牙槽骨骨髓間充質干細胞膜片復合PCL/HA支架具有良好早期成骨效果：基于動物模型研究

摘要：目的" 評估牙槽骨骨髓間充質干細胞膜片復合PCL/HA支架的骨缺損再生修復效果。方法" 培養牙槽骨骨髓間充質干細胞（Al-BMSCs）膜片和長骨骨髓間充質干細胞（Lon-BMSCs）膜片，熔融沉積成型技術制作PCL/HA支架。取新西蘭大白兔共9只，建立雙側下頜骨缺損模型，按植入材料將其分為PCL/HA支架組（A組）、Lon-BMSCs膜片復合PCL/HA支架組（B組）、Al-BMSCs膜片復合PCL/HA支架組（C組），3組共得到18個樣本，6個/組。術后4周處死動物，取下頜骨組織，行大體觀察、錐形束CT分析、HE染色和Masson染色，對各組成骨情況進行分析。結果" 錐形束CT結果顯示C組骨體積分數、骨小梁厚度和骨小梁數量均高于A組和B組，組間差異有統計學意義（Plt;0.05）。HE和Masson染色顯示C組成骨最為活躍，有較多的新生骨和血管形成。結論" 牙槽骨骨髓間充質干細胞膜片復合PCL/HA支架具有良好的早期成骨效果，為頜面部骨缺損再生修復提供了一種新的策略。

關鍵詞：牙槽骨骨髓間充質干細胞；細胞膜片；支架材料；骨缺損

Alveolar bone marrow mesenchymal stem cells sheet combined with PCL/HA scaffold displays better osteogenesis effect in the early healing process： based on animal models

LIU Yanan1， HU Lei2， HUO Wenyan1， WANG Likai1， WANG Haifeng1

1Department of Stomatology， Beijing Bo'ai Hospital， China Rehabilitation Research Center， Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine， Beijing 100068， China; 2Department of Prosthodontics， Capital Medical University School of Stomatology， Beijing 100050， China

Abstract： Objective To investigate the repairing effect of alveolar bone marrow mesenchymal stem cells （Al?BMSCs） sheet combined with PCL/HA scaffold in rabbit mandibular defects. Methods Al?BMSCs sheets and Long bone marrow mesenchymal stem cells （Lon?BMSCs） sheets were cultured， PCL/HA scaffolds were produced by the fused deposition modeling method. Nine New Zealand rabbits were used to establish bilateral mandibular defect models. According to the implant materials， the rabbits were divided into 3 groups： Group A （PCL/HA scaffold）， group B （Lon-BMSCs sheets combined with PCL/HA scaffold）， group C （Al?BMSCs sheets combined with PCL/HA scaffold）. A total of 18 samples were harvested， with 6 samples per group. All the experimental animals were sacrificed after 4 weeks. Gross observation， cone beam CT analysis， HE staining and Masson staining were used to evaluate the effect of bone regeneration. Results The results of cone beam CT showed that the value of BV/TV， Tb.Th， Tb.N in the group C were higher than that in group A and group B， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）. HE staining and Masson staining results showed that the osteogenesis in the group C was the most active， characterized by more newly formed bone and capillaries. Conclusion Al-BMSCs sheets combined with PCL/HA scaffold displays better osteogenesis effect in the early healing process， which is expected to become a new strategy for the regeneration of maxillofacial bone defects.

Keywords： alveolar bone marrow mesenchymal stem cells; cell sheet; scaffold; bone defect

外傷、手術、腫瘤切除及先天疾病等引起的頜骨缺損是臨床常見病，修復骨缺損，恢復患者的口腔生理功能和美觀是亟需解決問題。近年來干細胞介導的組織再生為口腔頜面部骨組織缺損提供了新的生物性修復方式［1， 2］。在組織工程領域，骨髓間充質干細胞（BMSCs）是最為常用的種子細胞之一［3， 4］。目前，髂骨骨髓抽吸物是BMSCs的主要來源，但對疼痛的恐懼和術后并發癥使髂骨BMSCs不能在臨床作為常規治療使用。而在牙種植術中可無痛分離出牙槽骨來源的BMSCs（Al-BMSCs），該方法取材簡便，患者更易于接受［5］。傳統的組織工程策略是將種子細胞接種到模擬天然細胞外基質結構的支架材料，構成細胞-支架復合體，移植到缺損區域進行修復，但該方法組織再生效率較低［6， 7］。而細胞膜片技術可以保留細胞外基質的完整性，更好地維護和促進細胞在移植及組織再生過程中的作用［8］。既往研究多為細胞膜片單獨應用促進骨再生或將長骨來源干細胞膜片與支架結合進行移植實驗［9， 10］，未見利用牙槽骨骨髓間充質干細胞膜片復合支架材料促進骨缺損再生相關實驗。本研究旨在通過將Al-BMSCs誘導成膜片，與聚已內酯/羥基磷灰石（PCL/HA）復合支架結合，在兔下頜骨缺損區域進行骨再生研究，為臨床治療骨缺損提供實驗基礎和理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

1.1.1" 細胞" "人Al-BMSCs來自于中國康復研究中心口腔科種植牙手術患者，納入標準：年齡30～50歲；全口牙周狀況良好。排除標準：服用影響骨骼代謝類藥物（如糖皮質激素、非甾體類抗炎藥物等）；患有骨質疏松癥。患者術前需簽署知情同意書，本研究經過倫理委員會批準（審批號：2018-094-1）。

在種植手術過程中，收集窩洞制備得到的骨屑復合物，用于分離培養人Al-BMSCs［3］。人長骨骨髓間充質干細胞（Lon-BMSCs）為購買的成品細胞系。

1.1.2" 支架材料" "PCL/HA復合支架由江陰瑞康健生物醫學科技有限公司通過熔融沉積成型技術制作而成［11］，其中PCL和HA混合比例為7：3，支架的孔隙率為49.05%，孔徑為432.22±32.72 μm。PCL/HA復合支架大小為10 mm×6 mm×4 mm用于后續動物實驗。

1.1.3" 實驗動物" 9只新西蘭白兔，雄性，6月齡，體質量2.5～3.0 kg，由北京芳元緣動物飼養場提供。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 人Al-BMSCs膜片和Lon-BMSCs膜片的培養" 細胞膜片培養方法同前期實驗［12］。將種植手術過程中收集的骨屑分離培養原代Al-BMSCs。 將Al-BMSCs和Lon-BMSCs兩種細胞分別培養、擴增、傳代至第3代后，接種在60 mm大的培養皿中，待細胞基本完全貼壁，更換為成膜誘導液連續培養14 d后，培養皿底壁可見膜狀物質形成，待邊緣卷曲時，用鑷子將細胞膜片與培養皿底壁分離，獲得細胞膜片（圖1）。

1.2.2" 細胞膜片包裹支架" 支架回植前，先用鈷-60消毒，將支架浸泡于培養液中浸泡24 h。將已獲得的Al-BMSCs膜片和Lon-BMSCs膜片包裹支架，在培養液培養24 h后植入動物體內。

1.2.3" 實驗分組" 取健康新西蘭大白兔9只，于雙側下頜骨上制備大小為10 mm×6 mm×4 mm的骨缺損，缺損區域給予以下處理：植入PCL/HA支架組（A組），植入Lon-BMSCs膜片+PCL/HA支架組（B組），植入Al-BMSCs膜片+PCL/HA支架組（C組），3組共得到18個樣本，6個/組。

1.2.4" 手術方法" 實驗動物全麻后，備皮，常規消毒鋪巾，在距下頜骨下緣約1 cm處切開皮膚約2 cm，逐層切開達骨面，暴露下頜骨頰側骨面。用快速渦輪鉆在兔下頜骨上制備10 mm×6 mm×4 mm的骨缺損，生理鹽水充分沖洗以降溫。去除頰側骨皮質后，截斷缺損區域牙根，注意保留舌側骨皮質的完整。按照分組植入相應材料后，分層縫合切口。一側手術完成后，對側進行同樣的實驗步驟（圖2）。術后對實驗動物肌肉注射青霉素，連續注射3 d。1周內每日觀察傷口恢復情況，有無感染。術后4周安樂死處死實驗動物行相關檢查。

1.3 主要觀察指標

1.3.1" 一般觀察" "術后實驗動物觀察其基本生命體征、傷口愈合情況、飲食情況等。實驗動物處死后，取下頜骨組織，避免暴力致下頜骨折斷，仔細去除附著于骨表面的肌肉等組織。觀察骨缺損區表面愈合情況，周圍組織有無感染等并進行拍照。

1.3.2" Micro-CT掃描" "下頜骨組織行micro-CT 掃描（Skyscan Bruker），掃描參數：電壓80 kV，電流500 mA，像素分辨率8 μm。將下頜骨所制備的10 mm×6 mm×4 mm骨缺損區選中為感興趣區域，測量分析骨體積分數（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數量（Tb.N）。

1.3.3" 組織學檢測" "在micro-CT 掃描后，下頜骨組織常規脫鈣4周，石蠟包埋切片后行HE染色和Masson染色，觀察缺損區域骨修復情況。

1.4" 統計學分析

采用SPSS22.0軟件對數據進行統計學分析。數據均為正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 一般觀察

所有組實驗動物術后生命體征平穩，進食良好，術區均未見明顯感染。下頜骨缺損區表現出不同成骨狀態，且支架材料均未完全降解。A組骨缺損處可見大量纖維軟組織覆蓋（圖3A）；B組缺損邊緣可見纖維軟組織與新生骨交織，缺損邊界不明顯（圖3B）；C組復合支架與缺損邊緣形成部分骨結合，且新生骨長入支架孔隙中（圖3C）。

2.2" Micro-CT檢測

3組樣本的micro-CT 掃描結果與大體觀察基本一致，發現各組骨缺損均有不同程度的再生。A組僅缺損邊緣有少量新生骨，B組邊界處有條索樣新生骨組織，C組可見骨樣組織從邊緣深入中央，在支架材料內部可見片狀新生骨（圖4）。對新生骨組織進行相關定量分析，B組和C組的BV/TV、Tb.Th、Tb.N高于A組，且C組高于B組，差異有統計學意義（Plt;0.05，圖5）。

2.3" 組織學觀察

HE染色（圖6）和Masson染色（圖7）并行組織學觀察，結果均顯示：各組內均可見支架未完全吸收，不同組別新骨形成程度不同。A組缺損邊緣有散在新骨形成，可見大量增生的不規則纖維組織，未見成熟骨小梁結構（圖6A、7A）；B組可見成熟骨組織，缺損區內可見一些成熟骨小梁樣組織形成（圖6B、7B）；C組內成骨細胞最為活躍，可見大量骨細胞，有豐富新生血管，骨小梁數目更多，排列更為致密（圖6C、7C）。

3" 討論

近年來，以間充質干細胞介導的骨缺損修復再生已在骨組織工程中得到廣泛應用。目前用于骨修復再生的BMSCs通常來源于長骨，但因其取材過程中造成的創傷、疼痛和術后并發癥等阻礙了其臨床推廣應用。而從牙槽骨獲取BMSCs，具有間充質干細胞相同的表面標志、增殖及多向分化能力［13］。與Lon-BMSCs相比，其取材簡便，無需開辟第二術區，在拔除患牙或種植的同時即可取材，對患者的創傷較小，臨床接受度高，目前已被廣泛研究［14， 15］。課題組前期研究發現人Al-BMSCs比Lon-BMSCs具有更高的成骨分化能力，將兩種來源的間充質干細胞誘導成細胞膜片后，體內外實驗結果均表明Al-BMSCs膜片組新骨形成更多，這說明以Al-BMSCs膜片為基礎的組織再生是一種有效的頜面骨缺損的修復方法。但對于大塊骨缺損單純使用間充質干細胞僅可實現部分骨再生，其原因為缺乏可供間充質干細胞生長的支架［16］。而具有生物活性的“種子細胞+生物支架”復合體已逐漸成為修復大面積骨組織缺損的主要手段［17， 18］。當種子細胞誘導成膜片后，其保留了細胞因子，細胞間蛋白，離子通道等細胞外基質，且與游離細胞懸液相比，膜片能夠分泌更多血管生成因子，使移植存活時間明顯延長，從而更有效促進缺損區域的再生修復［19， 20］。有研究發現將骨髓間充質干細胞膜片與β-TCP/COL-I支架復合后，與單純支架組和細胞懸液復合支架組作對比，體內外實驗結果均表明膜片復合支架成骨能力更強［10］；另有研究將BMSCs膜片包裹PLGA支架植入到比格犬下頜骨缺損處，結果顯示其成骨能力顯著優于單純支架組，在術后16周實驗組觀察到大量新生哈弗系統和板層骨且新生骨密度更高［21］。這均與本研究結果一致，細胞膜片的加入為骨再生提供了一個兼有細胞、細胞外基質以及周圍生物活性分子的微環境，有效促進了新生骨形成。

在檢測方面，選用了micro-CT評估各組新生骨量的差異。Micro-CT 掃描已被廣泛應用于各種實驗動物骨缺損修復再生的研究。其通過micro-CT 掃描儀內置軟件進行重建，同時基于三維方向計算出新生骨組織相關檢測指標［22］。本研究結果顯示，三組移植物新生骨量具有差異，Al-BMSCs膜片復合支架組的骨體積分數、骨小梁厚度和骨小梁數目多于其他兩組。在組織學分析中同樣顯示Al-BMSCs膜片復合支架組形成新骨最多，成骨最為活躍，骨小梁數目更多，排列更為致密。因此Al-BMSCs膜片復合PCL/HA支架材料在兔下頜骨缺損修復中效果優于其他兩組。

兩種膜片在體內顯示出不同骨再生效果，是因為Al-BMSCs和Lon-BMSCs無論從細胞來源還是成骨發育的歷程均有所不同。有研究將大鼠Al-BMSCs和Lon-BMSCs與明膠結合回植體內，結果顯示Al-BMSCs組形成更多、更大的鈣化結節和成熟的板層骨，該研究認為Al-BMSCs具有更高的成骨潛能［23］。而從頜面部骨骼獲得的移植物，用來修復頜面部的缺損，要比四肢骨來源的移植物修復效果更好，這表明來源于不同骨骼部位的細胞具有特異性差異，會影響移植后的修復效果［24， 25］，而在本研究中Al-BMSCs膜片組骨再生效果更好，也證實了以上結論。另外，在分子生物學上研究發現，頜面部和四肢骨再生過程具有差異。其中Hox基因可以調控MSCs的增殖和頜面部及牙齒的發育過程，在下頜骨周圍微環境中Al-BMSCs為Hox陰性表達，但將其移植到脛骨缺損處時，Hox呈陽性表達。相反，Lon-BMSCs為Hox陽性表達，即使將其移植到Hox表達陰性的下頜骨缺損中仍能維持Hox陽性狀態［26］。Hox基因在供體細胞和受體區的差異表達，使移植的BMSCs不能分化為成骨細胞，影響骨再生的效果，這種選擇性的機制表明來源于頜面部和四肢骨的BMSCs在組織修復過程中是不可互相替換。因此，在骨組織工程修復中，應充分考慮BMSCs的胚層來源，以達到最好的修復效果。

本研究將人BMSCs移植進入新西蘭大白兔體內，為異種移植，需要考慮是否會發生免疫排斥反應。既往研究表明將人BMSCs植入兔椎間盤或頜骨缺損區域等未發生明顯排斥反應［27， 28］。而在本實驗中，實驗動物術后精神狀態良好，飲食排便情況正常，在整個實驗周期內實驗動物均未出現傷口紅腫感染等免疫排斥反應。這表明BMSCs具有低免疫原性，這使其在進行同種異體或異種移植時，不產生或只有極低的免疫排斥反應，并能促進各種組織的再生［29， 30］。

綜上所述，本研究創新性利用Al-BMSCs膜片復合支架材料促進頜骨缺損修復，研究結果有助于揭示其作為口腔臨床骨缺損新的修復方式，在骨組織工程中具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

［1］" "Andalib N， Kehtari M， Seyedjafari E， et al. In vivo bone regeneration using a bioactive nanocomposite scaffold and human mesenchymal stem cells［J］. Cell Tissue Bank， 2021， 22（3）： 467-77.

［2］" "Koons GL， Diba M， Mikos AG. Materials design for bone-tissue engineering［J］. Nat Rev Mater， 2020， 5： 584-603.

［3］" "Dunn CM， Kameishi S， Grainger DW， et al. Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell?based therapies［J］. Acta Biomater， 2021， 133： 114-25.

［4］" "Shang FQ， Yu Y， Liu SY， et al. Advancing application of mesenchymal stem cell-based bone tissue regeneration［J］. Bioact Mater， 2021， 6（3）： 666-83.

［5］" "Mason S， Tarle SA， Osibin W， et al. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation［J］. J Dent Res， 2014， 93（1）： 55-61.

［6］" "Daley WP， Yamada KM. ECM-modulated cellular dynamics as a driving force for tissue morphogenesis［J］. Curr Opin Genet Dev， 2013， 23（4）： 408-14.

［7］" "Akahane M， Shigematsu H， Tadokoro M， et al. Scaffold-free cell sheet injection results in bone formation［J］. J Tissue Eng Regen Med， 2010， 4（5）： 404-11.

［8］" "Liu YH， Ming LG， Luo HL， et al. Integration of a calcined bovine bone and BMSC-sheet 3D scaffold and the promotion of bone regeneration in large defects［J］. Biomaterials， 2013， 34（38）： 9998-10006.

［9］" "Shi L， Tee BC， Cotter L， et al. Enhance mandibular symphyseal surface bone growth with autologous mesenchymal stem cell sheets： an animal study［J］. Aesthetic Plast Surg， 2020， 44（1）： 191-200.

［10］ Lin J， Shao JQ， Juan L， et al. Enhancing bone regeneration by combining mesenchymal stem cell sheets with β-TCP/COL-I scaffolds［J］. J Biomed Mater Res B Appl Biomater， 2018， 106（5）： 2037-45.

［11］" Tian LJ， Zhang ZT， Tian B， et al. Study on antibacterial properties and cytocompatibility of EPL coated 3D printed PCL/HA composite scaffolds［J］. RSC Adv， 2020， 10（8）： 4805-16.

［12］" Liu YN， Wang HF， Dou HX， et al. Bone regeneration capacities of alveolar bone mesenchymal stem cells sheet in rabbit calvarial bone defect［J］. J Tissue Eng， 2020， 11： 2041731420930379.

［13］" Ye J， Gong P， Zhou FJ， et al. Culture and identification of human bone marrow mesenchymal stem cells from alveolar ridge dental implant site［J］. J Craniofac Surg， 2013， 24（5）： 1539-43.

［14］ Liu X， Lv SY， Kan WJ， et al. Human alveolar bone-derived mesenchymal stem cell cultivation on a 3D-printed PDLLA scaffold for bone formation［J］. Br J Oral Maxillofac Surg， 2023， 61（8）： 527-33.

［15］Cao C， Tarlé S， Kaigler D. Characterization of the immunomodulatory properties of alveolar bone-derived mesenchymal stem cells［J］. Stem Cell Res Ther， 2020， 11（1）： 102.

［16］ Xu XY， Li X， Wang J， et al. Concise review： periodontal tissue regeneration using stem cells： strategies and translational considerations［J］. Stem Cells Transl Med， 2019， 8（4）： 392-403.

［17］" Lau CS， Chua J， Prasadh S， et al. Alveolar ridge augmentation with a novel combination of 3D-printed scaffolds and adipose-derived mesenchymal stem cells-a pilot study in pigs［J］. Biomedicines， 2023， 11（8）： 2274.

［18］" Kido HW， Gabbai-Armelin PR， Magri A， et al. Bioglass/collagen scaffolds combined with bone marrow stromal cells on bone healing in an experimental model in cranial defects in rats［J］. J Biomater Appl， 2023， 37（9）： 1632-44.

［19］ Takeuchi R， Kuruma Y， Sekine H， et al. In vivo vascularization of cell sheets provided better long-term tissue survival than injection of cell suspension［J］. J Tissue Eng Regen Med， 2016， 10（8）： 700-10.

［20］ Banimohamad-Shotorbani B， Karkan SF， Rahbarghazi R， et al. Application of mesenchymal stem cell sheet for regeneration of craniomaxillofacial bone defects［J］. Stem Cell Res Ther， 2023， 14（1）： 68.

［21］ Du CH， Yao C， Li NY， et al. Cell sheet-engineered bones used for the reconstruction of mandibular defects in an animal model［J］. Exp Ther Med， 2015， 10（6）： 2216-20.

［22］ Perilli E， Le V， Ma B， et al. Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized， zoledronic acid-treated， and sham-operated rats［J］. Osteoporos Int， 2010， 21（8）： 1371-82.

［23］ Aghaloo TL， Chaichanasakul T， Bezouglaia O， et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells［J］. J Dent Res， 2010， 89（11）： 1293-8.

［24］ Weber M， Wehrhan F， Deschner J， et al. The special developmental biology of craniofacial tissues enables the understanding of oral and maxillofacial physiology and diseases［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（3）： 1315.

［25］ Solidum JGN， Jeong Y， Heralde F 3rd， et al. Differential regulation of skeletal stem/progenitor cells in distinct skeletal compartments［J］. Front Physiol， 2023， 14： 1137063.

［26］ Leucht P， Kim JB， Amasha R， et al. Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration［J］. Development， 2008， 135（17）： 2845-54.

［27］ Tao H， Lin YZ， Zhang GQ， et al. Experimental observation of human bone marrow mesenchymal stem cell transplantation into rabbit intervertebral discs［J］. Biomed Rep， 2016， 5（3）： 357-60.

［28］ Wang X， Xing HL， Zhang GL， et al. Restoration of a critical mandibular bone defect using human alveolar bone-derived stem cells and porous nano-HA/collagen/PLA scaffold［J］. Stem Cells Int， 2016， 2016： 8741641.

［29］ Peer BA， Bhat AR， Shabir U， et al. Comparative evaluation of fracture healing potential of differentiated and undifferentiated guinea pig and canine bone marrow?derived mesenchymal stem cells in a guinea pig model［J］. Tissue Cell， 2022， 76： 101768.

［30］ Bist D， Pawde AM， Amarpal， et al. Evaluation of canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells for experimental full-thickness cutaneous wounds in a diabetic rat model［J］. Expert Opin Biol Ther， 2021， 21（12）： 1655-64.

（編輯：林" 萍）