YY1對膠質瘤細胞遷移能力的影響及其分子機制

［摘要］目的探討轉錄因子陰陽1（YY1）對膠質瘤細胞遷移的影響及其分子機制。

方法體外培養人膠質瘤細胞U251和U87，對細胞過表達或敲低YY1后，通過Transwell實驗、細胞劃痕實驗、克隆形成實驗檢測過表達或敲低YY1對膠質瘤細胞U251和U87遷移的影響；通過基因轉錄調控數據庫（GTRD）預測YY1下游靶基因，應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白印跡實驗檢測YY1下游靶基因基質金屬蛋白酶15（MMP15）mRNA及其蛋白的表達情況；利用雙熒光素酶報告實驗檢測YY1與MMP15啟動子的結合區域。通過Transwell實驗、細胞劃痕實驗、克隆形成實驗檢測過表達HA-YY1的同時敲低MMP15對膠質瘤細胞U251和U87遷移的影響。

結果Transwell實驗結果表明，與未過表達HA-YY1的對照組相比，過表達HA-YY1組U251和U87細胞的遷移能力顯著提高（t=13.300、5.847，P<0.05）；劃痕實驗結果顯示，過表達HA-YY1組U251和U87細胞的劃痕間距較對照組明顯變?。╰=9.698、7.215，P<0.05）；克隆形成實驗結果顯示，過表達HA-YY1組U251和U87細胞的克隆形成能力較對照組顯著提高（t=5.871、5.095，P<0.05）；雙熒光素酶報告實驗顯示，YY1能夠直接結合到MMP15的啟動子區域，并促進MMP15的表達；而敲低MMP15可以抑制由于YY1過表達而促進的細胞遷移。

結論YY1通過轉錄激活MMP15促進膠質瘤細胞遷移。

［關鍵詞］膠質母細胞瘤；YY1轉錄因子；基質金屬蛋白酶15；細胞運動

［中圖分類號］R34

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0501-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.134

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240927.1331.001;2024-09-2909：18：45

Effect of Yin Yang 1 on the migration ability of gliomacells and its molecular mechanismXIE Ranran， LUZhimin， ZHAO Gao-xiang

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of the transcription factor Yin Yang 1 （YY1） on the migration of glioma cells and its molecular mechanism.

MethodsHuman glioma U251 and U87 cells were cultured in vitro， and after the overexpression or knockdown of YY1， Transwell assay， cell scratch assay， and colony formation assay were used to observe the effect of YY1 overexpression or knockdown on the migration of glioma U251 and U87 cells. The Gene Transcription Regulation Database was used to predict the downstream targetgenes of YY1， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of matrix metalloproteinase 15 （MMP15）， a downstream target gene of YY1. Dual-luciferase reporter assay was used to investigate the binding region between YY1 and MMP15 promoter.Transwell assay， cell scratch assay， and colony formation assay were used to investigate the effect of HA-YY1 overexpression and MMP15 knockdown on the migration of glioma U251 and U87 cells.

ResultsTranswell assay showed that compared with the control group without HA-YY1 overexpression， the HA-YY1 overexpression group had a significant increase in the migration ability of U251 and U87 cells （t=13.300，5.847;P<0.05）. Cell scratch assay showed that the HA-YY1 overexpression group had a significant reduction in scratch spacing （t=9.698，7.215;P<0.05）. Colony formation assay showed significant increases in the colony formation ability of U251 and U87 cells with HA-YY1 overexpression （t=5.871，5.095;P<0.05）. Dual-luciferase reporter assay showed that YY1 could directly bind to the promoter region of MMP15 and promote the expression of MMP15， while knockdown of MMP15 could inhibit cell migration promoted by YY1 overexpression.

ConclusionYY1 promotes the migration of glioma cells through transcriptional activation of MMP15.

［Key words］glioblastoma; YY1 transcription factor; matrix metalloproteinase 15; cell movement

膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的具有高度侵襲性的原發性惡性腦腫瘤 [1-3]，其具有的強大的血管生成能力、抗輻射性和侵襲性使其成為最致命的癌癥之一[4]。轉錄因子陰陽1（YY1）是一種在進化上非常保守的含有C2H2鋅指結構的雙功能轉錄因子[5-7]，在人類組織中廣泛表達，并參與控制多種細胞機制，其中最顯著的是YY1在細胞中分別以轉錄激活子和轉錄抑制子來發揮作用[7-8]。越來越多的研究表明，YY1在腦膠質瘤等許多癌癥細胞中高度表達，并對癌癥進展起著至關重要的作用[9-10]?；|金屬蛋白酶（MMPs）是一個與Zn2+結合并具有Ga2+依賴性的蛋白酶家族[11]，能夠促進細胞增殖、遷移和分化，并在細胞凋亡、血管生成、組織修復和免疫應答中發揮關鍵作用[12]。基質金屬蛋白酶15（MMP15）屬于膜錨定MMPs（MT-MMP），可能與功能調節或定位相關的細胞內蛋白相互作用[13]。本研究探討YY1促進腦膠質瘤細胞遷移的分子機制，現將結果報告如下。

1資料和方法

1.1實驗材料

人腦膠質瘤細胞U87、U251（ATCC），DMEM培養基（Hyclone），胎牛血清（Gibco），鏈霉素和青霉素（Gibco），質粒pcDNA3.1-HA-YY1、PLKO-shMMP15、PLKO-shYY1均為自己構建，轉染試劑H4000（英格恩生物公司Engreen Biosystem Co，Ltd.），Trizol試劑（思科捷），逆轉錄酶試劑盒（碧云天），BCA蛋白質定量試劑盒（諾唯贊），MMP15抗體（ABclonal），YY1（Santa Cruz），β-肌動蛋白（β-Actin）抗體（美國CST公司），二抗（美國CST公司），ECL試劑盒（雅酶生物）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養人腦膠質瘤細胞系U87、U251細胞加入含體積分數0.10胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 kU/L青霉素的DMEM培養液，在含體積分數0.05 CO2的37 ℃培養箱中培養。每隔1 d觀察細胞生長狀況并進行傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2質粒構建分子克隆構建質粒pcDNA3.1-HA-YY1、PLKO-shMMP15、PLKO-shYY1及其相應的陰性對照質粒。所用引物及其序列見表1。

1.2.3細胞轉染在細胞培養密度至70%～80%時用轉染試劑H4000將質粒轉染進入細胞中，轉染后8 h換液，48 h后進行下一步實驗。

1.2.4基因的過表達與敲除在細胞生長密度達70%～80%時使用H4000轉染試劑將構建好的質粒pcDNA3.1-HA-YY1轉染進入細胞中使其表達（過表達）；將PLKO-shYY1、PLKO-shMMP15質粒轉染進入細胞使其表達（相關基因被敲低），以轉染PLKO.1質粒作為對照。

1.2.5蛋白質印跡法從細胞中收集總蛋白，用BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度，然后用SDS-PAGE電泳分離蛋白質并將其轉移到PVDF膜上。用50 g/L 脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入抗MMP15、YY1、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，然后將膜與相應種屬的二抗在室溫共同孵育1 h，最后用ECL試劑盒檢測蛋白質條帶。

1.2.6細胞計數將培養皿中的貼壁細胞用胰酶消化，離心，用1 mL DMEM培養液重懸細胞并吹打混勻，取10 μL細胞懸液加入90 μL的1×PBS溶液吹打混合均勻，然后加入細胞計數板中進行細胞計數。

1.2.7Transwell實驗細胞轉染48 h后，用胰酶消化細胞，調整細胞密度為2×108/L。隨后取180 μL細胞懸液加入涂有基質膠的小室中，在下室中加入含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養液600 μL，將小室放入下室中，一起放入37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養48 h。隨后取出小室擦掉內層基質膠，1×PBS溶液清洗后用40 g/L多聚甲醛固定1 h，再用結晶紫染色20 min，最后在顯微鏡下拍照并計數，觀察細胞侵襲能力。

1.2.8細胞劃痕實驗在轉染后的細胞生長至100%之后，用20 μL槍頭垂直在細胞表層劃線形成劃痕，隨后用無菌1×PBS溶液清洗劃下的細胞，使留下的劃痕肉眼清晰可見，然后更換新鮮無血清培養液，在37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養，分別在培養0、48 h時顯微鏡下拍照并測量劃痕寬度。

1.2.9平板克隆形成實驗將轉染后的細胞制成細胞懸液，計數后取300個細胞接種于含有DMEM培養液的6孔板中，培養10～14 d，直至6孔板中出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養。倒掉培養液，用1×PBS溶液洗2遍；隨后用40 g/L多聚甲醛固定1 h，1×PBS洗3次；結晶紫染色20 min，1×PBS溶液洗3次。最后計數形成的克隆。

1.2.10實時熒光定量PCR（qRT-PCR）用Trizol試劑提取總RNA，隨后用逆轉錄酶試劑盒逆轉錄得到cDNA，以其作為模板行qRT-PCR檢測MMP15 mRNA表達。用β-Actin作為內參基因，采用比較閾值法進行結果分析，結果以2-△△CT表示。所用引物及其序列見表2。

1.2.11雙熒光素酶活性檢測使用JASPER（jaspar.elixir.no）網站預測YY1和 MMP15 的啟動子之間的結合位點，將擴增的MMP15基因啟動子片段插入pGL3-basic載體中以構建野生型（WT）質粒pMMP15-WT，并將MMP15基因啟動子突變序列（CTTGGCAATCTG）插入到pGL3-basic 載體中以構建突變型（MUT）質粒pMMP15-MUT。再使用H4000將構建的野生型質粒pMMP15-WT和突變型質粒pMMP15-MUT分別轉染入細胞，同時分別轉染HA-YY1質粒并以轉染了pcDNA3.1質粒的細胞作對照，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測轉染48 h后報告基因的活性，同時參考海腎螢光素酶活性進行結果分析。

1.3統計學分析

采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行統計學分析。計量資料用±s表示，數據間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1YY1對腦膠質瘤細胞遷移的影響

蛋白印跡法檢測結果顯示，U251、U87細胞轉染HA-YY1以及shYY1可分別有效過表達和敲除YY1（圖1A、B）。Transwell實驗結果顯示，U251、U87細胞過表達HA-YY1組穿過小室的細胞數量與未過表達HA-YY1的對照組相比明顯增多（t=13.300、5.847，P<0.05；圖1C）；而敲低細胞中的YY1后，穿過小室的細胞數量與未敲低YY1的對照組相比則明顯減少（t=13.970、5.284，P<0.05；圖1D）。細胞劃痕實驗結果顯示，過表達HA-YY1后，U251、U87細胞的遷移速度與未過表達HA-YY1的對照組相比變快（t=9.698、7.215，P<0.05；圖1E）；而敲低YY1后，U251、U87細胞的遷移速度則明顯變慢（t=7.137、15.220，P<0.05；圖1F）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，過表達HA-YY1組形成的細胞克隆數量與未過表達HA-YY1的對照組相比較明顯增多（t=5.871、5.095，P<0.05；圖1G）；而YY1敲除組細胞克隆形成數量明顯較對照組減少（t=4.349、8.786，P<0.05；圖1H）。

2.2YY1對MMP15表達影響

通過基因轉錄調控數據庫（GTRD數據庫）預測出YY1可能的下游靶基因為EGFR、Wnt6、BCAT1、ATG4D、MMP15、FKBP3。qRT-PCR方法驗證顯示，過表達HA-YY1的U251和U87細胞中MMP15的表達明顯上調（t=4.605、3.354，P<0.05；圖2A），而敲除YY1則會顯著下調U251和U87細胞中MMP15 mRNA的表達（t=12.630、9.235，P<0.05；圖2B）；蛋白質印跡實驗結果顯示，U251和U87細胞中過表達HA-YY1導致MMP15表達量上升（圖2C），而敲除YY1則會導致MMP15表達量下降（圖2D）。

2.3YY1結合MMP15的啟動子區域對MMP15轉錄的影響

雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與同時轉染了pMMP15-MUT質粒和HA-YY1質粒的對照組相比較，轉染了pMMP15-WT質粒和HA-YY1質粒的細胞相對熒光素酶活性有顯著提高（t=14.610、40.490，P<0.05）。見圖3。

2.4YY1上調MMP15表達對膠質瘤細胞遷移的影響

在U251和U87細胞中過表達HA-YY1的同時敲低MMP15，蛋白印跡法檢測結果顯示，YY1明顯過表達而MMP15明顯被敲低（圖4A）。Transwell實驗結果顯示，過表達HA-YY1而敲低MMP15后穿過小室的細胞數量較過表達HA-YY1而未敲低MMP15組有明顯減少（t=7.279、28.020，P<0.05；圖4B）。劃痕實驗結果顯示，過表達HA-YY1而敲低MMP15能夠顯著地抑制細胞的遷移（t=7.063、5.261，P<0.05；圖4C）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，與僅過表達HA-YY1組相比較，過表達HA-YY1而敲低MMP15組的克隆形成能力明顯減弱（t=3.189、4.461，P<0.05；圖4D）。

3討論

GBM為惡性腦腫瘤，具有高發病率和高死亡率的特點[14]。目前已經有很多關于膠質瘤發生發展機制及影響因素的研究。XU等[15]研究顯示，Slit2/Lobo1信號能夠通過Cdc42 GTP的失活抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲；CHAO等[16]研究結果顯示，Sry相關基因（Sox）家族轉錄因子Sox9能夠促進膠質瘤細胞的遷移和侵襲。LI等[17]研究結果表明，LncRNA有望成為膠質瘤治療的生物標志物。

YY1為雙功能轉錄因子，根據其啟動子環境、染色質結構和相互作用蛋白的不同，可以作為激活子、抑制子或啟動子結合蛋白發揮作用[18]。有研究表明，YY1在結直腸癌、膠質瘤、前列腺癌、宮頸癌等癌癥的發展中主要起促進作用[19-22]，在胰腺癌中A：蛋白印跡法檢測U251及U87細胞過表達HA-YY1轉染效率；B：蛋白印跡法檢測敲低U251及U87細胞中YY1轉染效率；C：Transwell實驗檢測細胞中過表達HA-YY1對細胞遷移速率的影響；D：Transwell實驗檢測細胞中敲低YY1對細胞遷移速率的影響；E：細胞劃痕實驗檢測細胞中過表達HA-YY1對細胞遷移速率的影響；F：細胞劃痕實驗檢測細胞中敲低YY1對細胞遷移速率的影響；G：克隆形成實驗檢測細胞中過表達HA-YY1對細胞遷移速率的影響；H：克隆形成實驗檢測細胞中敲低YY1對細胞遷移速率的影響。*P<0.05。

A：qRT-PCR檢測U251和U87細胞中過表達HA-YY1后MMP15 mRNA的表達；B：qRT-PCR檢測U251和U87細胞中敲低YY1后MMP15 mRNA的表達；C：蛋白印跡法檢測U251和U87細胞中過表達HA-YY1后MMP15的表達；D：蛋白印跡法檢測U251和U87細胞中敲低YY1后MMP15的表達。*P<0.05。

A：熒光素酶報告質粒構建示意圖，序列為JASPER軟件預測YY1與MMP15的結合位點；B：在U251細胞中分別轉染pMMP15野生型質粒和突變型質粒，同時分別轉染HA-YY1質粒，以轉染pcDNA3.1質粒為對照，qRT-PCR檢測熒光素酶活性；C：在U87細胞中分別轉染pMMP15野生型質粒和突變型質粒，同時分別轉染HA-YY1質粒，以轉染pcDNA3.1質粒為對照，qRT-PCR檢測熒光素酶活性。*P<0.05。

主要起抑制作用[23]，而在乳癌、肺癌等少數癌癥中既起促進的作用又起抑制的作用。目前，對于YY1促進腦膠質瘤發展作用機制的研究更多地集中在miRNA、長鏈非編碼RNA（lncRNA）上，例如miR-218、lncRNA SNHG5、lncRNA SNHG17、lncRNA LINC00466、lncRNA KB-1460A1.5、Circular RNA circ_0001588以及NF-κB家族成員RelB等，都被發現在膠質瘤細胞中能夠與YY1發生相互作用進而影響膠質瘤的進展[4，14，17，24-25]。而本研究發現，YY1能夠促進MMPs家族成員MMP15的表達，進

A：蛋白印跡檢測U251及U87細胞中過表達HA-YY1的同時敲低MMP15轉染效率；B：Transwell實驗檢測過表達HA-YY1的同時敲低MMP15對細胞遷移能力的影響；C：細胞劃痕實驗檢測過表達HA-YY1的同時敲低MMP15對細胞遷移能力的影響；D：克隆形成實驗檢測過表達HA-YY1的同時敲低MMP15對細胞遷移能力的影響。*P<0.05。

而促進膠質瘤細胞的遷移。

本研究首先在膠質瘤細胞U251和U87中過表達HA-YY1，然后應用Transwell實驗、細胞劃痕實驗、克隆形成實驗檢測過表達HA-YY1對膠質瘤細胞遷移的影響，結果顯示過表達HA-YY1能夠顯著促進膠質瘤細胞的遷移，而敲低YY1會抑制膠質瘤細胞的遷移，表明YY1通過促進膠質瘤細胞遷移來促進膠質瘤發展。那么YY1又是如何促進細胞遷移的呢？本文通過GTRD數據庫預測出YY1下游

靶基因為EGFR、Wnt6、BCAT1、ATG4D、MMP15、FKBP3，由于MMPs能夠促進細胞增殖、遷移和分化[12]，猜測YY1是通過調節MMP15來促進細胞

遷移的。于是本研究通過qRT-PCR方法及蛋白質

印跡實驗檢測YY1是否會影響MMP15的表達，結果顯示，YY1能夠明顯上調MMP15的表達，提示MMP15可能是YY1的下游靶基因；進一步研究顯示，YY1能夠作為轉錄因子通過與MMP15的啟動子區域結合進而上調MMP15的表達。鑒于YY1既可以促進膠質瘤細胞遷移又可以促進MMP15表達，本文接下來探究MMP15敲低后是否會抑制YY1對膠質瘤細胞遷移的促進作用。本文研究在U251和U87細胞中過表達HA-YY1的同時敲低MMP15來驗證YY1是否是通過調節MMP15的表達來促進膠質瘤細胞的遷移，結果顯示，敲低MMP15會抑制YY1過表達引起的促細胞遷移。

綜上所述，YY1能夠作為轉錄因子直接結合到MMP15的啟動子區域，進而上調MMP15的表達，最終促進膠質瘤細胞的遷移。本研究發現了YY1促進膠質瘤進展的一種新的分子機制，為膠質瘤的治療提供了一個新的可能的方向。

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（本文編輯黃建鄉）