黃唇魚致病性哈維氏弧菌的分離與鑒定

摘 要：2023年3—5月，廣東省惠州市一方海（廣東）海洋牧場有限公司所繁育的黃唇魚（Bahaba taipingensis）出現發病和死亡的現象，癥狀主要為食欲下降，凸眼，尾鰭和背鰭出現出血，且腹腔有腹水，內臟部位附近出現充血，此外其他部位均正常，無其他明顯病癥。為確定其病因，采集死亡病魚的心臟、脾臟、肝臟、頭腎、中腎等組織樣品，通過對分離純化的優勢菌株的形態特征、16S rRNA基因序列進行綜合分析，大部分組織樣品均發現哈維氏弧菌，由此初步確定此次引發黃唇魚死亡的菌株為哈維氏弧菌。

關鍵詞：黃唇魚；哈維弧菌；細菌分離鑒定

中圖分類號：S943 文獻標志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）07–000-03

黃唇魚（Bahaba taipingensis），又稱白花魚、金錢鮸、黃甘等，屬硬骨魚綱鱸形目石首魚科，系近海底層暖溫性魚類，屬于我國特有魚種，其分布地主要在廣東省珠江口岸。2021年，黃唇魚被列為國家一級重點保護水生野生動物[1]。因此，開展黃唇魚生物學和病害防控等相關研究，對恢復黃唇魚資源、保護生物多樣性及海洋生態環境具有重大意義。

弧菌是海洋環境中常見的細菌種群之一，廣泛分布于海灣、近岸、河口等海域[2]。弧菌屬種類繁多，主要致病弧菌有哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、霍亂弧菌等[3]。其中，哈維氏弧菌是水產養殖中較為常見的致病菌，其引起的癥狀主要有腸炎病、潰爛病、出血病、癤瘡病、敗血病、腹水病、潰爛病等[4]。例如，2015年山東省某地混合養殖的石斑魚中曾被報道因感染哈維氏弧菌而暴發石斑魚皮膚潰瘍病，出現厭食、眼球突出、體表出血的癥狀[5]。

隨著海水養殖的規模不斷擴大和密度的增加，水產養殖疾病頻發，甚至整個水產養殖行業疾病發生規模呈逐年上漲的態勢。基于此，以廣東省惠州市一方海（廣東）海洋牧場有限公司為例，研究2023年入夏以來其所繁育的黃唇魚出現的發病和死亡的情況，發病黃唇魚的尾鰭和背鰭均有出血的癥狀，腹腔存在腹水，這與哈維弧菌感染的出血癥狀極其相似。通過對其進行細菌培養，并利用現代分子學手段進行檢測，以期確認具體的致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2023年3—5月，采集發病黃唇魚樣本共20尾，解剖后發現，其魚體尾鰭和背鰭出現出血癥狀、腹腔有腹水、內臟部位沒有明顯病癥。并將一小部分魚組織用95%無水乙醇保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌分離與純化

首先，將剪刀、鑷子、接種環等工具進行消毒滅菌，待病魚解剖后，使用接種環在其腦、肝、脾、腎等組織內蘸取少量組織液，并將組織液放在固體LB培養基（鹽度為2%）中進行劃線接種，溫度保持在37 ℃，培養12 h。

其次，將培養后的菌落形態進行對比，挑選出不同形態的菌落，且挑選的菌落必須在培養基中數量較多（數量較多的為優勢菌落）。然后用接種環蘸取一小部分優勢菌落移入至0.9%的生理鹽水中稀釋10 000倍，并采取三線法進行平板劃線，隨后繼續培養12 h。

最后，用接種環蘸取純化培養后的細菌，并置于LB液體培養基，搖菌12 h，直至出現明顯渾濁。其中一部分用于后續提取DNA，剩余部分用30%甘油進行保種，并置于80 ℃的環境中備用。

1.2.2 細菌DNA提取

用無菌剪刀和鑷子分離病魚組織樣品，使用DNA提取試劑盒提取組織樣品總DNA。運用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測，采用細菌16S通用引物進行擴增。PCR擴增體系為25 μL，包括1 μL模板DNA，12.5 μL PCR Mix（東盛，廣州），上、下游引物各1 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應程序為35個循環：預變性95 ℃，4 min；變性95 ℃，1 min；退火53 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；72 ℃延伸7 min。隨后對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將有條帶的PCR產物進行測序，并將測序結果與NCBI數據庫進行對比，進一步確定菌種所屬。

2 結果與分析

2.1 疾病病癥和病原的形態觀察

測量黃唇魚所生存的水溫為29.7 ℃，鹽度為3.75 ng/L，pH值為7.35。

受到感染的黃唇魚表現癥狀為凸眼、尾鰭和背鰭均出現出血癥狀并伴有輕微的皮膚潰爛，魚體表面有輕微褪色，魚鱗脫落，眼球突出。其腹腔有腹水，內臟部位附近出現充血，腎臟、脾臟有明顯出血，腸道內有黃色液體流出。除此之外其他部分均正常，并無其他明顯病癥。

在12 h內，菌株會形成外表圓球形、邊緣整齊、表面光滑且略帶凸起的白色不透明菌落（圖1）。

2.2 細菌的PCR鑒定

通過16S細菌通用引物對不同菌株進行PCR擴增，其條帶片段大小為800 bp左右（圖2）。

進行PCR測序后，在NCBI數據庫上進行比對，發現ITS序列的相似度高達98%以上，由此來確定具體菌株名稱。

2.3 菌株的分子學鑒定

魚體的優勢菌株為玄武巖希瓦氏菌和哈維氏弧菌，感染鰓的優勢菌株為哈維氏弧菌，感染胃組織的優勢菌株為阿爾法克弧菌，感染腸道組織的優勢菌株為黑海弧菌、美人魚發光弧菌、哈維氏弧菌，感染肝組織的優勢菌株為哈維氏弧菌、黑海弧菌，感染脾組織的優勢菌株為哈維氏弧菌、美人魚發光桿菌、黑海弧菌，感染中腎組織的優勢菌株為哈維氏弧菌、黑海弧菌，感染頭腎組織的優勢菌株為哈維氏弧菌。

根據結果可知，此次死亡的黃唇魚所感染的優勢菌株為哈維氏弧菌。

3 討論

3.1 致病性弧菌

在海水養殖感染的病原菌中，弧菌屬細菌占比較大，致病性弧菌被認為是海水魚類和貝類養殖產業的“災禍之源”，其主要感染對象為大菱鲆、虹鱒、大西洋鮭、對蝦、黑石斑魚、牙鲆等[6]。弧菌屬是一類革蘭氏陰性細菌，化能異養、兼性厭氧，細胞呈現短桿狀、彎曲狀、S形或螺旋形等多形態[7]。鑒于本次檢測，可以初步斷定此次引起黃唇魚死亡的主要致病菌為哈維氏弧菌，但為了進一步確定，還需進一步做感染回歸實驗，再與此次發病的癥狀進行對照，方可確定此次致病菌的真實性。

哈維弧菌是在自然界廣泛存在的弧菌科的重要成員，屬于變形細菌門，變形菌綱，弧菌目，弧菌科，弧菌屬。同時，該細菌在海洋中分布也廣泛，屬于革蘭氏陰性細菌，在20世紀末才被人們所熟知[8]。

哈維氏弧菌除了具有一定的運動能力，還具有一定的嗜鹽性，因此該菌在鹽度較高的外海海域或在鹽度較高的近岸海域分布十分廣泛，其生存的最適溫度為25～28 ℃[9]。感染哈維氏弧菌主要集中在夏季，其侵染性極強，致死率也偏高，如果水生動物被該病菌侵染后，會出現如壞死性腸炎、爛鰓爛尾、口腔或皮膚表面局部出血性潰瘍、體色發黑、肛門紅腫、眼睛渾濁和厭食等現象，一般感染1周后會出現死亡[10-11]。

在不同地區、不同宿主間，哈維氏弧菌的耐藥性都存在著差異，有時差異較為明顯[12]。相關Shen等[13]研究發現，哈維氏弧菌對17種抗生素表現出明顯耐藥性，而僅對米諾環素、多西環素和頭孢曲松這三種抗生素表現出明顯敏感性。鑒于不同情況下得到的哈維氏弧菌的耐藥性存在較大差異，對哈維氏弧菌的分離株要進行較廣的耐藥特性分析，這不僅為疾病（由哈維氏弧菌引發的疾病）提供用藥參考，而且可以有效地記錄當地用藥的種類和劑量，為以后用藥方向提供有效參考[13-16]。

3.2 水生動物防治技術

隨著社會的不斷發展，養殖人員應該積極采用先進的防控手段，在保證水生動物存活率的同時，應注意生態環境的保護。

在水生動物防治方面，養殖人員不能一直采用化學手段。化學藥物不僅危害人類健康，還會對養殖環境乃至整個生態系統造成破壞。因此，在水產養殖的病害防治方面，養殖人員應采取更加健康、綠色的手段。

疫苗防治就是一種綠色防治手段，疫苗防治是針對特定的高發病或高致死率病菌，研發相應疫苗，然后注射入宿主體內。該手段可以替代傳統的高污染的化學藥物，進一步減輕藥物對環境的影響，更為有效地抑制弧菌屬的侵染。

除了疫苗防治，噬菌體防治也是較為常見的病害防治手段。噬菌體防治針對特定的菌種研發對應噬菌體，這些噬菌體可以有效殺滅細菌，但對宿主本身不會造成危害，最重要的是該噬菌體對環境的影響微乎其微[17-19]。

4 結論

以廣東省惠州市一方海（廣東）海洋牧場有限公司所繁育的黃唇魚為研究對象，從病魚中分離得到菌株，經細菌純化培養和16S rRNA基因序列分析，確定致病菌為哈維氏弧菌。該菌為海水養殖中常見致病菌，具有較強毒力，一般在夏季為感染高發期。而在感染初期，魚體顏色會呈褪色狀，食欲缺乏，游動緩慢；中度感染時，魚鰭部、尾部、軀干部等發紅甚至會出現出血癥狀；隨著病癥的不斷發展，魚的腎、脾、肝等內臟均出現出血或者瘀血的現象，甚至出現血性潰瘍。

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