GC-MS法快速測(cè)定淡水魚中丁香酚類化合物的殘留

摘 要：目的：建立一種基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）快速、大批量檢測(cè)淡水魚中丁香酚類化合物的方法。對(duì)采集的200批次淡水魚樣品（包括黑魚、鱸魚、鯽魚等16個(gè)品種）中的丁香酚類化合物殘留進(jìn)行測(cè)定與分析。方法：優(yōu)化樣品前處理方法和氣相色譜條件。結(jié)果：6種丁香酚類化合物在0.02～0.20 mg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999；6種丁香酚類化合物回收率為82.4%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為1.6%～9.2%；在200批次淡水魚樣品丁香酚類化合物殘留檢測(cè)中，鰱魚、鱸魚、草魚的檢出率較高，均大于50%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、回收率高，可滿足對(duì)大批量水產(chǎn)品中丁香酚類化合物的定性檢測(cè)和定量分析要求，為水產(chǎn)行業(yè)可持續(xù)發(fā)展和食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：水產(chǎn)品；丁香酚；狀況分析；氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

Rapid Determination of Eugenol Residues in Freshwater Fish by GC-MS

WEI Qinfang， HU Wenbin， LYU Xuhong， ZHU Jinyu， XING Feng*

（Zhejiang Fangyuan Testing Group Co.， Ltd.， Hangzhou 310018， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid and large-scale detection method for eugenol compounds in freshwater fish based on gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Determination and analysis of residual eugenol compounds in 200 batches of freshwater fish samples collected， including 16 species such as black fish， sea bass， and crucian carp. Method： Optimize sample pretreatment methods and gas chromatography conditions. Result： The six eugenol compounds showed a good linear relationship between 0.02 and 0.20 mg·L-1， with correlation coefficients r2 greater than 0.999; the recovery rates of six eugenol compounds ranged from 82.4% to 106.0%， with relative standard deviations （n=6） of 1.6% to 9.2%; in the detection of residual eugenol compounds in 200 batches of freshwater fish samples， the detection rates of silver carp， sea bass， and grass carp were relatively high， all exceeding 50%. Conclusion： This method is simple to operate， has high recovery rate， can meet the requirements for qualitative detection and quantitative analysis of eugenol compounds in large quantities of aquatic products， it provides technical support for the sustainable development of the aquatic industry and food safety supervision.

Keywords： aquatic products; eugenol; condition analysis; gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

丁香酚因具有成本低廉和麻醉效果好等優(yōu)勢(shì)，在漁業(yè)中被廣泛用作麻醉劑[1]。丁香酚能夠有效減輕水生動(dòng)物在搬運(yùn)過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)，減少其在運(yùn)輸途中的損傷風(fēng)險(xiǎn)，從而顯著提高水生動(dòng)物的生存率。因此在國(guó)外被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖與運(yùn)輸領(lǐng)域[2-3]。然而，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在2017年將丁香酚分類為第三類致癌物質(zhì)，這意味著它被認(rèn)為具有致癌性、致突變性、致敏性等潛在風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。國(guó)際上，美國(guó)、加拿大等北美國(guó)家不允許使用丁香酚；新西蘭、日本等國(guó)家允許限量使用丁香酚，且日本規(guī)定了最大殘留限量為0.05 mg·kg-1。在我國(guó)，關(guān)于丁香酚在水產(chǎn)品中使用的研究相對(duì)較少，缺少完善的政策法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，也未規(guī)定明確的參考限量，這種情況給水產(chǎn)品中丁香酚的使用帶來(lái)了一定的不確定性和挑戰(zhàn)[6-10]。目前，針對(duì)丁香酚類化合物的檢測(cè)分析技術(shù)主要包括氣相色譜技術(shù)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等，其中，GC-MS法具有操作簡(jiǎn)單、精確度和靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)[14]。食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測(cè)定》（BJS 201908）中有對(duì)丁香酚類化合物的前處理方法，但該操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，且回收率較低。

為了深入了解淡水魚中丁香酚的殘留量情況，加強(qiáng)對(duì)市售淡水魚的食品安全監(jiān)管[15]。本研究建立了一種氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)淡水魚中丁香酚類化合物殘留量的方法，為水產(chǎn)行業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及食品安全的管理工作提出參考性意見[16-17]。

1 材料與方法

1.1 試劑

丁香酚（CAS號(hào)：97-53-0）、異丁香酚（CAS號(hào)：97-54-1）、甲基丁香酚（CAS號(hào)：93-15-2）、甲基異丁香酚（CAS號(hào)：93-16-3）、乙?；惗∠惴樱–AS號(hào)：93-29-8）和乙酸丁香酚酯（CAS號(hào)：93-28-7）標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥97%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；乙腈（色譜純），上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；氯化鈉、無(wú)水Na2SO4，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；實(shí)驗(yàn)用水（超純水）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；KQ3200DV超聲波提取儀，昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX GENIUS 3渦旋混勻器，德國(guó)IKA公司；JA3003電子天平（0.001 g），上海舜宇恒平儀器有限公司；HP-5MS UI色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 樣品采集

基于水產(chǎn)養(yǎng)殖習(xí)慣和產(chǎn)品流通特性，本研究對(duì)水產(chǎn)品在餐飲服務(wù)及流通領(lǐng)域的狀況進(jìn)行了全面調(diào)研。調(diào)研范圍涵蓋了11個(gè)地級(jí)區(qū)域的大小型餐館、批發(fā)及零售市場(chǎng)、綜合性超市、傳統(tǒng)農(nóng)貿(mào)集市、小型食品雜貨店以及網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物平臺(tái)等眾多銷售渠道。本次調(diào)查共采集了200份淡水魚類樣本，涉及16個(gè)不同品種。樣品采集完成后，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)處理并冷藏保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

丁香酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確量取6種丁香酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品各10.0 mg，用乙腈溶劑溶解，并定容至100 mL，制備得100.0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚、乙酰基異丁香酚、乙酸丁香酚酯各1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋配制成1.0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液混合中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液混合中間液40 μL、80 μL、200 μL、300 μL、400 μL，用鯽魚空白基質(zhì)液稀釋配制成0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.15 mg·L-1、0.20 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 樣品前處理

準(zhǔn)確取2 g樣品置于50 mL的離心管中，加入20 mL乙腈，4 g氯化鈉，5 g無(wú)水硫酸鎂，用均質(zhì)器勻漿。以5 000 r·min-1離心3 min，取上清液，加入5 mL用乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻。再以5 000 r·min-1離心3 min，棄去上層正己烷溶液。將乙腈層于40 ℃氮吹，用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 儀器條件

氣相條件：進(jìn)樣口溫度：250 ℃；取樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；溫度程序：起始60 ℃維持1 min，以40 ℃·min-1的速率上升至180 ℃，以20 ℃·min-1的速度升至260 ℃。質(zhì)譜條件：離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子轟擊源能量：70 eV；溶劑延遲時(shí)間：5 min。6種丁香酚類化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Word 2007、Excel 2007、Photoshop CC2017軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

參考《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測(cè)定》（BJS 201908）中儀器條件，對(duì)氣相條件進(jìn)行優(yōu)化。如圖1所示，通過(guò)優(yōu)化初始溫度和升溫速率，6種丁香酚類化合物可以達(dá)到良好的分離效果且分析時(shí)間較短。

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

由于丁香酚類化合物溶于有機(jī)溶劑，本研究分別考察了乙腈、丙酮、乙酸乙酯和乙醇4種提取溶劑對(duì)丁香酚類化合物回收率的影響。如圖2所示，提取溶劑為乙醇時(shí)，丁香酚類化合物的回收率最低；當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯時(shí)，6種丁香酚類化合物的回收率在66.4%～70.5%，提取效果較差；而在采用乙腈和丙酮作為提取溶劑時(shí)，6種丁香酚化合物的回收率均大于80%。相較于丙酮處理的樣本，使用乙腈所得樣本中的雜質(zhì)含量較低。因此，本研究選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 提取過(guò)程的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)將樣品以15 000 r·min-1勻漿2 min后進(jìn)行提取，并與BJS 201908標(biāo)準(zhǔn)中的提取方法進(jìn)行回收率比較實(shí)驗(yàn)。由圖3可知，相較于優(yōu)化前，優(yōu)化樣品提取過(guò)程后，6種丁香酚類化合物回收率較高，穩(wěn)定性較好。其主要原因是優(yōu)化后的提取方法可以保證樣品充分浸潤(rùn)和混勻，以縮短提取時(shí)間，并提升提取效果。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

采用優(yōu)化后的儀器條件，將1.4.1配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，6種丁香酚化合物在0.02～0.20 mg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999；6種丁香酚化合物的檢出限為0.01 mg·kg-1，滿足丁香酚類化合物檢測(cè)要求。

2.5 方法的回收率和精密度

對(duì)鯽魚樣品進(jìn)行加標(biāo)（加標(biāo)水平為0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1）回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次。由表3可知，6種丁香酚化合物的回收率為82.4%～106.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明此方法準(zhǔn)確度和回收率高，重復(fù)性好。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

按照本研究?jī)?yōu)化方法對(duì)采集的200批次淡水魚產(chǎn)品（包括魚、鱸魚、鯽魚等16個(gè)品種）進(jìn)行丁香酚化合物殘留檢測(cè)分析。由表4可知，60批次水產(chǎn)品中檢出丁香酚化合物，檢出率為30.00%，其中，鰱魚、鱸魚、草魚、大頭魚、鳊魚、包頭魚、黑魚和鯽魚中均有丁香酚類化合物檢出，鰱魚、鱸魚、草魚的檢出率較高，分別為80.00%、72.41%和55.56%。表明淡水魚中存在較為嚴(yán)重的丁香酚化合物殘留問(wèn)題，相關(guān)監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品養(yǎng)殖、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)的監(jiān)督檢查，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。此外，草魚最高檢出濃度為5.60 mg·kg-1，是檢出限（0.01 mg·kg-1）的560倍；鱸魚最高檢出濃度為4.40 mg·kg-1，是檢出限的440倍。而鱸魚的檢出率與檢出濃度偏高，可能與它的市場(chǎng)價(jià)值有關(guān)，由于鱸魚需求旺盛且價(jià)格較高，一些商家傾向于添加漁用麻醉劑來(lái)提高其存活率，從而獲得更高的經(jīng)濟(jì)回報(bào)。

3 結(jié)論

本研究建立了一種快速測(cè)定淡水魚中丁香酚類化合物殘留的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法。該方法在0.02～0.20 mg·L-1線性關(guān)系良好，回收率在82.4%～106.0%，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)單、可大批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本方法可以對(duì)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和流通環(huán)節(jié)水產(chǎn)品中的丁香酚類化合物殘留進(jìn)行快速檢測(cè)和分析，這有助于指導(dǎo)養(yǎng)殖戶和水產(chǎn)商合理使用藥物，并制定適當(dāng)?shù)男菟幤谝钥刂茪埩羲?，進(jìn)而提升淡水魚產(chǎn)品安全水平。此外，該技術(shù)為加強(qiáng)食品安全的抽檢監(jiān)測(cè)和日常監(jiān)管提供了有力的支持，確保了監(jiān)管工作的針對(duì)性、有效性和系統(tǒng)性，對(duì)實(shí)現(xiàn)食品安全治理的精準(zhǔn)化和科學(xué)化起到了促進(jìn)作用。

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作者簡(jiǎn)介：魏琴芳（1993—），女，浙江杭州人，本科，工程師。研究方向：食品安全與檢測(cè)。

通信作者：邢峰（1986—），男，浙江衢州人，碩士，高級(jí)工程師。研究方向：食品安全與檢測(cè)。E-mail： xingff_1986@163.com。