核心原料，其品種的變化與白酒的風味及整體品質的優劣密切相關。當前，主要的高粱品種包括糯高粱和粳高粱，在淀粉結構、蛋白質含量、脂肪含量以及單寧含量等方面存在顯著差異，從而影響著白酒的發酵過程和最終品質[1]。

目前，已有研究報道高粱品種對白酒品質的影響，并利用氣相色譜等技術手段分析不同品種高粱釀造白酒的揮發性風味化合物和原糧蒸煮風味的差異[2]。但是，相關研究多集中于高粱品種的淀粉結構、單寧含量、釀造性能的變化及其對出酒率和感官質量的影響[3]，而對于高粱的代謝物差異及其對釀造白酒品質影響的系統性研究還相對不足。本文通過分析不同高粱品種代謝物的差異，探討其對白酒發酵過程及品質的影響，以期為白酒釀造工藝的優化及品質提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川粱紅9號高粱、東北粳高粱，由四川輕工化大學釀酒專用糧工程技術研究中心提供。

丙酮，天津市康科德科技有限公司；乙腈、96D30q4lTm4WhUJSxjtHqg==甲酸、甲酸銨、甲醇，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 前處理方法

將100 mg高粱樣品用液氮研磨，隨后在80%甲醇中進行渦旋混合再懸浮。將樣品在冰上孵育5 min，在15 000×g、4 ℃條件下離心20 min。用超純水將上清液稀釋至甲醇濃度為53%。將樣品轉移到干凈的EP管中，在15 000×g、4 ℃條件下離心20 min，備用待測。

1.3 超高效液相色譜質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1。流動相A：0.1%甲酸；流動相B：甲醇；溶劑梯度洗脫程序：0～3 min，2%B；3～10 min，2%→85%B；10～10.1 min，85%B；10.1～11 min，85%→2%B；11～12 min，2%B。

（2）質譜條件。掃描范圍：m/z 100～1 500；ESI噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣流速：35 psi；輔助氣流速：10 L·min-1；離子傳輸管溫度：320 ℃；離子導入射頻電平：60；輔助氣加熱器溫度：350 ℃。

1.4 數據分析

使用CD3.3搜庫軟件處理原始數據，對代謝物進行峰提取、峰對齊和定量。基于MetaX平臺對代謝物執行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA），篩選變量重要性投影（Variable Important in Projection，VIP）。使用t檢驗對兩組樣本的代謝物的統計學顯著性（P值）和差異倍數（Fold Change，FC）進行分析。利用KEGG數據庫（https：//www.kegg.jp/）對鑒定得到的代謝物的代謝途徑進行注釋。

2 結果與分析

2.1 不同品種高粱的超高效液相色譜-質譜數據分析

超高效液相色譜-質譜因其靈敏性高和分析范圍廣而在代謝組學中廣泛使用。使用超高效液相色譜-質譜儀獲取的不同品種高粱的總離子流圖如圖1所示（每個樣品分別測定3次）。由圖1可知，兩種樣品的出峰時間和范圍基本一致，但在峰形和峰值上存在差別，表明兩種高粱的代謝物成分存在差別。

為初步比較兩種高粱的代謝物差異，對其代謝物進行PCA分析和分類，結果如圖2所示。由PCA 3D評分可知[圖2（a）]，川粱紅9號組和東北粳高粱組的組間樣本較為分散，整體差異大，而組內樣本較為聚集，差異小，樣本穩定性較好。說明兩種高粱的代謝物具有明顯差異。代謝物類型主要包括脂類和類脂分子（32.12%）、苯基丙烷類和聚酮類（15.91%）、有機酸及其衍生物（13.58%）等[圖2（b）]，表明淀粉是高粱組分中占比最高的物質，而脂類化合物是高粱中種類最多的物質[4]。

2.2 不同品種高粱中的代謝物差異性比較

對PCA模型進行初步分析，模型穩定、可靠且組間差異明顯，為進一步明確兩種高粱中的差異代謝物，采用PLS-DA模型分析數據。根據PLS-DA結果[圖3（a）]進行分析，發現從縱向來看，兩組的樣本聚集，組內重復性好；橫向來看，兩組樣本間隔較遠，組間代謝物具有明顯差異。圖3（a）中R2Y=1.00，表示所建模型對Y軸矩陣的解釋率為100%；Q2Y=0.93，表示模型對Y軸矩陣的預測能力為93%。通常，R2、Q2數值越接近1，說明模型對觀測數據的擬合程度和預測能力越好，越能反映不同品種高粱中代謝物的真實情況。為避免過度擬合而影響模型的可靠性，進一步對PLS-DA模型進行置換檢驗[圖3（b）]。由置換檢驗結果可知，擬合值R2截距=0.94，預測值Q2截距=-0.86。其中，Q2截距＜0.05，表明預測的偶然性很小，具有較好的預測能力，且R2總是＞Q2，說明該模型可靠。

2.3 差異代謝物的篩選與表征

采用VIP＞1.0，FC＞1.5或FC＜0.667且P＜0.05作為篩選標準，進一步鑒定兩種高粱中的差異代謝物。其中，上調表示在川粱紅9號中差異代謝物含量相對更高（在東北粳高粱中差異代謝物含量相對更低），下調反之。在代謝物中篩選出148種上調、135種下調的顯著差異代謝物[圖4（a）]。差異代謝物在兩組中的分布如圖4（b）所示，川粱紅9號高粱中洋川芎內酯A、酯蟾毒配基、冬凌草乙素、長春胺、靈芝酸H、甘草內酯、脂類（維生素D、8-異前列腺素）以及氨基酸化合物（L-同型半胱氨酸）等物質含量較高。而東北粳高粱中橙皮苷、表兒茶素、齊墩果酸、番麻皂素、五味子酚、血清素、氨基酸化合物（D-谷氨酰胺、γ-谷氨酰半胱氨酸、L-谷胱甘肽）、脂類化合物（二十二碳六烯酸）等物質含量較高。兩種高粱的差異代謝物主要集中在脂類化合物、萜類、類黃酮、氨基化合物中。而代謝物成分的差異對白酒發酵過程中風味物質的形成具有重要影響，部分代謝物或作為風味貢獻成分影響產品感官，或作為功能活性成分發揮健康調節功效。在發酵期間，高粱中脂類物質經微生物和生物酶的共同作用后，發生降解而溶出，賦予酒體豐富的脂肪酸。此外，少量的脂肪酸與乙醇在酶的催化作用下合成酯類化合物，經分解可產生一些醇、酸類物質，再經氧化還原生成醛類和酮類物質，從而使得白酒中的風味更加豐富[5]。ZHANG等[6]曾報道萜類物質（冬凌草乙素）對結直腸癌以及其他癌癥具有抗癌活性。在發酵過程中，氨基化合物既可作為氮源為微生物提供營養，也可以在多種微生物酶的作用下分解生成氨基酸，再轉化為高級醇、醛酮類、內酯類等獨特的風味物質[7]。在發酵過程的高溫環節，氨基酸還可以與還原糖發生美拉德反應，形成呋喃類、吡嗪類等多元雜環化合物，賦予白酒更多的焦香、堅果香等風味。這些風味化合物對于白酒，特別是醬香型白酒的風味有著重要的作用。

2.4 差異代謝物的代謝途徑分析

為確定差異代謝物所參與的代謝途徑，對篩選出的283個代謝物進行KEGG代謝途徑分析，結果如圖5所示。由圖5（a）可知，代謝物參與的主要途徑中，除全局和概覽地圖以外，占比最高的為氨基酸代謝（16.06%），其次為脂代謝（14.6%）。途徑散點圖表明[圖5（b）]，較多代謝物注釋的代謝途徑包括苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、硫胺素代謝、亞油酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、花生四烯酸、脂肪酸生物合成以及不飽和脂肪酸生物合成等。這些途徑主要涉及氨基酸生物合成和脂肪酸代謝，表明川粱紅9號與東北粳高粱中主要氨基酸和脂類物質存在顯著差異。

3 結論

本文通過對川粱紅9號、東北粳高粱兩種不同品種高粱籽粒中的代謝物進行分析發現，兩種品種高粱代謝物的組成、含量均存在一定的差異。川粱紅9號與東北粳高粱中所含的萜類、黃酮類化合物、脂類化合物、氨基化合物的含量和種類存在明顯差異。這些差異可能導致白酒釀造過程中糟醅的發酵進度和風味物質發生變化，最終造成白酒整體品質的不同。但白酒品質還可能與原料、環境等多種因素相關，不同品種高粱在釀造過程中對釀造特性、白酒品質的香氣成分和功能成分的影響有待進一步研究。

參考文獻

[1]LI Y L，MA Y，ZHU H，et al.Identifying distinct markers in two Sorghum varieties for Baijiu fermentation using untargeted metabolomics and molecular network approaches[J].Food Chemistry：X，2024，23：101646.

[2]高旭，徐建霞，丁延慶，等.釀酒高粱籽粒理化品質及蒸煮特性分析[J].食品科技，2023，48（1）：159-166.

[3]張雪瓶，羅艷平，陳波，等.不同高粱品種對濃香型白酒生產的影響研究[J].釀酒科技，2022（4）：43-47.

[4]肖銀，項興本，倪永培，等.不同品種高粱在濃香型白酒釀造過程中的對比研究[J].釀酒，2023，50（3）：42-47.

[5]牛姣，沈毅，張貴虎，等.白酒釀造原料與酒體品質關系的研究進展[J].食品與發酵工業，2023，49（3）：322-328.

[6]ZHANG Z G，XU J J，LIU B，et al.Ponicidin inhibits pro-inflammatory cytokine TNF-α-induced epithelial–mesenchymal transition and metastasis of colorectal cancer cells via suppressing the AKT/GSK-3β/Snail pathway[J].Inflammopharmacolo-gy，2019，27：627-638.

[7]羅惠波，茍云淩，葉光斌，等.影響白酒中高級醇生成的工藝條件研究[J].中國釀造，2011，30（8）：87-90.

基金項目：四川省釀酒專用糧工程技術研究中心（2022-04）；中國輕工業重點實驗室“釀酒生物技術與智能制造”（2023-02）。

作者簡介：李強（1997—），男，四川巴中人，碩士在讀。研究方向：釀酒專用糧對白酒風味及品質的調控機制。

通信作者：王凝（1988—），女，四川成都人，博士，副教授。研究方向：釀酒專用糧對白酒風味及品質的調控機制。E-mail： wangningzhuhui@hotmail.com。