骨髓增生性腫瘤病人JAK-2和CALR基因表達及其與預后關系

［摘要］目的探討骨髓增生性腫瘤（MPN）病人JAK-2和CALR基因表達及其與預后的關系。

方法選取2018年7月—2022年7月石家莊市人民醫(yī)院收治的38例MPN病人納入研究組，另選取本院無血液系統疾病志愿者40例納入對照組，采用實時熒光定量PCR技術檢測兩組骨髓液JAK-2與CALR基因表達。根據預后評價標準將研究組再分為低危組、中危組及高危組3個亞組，比較各亞組病人JAK-2與CALR基因表達，并采用Spearman相關性分析兩基因表達與預后的關系。

結果相較于對照組，MPN各亞組JAK-2與CALR基因表達顯著升高（F=278.674、615.206，P<0.05），其中以原發(fā)性血小板增多癥的兩基因表達最高。隨著預后評定級別由低危組到高危組轉變，MPN病人兩基因表達逐漸升高，且Spearman相關性分析顯示，兩基因表達均與病人預后呈顯著負相關（r=－0.491、－0.503，P<0.01）。

結論MPN病人JAK-2與CALR基因表達異常升高，且其表達水平與預后呈負相關，臨床可據此評估MPN病人的療效及預后。

［關鍵詞］骨髓腫瘤；原發(fā)性骨髓纖維化；真性紅細胞增多癥；血小板增多，原發(fā)性；Janus激酶2；鈣網蛋白；基因表達；預后

［中圖分類號］R733.3;R394.3

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0561-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.115

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1446.007;2024-08-3019：15：24

The expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with myeloproliferative neoplasms and their association with prognosis

LI Suxin， WANG Youjun， FENG Liqian， WANG Miao， LI Dongliang， WEN Wen

（Department of Hematology， Shijiazhuang People’s Hospital，Shijiazhuang 050000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with myeloproliferative neoplasms （MPN） and their association with prognosis.

MethodsA total of 38 patients with MPN who were admitted to Shijia-

zhuang People’s Hospital from July 2018 to July 2022 were enrolled as study group， and 40 volunteers without hematological diseases in our hospital were enrolled as control group. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of the JAK-2 and CALR genes in bone marrow fluid. According to the criteria for prognostic evaluation， the patients in the study group were further divided into low-risk subgroup， intermediate-risk subgroup， and high-risk subgroup. The expression levels of the JAK-2 and CALR genes were compared between the three subgroups， and a Spearman correlation analysis was used to investigate the correlation of the expression levels of the JAK-2 and CALR genes with prognosis.

ResultsCompared with the control group， each subgroup of the MPN group had significant increases in the expression levels of the JAK-2 and CALR genes （F=278.674，615.206;P<0.05）， with the highest expression levels of the two genes in patients with essential thrombocythemia. For the patients with MPN， there were gradual increases in the expression levels of the JAK-2 and CALR genes from the low-risk group to the high-risk group， and the Spearman correlation analysis showed that the expression levels of the JAK-2 and CALR genes were significantly negatively correlated with the prognosis of patients （r=-0.491，-0.503;P<0.01）.

ConclusionThere are abnormal increases in the expression of the JAK-2 and CALR genes in patients with MPN， and the expression levels of the two genes are negatively correlated with prognosis. Therefore， they can be used to assess the treatment outcome and prognosis of MPN patients in clinical practice.

［Key words］bone marrow neoplasms; primary myelofibrosis; polycythemia vera; thrombocythemia， essential; janus kinase 2; calreticulin; gene expression; prognosis

骨髓增生性腫瘤（MPN）是一組異質性造血系統疾病，包括骨髓纖維化（MF）、真性紅細胞增多癥（PV）和原發(fā)性血小板增多癥（ET）[1-3]。其中，PV和ET在臨床上還具有較高的合并血栓出血性并發(fā)癥風險[4]。此外，MPN的發(fā)病機制比較復雜，多種基因突變可能影響病人的預后[5]。近年來國內外研究顯示，Janus激酶2（JAK-2）和鈣網蛋白（CALR）等基因突變可作為MPN發(fā)病的“驅動”突變，而相應的基因靶向藥物治療可有效改善病人臨床癥狀和生活質量[6-8]。然而，關于JAK-2和CALR基因表達與MPN病人預后相關性的研究相對較少。因此，本研究采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測不同風險以及不同類型MPN病人JAK-2及CALR基因表達，旨在探討二者表達與病人預后相關性。現將結果報告如下。

1資料與方法

1.1研究對象

按照納入和排除標準，將2018年7月—2022年7月石家莊市人民醫(yī)院收治的38例MPN病人納入研究組，其中男性21例、女性17例，年齡41～65歲，平均（51.33±5.74）歲。按照相關診斷標準將MPN病人分為PV組、ET組和MF組等3個亞組，其中PV組16例、ET組17例、MF組5例。納入標準：①符合WHO及NCCN制定的MPN診斷標準[9-10]；②了解本研究內容并接受相關檢查者；③無認知障礙及精神疾病；④自愿簽署知情同意書。排除標準：①合并骨髓增生異常綜合征（MDS）、慢性髓系白血病（CML）、凝血-纖溶障礙等其他血液系統疾病；②臨床資料不全及不配合相應檢查者；③合并嚴重心、肺、肝、腎功能障礙者。同時，按照年齡±2歲和男女構成比±5%的標準選取本院無血液系統疾病志愿者40例納入對照組。兩組研究對象體質量指數（BMI）、合并基礎疾病等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審核通過。

1.2研究方法

1.2.1JAK-2和CALR基因表達的RT-PCR檢測

全部受試者均于髂后上棘行骨髓穿刺術采集骨髓液2 mL，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，置于4 ℃低溫保存。按GenBank登錄的JAK-2（NM_214113.1）和CALR（NM_004343.3）的序列，應用DNA Star、Primer 5.0軟件設計相應的特異性引物。JAK-2和CALR引物及其序列見表2。引物由哈爾濱賽拓生物技術有限公司合成。骨髓液在分離單個核細胞、提取DNA片段后采用RT-PCR檢測JAK-2和CALR基因初始拷貝數（即表達量）。所有檢測均由本院檢驗科完成。

1.2.2MPN預后分組方法根據MPN病人的預后評價標準分為低危組、中危組和高危組3個亞組。根據PV、ET和MF包含基因突變特征的國際預后評價系統（MIPSS）[11-12]標準進行預后判斷。PV：①低危（0～1分），②中危（2～5分），③高危（≥6分）；ET：①低危（0～1分），②中危（2～3分），③高危（≥4分）；MF（MIPSS-70）[12]：①低危（0～1分），②中危（2～4分），③高危（≥5分）。

1.3統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。計量資料數據以±s形式表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析；計數資料數據以例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman秩相關分析JAK-2和CALR基因表達與MPN預后的相關性。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1各組JAK-2及CALR基因表達比較

相較于對照組，MPN各亞組JAK-2和CALR基因表達均明顯升高，差異具有統計學意義（F=278.674、615.206，P<0.001）。此外，采用Bonferroni法比較MPN各亞組JAK-2和CALR基因表達的結果顯示，ET組JAK-2和CALR基因表達水平均明顯高于PV組及MF組，差異均具有統計學意義（t=5.098～11.877，P<0.05）。提示JAK-2和CALR基因異常表達與MPN發(fā)病相關。見表3。

2.2不同預后病人JAK-2及CALR表達比較

依據PV、ET和MF預后評價標準，將MPN病人分為低危組19例、中危組10例和高危組9例。隨著MPN病人預后危險度升級，JAK-2及CALR基因表達均逐漸升高，差異具有統計學意義（F=65.294、55.950，P<0.05）。此外，采用Bonferroni法比較MPN不同預后各亞組JAK-2和CALR基因表達的結果顯示，高危組JAK-2和CALR基因表達均明顯高于低危組及中危組，差異具有統計學意義（t=2.762～6.278，P<0.05）。提示MPN病人JAK-2和CALR基因表達與其預后相關。見表4。

2.3JAK-2和CALR表達與MPN預后相關性

將MPN預后3個亞組中的低危組賦值為0、中危組為1、高危組為2，對病人預后與JAK-2和CALR基因表達進行Spearman相關性分析。結果顯示，MPN病人預后與JAK-2和CALR基因表達均呈負相關，差異均具有統計學意義（r=－0.491、－0.503，P<0.05）。提示MPN病人JAK-2和CALR基因表達越高其預后越差。

3討論

既往國內外的研究表明，多種基因突變參與了MPN疾病的發(fā)生與發(fā)展，其中以JAKs及CLAR基因最為常見[4，12-14]。JAK作為蛋白絡氨酸激酶，共包含JAK-1、JAK-2、JAK-3和JAK-4等4種，其活性調節(jié)主要依靠自身磷酸化及與作用蛋白相結合，其中JAK-2突變多會影響骨髓造血細胞的信號通道，以JAK2-V617F基因突變率最高，會引起血脂檢查異常，促進血栓形成、繼發(fā)骨髓纖維化等；CALR基因常由于第9外顯子體細胞發(fā)生突變，影響細胞糖蛋白合成，導致糖蛋白折疊異常、鈣離子動態(tài)失衡，進而誘導細胞異常增殖、分化及凋亡[15-19]。當前關于JAK-2及CALR基因與MPN病人預后關系的研究主要集中在有無突變本身，而鮮有研究報道MPN病人JAK-2及CALR基因表達與其預后的關系。因此，本研究旨在探討MPN病人骨髓液單個核細胞中JAK-2及CALR基因的總體表達及其與預后之間的關系。

本研究結果表明，與對照組相比較，MPN病人JAK-2及CALR基因表達水平顯著升高，且不同疾病類型其基因表達不同，其中ET病人JAK-2及CALR基因表達水平相較PV和MF病人更高，提示JAK-2及CALR基因異常表達可能更多地參與了ET的發(fā)生與發(fā)展，這一結果與外國相關研究結果相類似[20-22]。在機制上，有研究顯示MPN病人中性粒細胞和血小板中的JAK-2激酶是與細胞因子和生長因子受體結構域關聯的酪氨酸激酶，它與血小板表面P-選擇蛋白和多形核白細胞表面活化標記物的表達增加有關[23]。JAK-2表達量增加、功能過度活躍可使它與下游的髓樣細胞因子受體EPOR、G-CSFR等結合，誘導受體發(fā)生構象改變；激活的JAK-2通過其受體磷酸化后作用于其他信號分子（如信號傳導及轉錄激活蛋白），使后者發(fā)生磷酸化，誘導它們的同源或異源二聚化，并隨后運輸至細胞核，調節(jié)其靶基因的轉錄，從而促進細胞的生長[24-26]。而CALR作為內質網的分子伴侶，與ER中血小板生成素受體細胞外結構域的N-糖基化殘基相結合，通過新的C末端及其正電荷加強，導致受體被激活，參與N-糖基化蛋白質和鈣儲存的質量控制，誘導單核細胞分泌細胞因子，促進細胞的生長[27]。本研究結果還顯示，JAK-2及CALR基因表達與MPN病人不同預后亞組均呈顯著負相關，即隨著病人預后分級由低危組向高危組轉變其基因表達隨之升高，提示早期針對JAK-2或CALR基因的干預性治療可能有效控制病人預后向高危轉化，這與相關治療學研究結論相一致[28-29]。

本研究尚存在一定局限性，主要是由于納入樣本單一且量有限，研究數據及臨床數據可能存在偏差，對研究結果可靠性存在影響；選取JAK-2和CALR基因表達作為研究項目，兩者均與MPN密切相關，但尚未深入探究三者間聯系、機制等。因此，尚需進一步擴大樣本量及樣本來源、深入探究其作用機制，以得到更具有前瞻性、客觀性的結果。

綜上所述，MPN病人JAK-2和CALR基因表達異常升高，而且其表達與預后呈顯著負相關，臨床可據此評估MPN病人的療效及預后。

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（本文編輯于國藝）