乳腺浸潤性導管癌超聲及超聲造影征象與B7-H4表達的相關性

摘要：目的 "分析浸潤性導管癌（IDC）超聲及超聲造影特征與B7同源體4（B7-H4）表達的相關性。方法 "回顧性分析2015年1月～2021年1月在新疆醫科大學第一附屬醫院乳腺外科收治的136例乳腺病變女性患者，手術切除后標本經病理證實為IDC，將病理標本切片并采用免疫組化檢測乳腺癌細胞的細胞膜和胞漿中B7-H4表達情況，所有患者術前均行乳腺二維超聲檢查及超聲造影檢查并記錄病灶超聲及超聲造影特征，分析IDC超聲及超聲造影特征與B7-H4表達水平的相關性。結果 "136例患者免疫組化檢測B7-H4在乳腺癌細胞的細胞膜和胞漿中均有表達。因抗原修復時溫度過高或其他原因導致組織脫片2張，剩余134張切片中，陰性表達6張，陽性表達128張，其中高表達85張，低表達43張。不同的B7-H4表達分組中，B7-H4出現高表達時，IDC二維超聲易出現縱橫比gt;1、形態不規則、周圍組織回聲中斷，后方回聲衰減，淋巴結轉移等特征（Plt;0.05）；IDC超聲造影易出現增強后病灶內部充盈缺損及增強后病灶周邊匯聚征的特征（Plt;0.05）。二維IDC中腫塊形態、縱橫比、后方聲衰減及周圍組織回聲等二維超聲特征與B7-H4的高表達呈正相關（r=0.188、0.240、0.185、0.344，Plt;0.05）。結論 "IDC超聲及超聲造影表現與B7-H4的表達具有一定相關性，IDC超聲及超聲造影特征可以預測其分子標志物B7-H4的表達，進而可能為乳腺癌B7-H4靶向治療效果評估提供可靠的影像學參考依據。

關鍵詞：乳腺浸潤性導管癌；B7-H4；超聲檢查；超聲造影

Relationship between ultrasonography and contrast?enhanced ultrasonography and B7-H4 in breast invasive ductal carcinom

ZHANG Jingyue， HOU Xueqin， YAN Ruiqian， LIU Yibin， LI Zhimin， GAO Junxi

Department of Ultrasound Diagnosis Abdomen， The First Affiliated Hospital， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China

Abstract： Objective To analyze the relationship and correlation between ultrasonography and contrast-enhanced ultrasound features and the expression of B7-H4 in invasive ductal carcinoma （IDC）. Methods A total of 136 female patients admitted to the Department of Breast Surgery， First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2015 to January 2021 were retrospectively analyzed. Following surgical resection， specimens were histopathologically confirmed as IDC. Immunohistochemistry was utilized to detect the expression of B7-H4 in the cell membrane and cytoplasm of breast cancer cells from the pathological specimens. Prior to surgery， all patients underwent two-dimensional ultrasound and contrast-enhanced ultrasound of the breast. Ultrasound and contrast-enhanced ultrasound characteristics of the lesions were documented， and their correlation with the expression level of B7-H4 in IDC was subsequently analyzed. Results The expression of B7-H4 in the cell membrane and cytoplasm of breast cancer cells was detected by immunohistochemistry in 136 patients. Due to the high temperature during antigen repair or other reasons， 2 pieces of tissue were removed. Among the remaining 134 sections， 6 were negative expression and 128 were positive expression， including 85 high expression and 43 low expression. In different B7-H4 expression groups， when B7-H4 was highly expressed， the two-dimensional ultrasound of IDC mass was prone to characteristics such as aspect ratiogt;1， irregular shape， interruption of surrounding tissue echo， posterior echo attenuation， lymph node metastasis （Plt;0.05）; The characteristics of IDC contrast-enhanced ultrasound were prone to the characteristics of internal filling defect and peripheral convergence sign after enhancement （Plt;0.05）. The high expression of B7-H4 was positively correlated with the two-dimensional ultrasound features such as tumor morphology， aspect ratio， posterior acoustic attenuation and surrounding tissue echo in two-dimensional IDC ultrasound （r=0.188， 0.240， 0.185， 0.344， Plt;0.05）. Conclusion IDC ultrasound and contrast-enhanced ultrasound findings have a certain correlation with the expression of B7-H4. The characteristics of IDC ultrasound and contrast-enhanced ultrasound can predict the expression of molecular marker B7-H4 in IDC， and then provide a reliable imaging reference for the evaluation of the possible B7-H4 targeted therapy effect of breast cancer.

Keywords： invasive ductal carcinoma; B7-H4; ultrasonography; contrast-enhanced ultrasound

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其中浸潤性導管癌（IDC）是乳腺癌中最常見的類型［1， 2］。近年來，B7-H4因其在腫瘤免疫逃逸的重要作用而備受關注，B7-H4是一種免疫檢查點分子，通過抑制T細胞的增殖、減少白介素（IL）-2、IL-4、IL-10、干擾素（IFN-γ）等細胞因子的產生和控制細胞周期的進程來負性調控T細胞免疫應答［3， 4］。B7-H4在多種癌癥中被過度表達，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌等，其表達水平與腫瘤的侵襲性及患者預后密切相關［5， 6］。特別是在IDC中，B7-H4的高表達與較差的預后相關［7， 8］，這一發現揭示了B7-H4作為潛在治療靶標的可能性。超聲和超聲造影作為乳腺癌診斷及治療效果評估的重要手段，已被廣泛應用于臨床［9］，目前雖然B7-H4在乳腺癌中的作用已經得到了一定程度的認識［10］，但IDC超聲及超聲造影特征與B7-H4表達之間是否存在相關性尚未見相關文獻報道。本研究探索B7-H4表達與這些超聲及超聲造影特征之間的關系，有助于深入理解B7-H4在乳腺癌發展中的作用機制，以期為乳腺癌的診斷和治療策略及效果評估提供新的視角，為乳腺癌有關B7-H4靶向治療提供較為客觀的影像學依據。

1 "資料與方法

1.1 "一般資料

選取2015年1月～2021年1月于新疆醫科大學第一附屬醫院接受乳腺癌手術且術后病理證實為IDC的136例患者臨床資料并進行回顧性研究，年齡22～78歲，中位年齡49.5歲。納入標準：患者均為女性且首次確診乳腺癌，經病理證實為IDC；未接受任何抗癌處理；具有完整術前超聲檢查報告以及病理報告。排除標準：術前接受過抗癌治療；繼發性乳腺癌，其他部位癌癥轉移至乳腺的患者。患者遵循自愿原則，均知情同意并簽署研究同意書，對涉及患者隱私的資料保密。本研究獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（審批號：K202312-23）。

1.2 "方法

1.2.1 "超聲及超聲造影檢查 " 患者保持仰臥體位，充分顯露雙側乳腺及腋窩，采用GE公司 LOGIQ E9 彩超診斷儀，二維超聲使用高頻探頭：ML6-15-D，頻率：6～15 MHz。選取乳腺掃查模式，將乳頭作為中心，對乳腺的各個切面做放射狀、連續性掃描。詳細記錄結節位置、大小、形態、生長方向（縱橫比）、邊界、內部回聲、周圍組織回聲及有無微鈣化、血流信號、腋窩淋巴結有無轉移，血流按照Adler半定量法［11］分為0、I、II、III級。常規超聲獲得較好的二維圖像時，保持探頭穩定，選取最佳切面切入造影狀態，抽取配置好的5 mL超聲造影劑（SonoVue）快速推注入一側上肢肘靜脈，再靜推0.9%無菌氯化鈉注射液5 mL，注射造影劑后即刻開始記錄動態影像，觀察約2 min。

超聲造影圖像分析：增強幅度：腫塊增強后與周圍正常乳腺組織增強比較（周圍正常乳腺組織為等增強）分為高增強（增強后并病變回聲明顯高于周圍正常組織）及其他增強（包括等增強、低增強及無增強）；增強模式：分為快進快退/慢退及其他增強模式（包括慢進快退、慢進慢退、等進快退、等進慢退）；病灶增強后邊界是否顯示清晰；造影劑進入病灶順序：分為向心性及非向心性；病灶增強后內部是否存在充盈缺損；病灶增強后內部造影劑分布是否均勻；病灶增強后范圍是否擴大；病灶增強后周圍是否存在匯聚征。測定結果由2位具有5年以上臨床經驗的超聲科醫師在未知病理結果前獨立完成分析，有分歧時與第3位高年資醫師討論達成統一意見。

1.2.2 "免疫組化指標的測定及判定標準 " 病理標本病灶常規取材，置10%的福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋后備用。修整蠟塊，4 μm切片，切片置70℃溫箱烤片1 h后放于切片盒中，4℃保存備用。切片用二甲苯脫蠟、無水乙醇脫水，用自來水沖洗2 min，再用蒸餾水沖洗3次，每次5 min，滴加200 μL過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次，甩去PBS，EDTA高溫（98℃）抗原修復后室溫冷卻，PBS沖洗3次，3 min/次，加血清蛋白封閉，37 ℃孵育40 min并甩去，加兔單克隆抗體B7-H4，按1：1000稀釋，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，5 min/次，甩去PBS，加二抗37 ℃孵育40 min，PBS沖洗3次，3 min/次，加DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，自來水終止，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，PBS返藍，分級酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。為消除非特異性染色，用PBS作陰性對照，用已經證實的陽性切片作為陽性對照。

由2位病理醫生采用盲法分別對染色切片進行結果判定，采用被廣泛接受的德國半定量評分系統［12］。評價染色細胞的染色強度和面積范圍。根據細胞染色強度和染色細胞面積定義評分標準（無染色=0；弱染色=1；中度染色=2；強染色=3）和（0%=0；1%～24%=1；25%～49%=2；50%～74%=3；75%～100%=4）。最終得分通過將細胞的染色強度乘以染色細胞的面積來確定，范圍從0（最小分級）～12（最高分級）。B7-H4評分為0分為陰性，1～12分為陽性。在陽性標本中，1～8分組為低表達組，9～12分組為高表達組［13］。

1.3 "統計學分析

采用SPSS23.0軟件進行統計學分析。計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；IDC組織中的B7-H4表達與超聲及超聲造影征象相關性分析采用Spearman相關性檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 "B7-H4在乳腺癌組織中的表達

免疫組化檢測B7-H4在乳腺癌細胞的細胞膜和胞漿中均有表達。由于抗原修復時溫度過高或其他原因，組織脫片2張，剩余134張切片中，陰性表達6張，陽性表達128張，其中高表達85張，低表達43張。

2.2 "B7-H4分子表達與IDC超聲聲像圖特征之間的關系

B7-H4出現高表達時，IDC腫塊二維超聲易出現縱橫比gt;1、形態不規則、周圍組織回聲中斷、后方回聲衰減，淋巴結轉移等特征（Plt;0.05，圖1，表1），而腫塊大小、邊界是否清晰、腫塊內部是否有微鈣化、血流信號分級等與B7-H4表達差異無統計學意義（Pgt;0.05，表1）。

B7-H4出現高表達時，IDC超聲造影特征易出現增強后病灶內部充盈缺損及增強后病灶周邊匯聚征的特征（Plt;0.05，圖2，表2），而病灶增強幅度、增強模式、增強后范圍是否擴大、增強后邊界是否清晰、造影劑進入病灶順序、造影劑分布是否均勻等與B7-H4的表達差異無統計學意義（Pgt;0.05，表2）。

2.3 "超聲及超聲造影特征與IDC組織中B7-H4表達的相關性分析

腫塊形態、縱橫比、后方聲衰減及周圍組織回聲與B7-H4的表達呈正相關（r=0.188、0.240、0.185、0.344，Plt;0.05，表3）。

3 "討論

本研究顯示，134例IDC切片與分子免疫因子B7-H4免疫組化實驗，128張IDC切片均呈陽性表達，并且在陽性表達的切片中，大部分呈現高表達，說明IDC中B7-H4容易出現高表達。當B7-H4出現高表達時，二維超聲檢查中往往展現出形態不規則、縱橫比gt;1及后方聲衰減，周圍組織改變及腋窩淋巴結轉移等特征，這些超聲特征往往提示患者可能具有不良預后，這與既往研究顯示當出現上述超聲特征時，提示乳腺癌往往呈浸潤性生長并且更具有侵襲性觀點一致［14-17］，腫瘤形態不規則、縱橫比gt;1及后方聲衰減等特征也往往表明腫瘤處于進展期。此外，B7-H4已被報道與多種腫瘤的進展相關，有研究揭示了B7-H4過表達與胰腺癌淋巴結轉移、晚期TNM分期以及胰腺癌患者生存率下降之間的相關性［18］。本研究發現，B7-H4在IDC患者中高表達且與部分二維超聲特征呈相關性，分析原因可能為乳腺癌瘤體B7-H4高表達可能改變腫瘤微環境，減少浸潤的淋巴細胞總數，特別是細胞毒CD8+T淋巴細胞的總數[19]，從而促進CD8+細胞毒性T細胞（CD8+T細胞）凋亡，誘導T細胞分泌免疫抑制細胞因子轉化生長因子（TGF）-β1和IL-17有關［20， 21］。而TGF-β1是一種參與免疫抑制的多功能細胞因子，其高水平表達與患者腫瘤或轉移的侵襲性表型顯著相關。同時B7-H4可與MHC形成復合體，該復合體所產生的信號可下調IL-2的表達［22］，而IL-2是刺激NK細胞活化和增殖的主要細胞因子，NK細胞具有抗癌活性，可控制腫瘤生長和轉移擴散［23］，故B7-H4高表達時，腫瘤生長較快且具有明顯侵襲性，從而也更容易出現淋巴結轉移擴散，當乳腺癌腫塊呈浸潤性生長，腫瘤細胞沿著組織間隙向各個方向延伸，原有組織破壞，在二維表現中出現不規則的形態及縱橫比增大等特征，同時侵襲性生長的腫塊會破壞腫瘤周圍庫珀韌帶發生改變，累及皮膚層淋巴結，致使淋巴管堵塞、皮膚增厚，可在二維超聲表現中出現周圍組織改變。本研究顯示，B7-H4高表達乳腺癌腫塊更易出現后方回聲衰減，一方面B7-H4呈現高表達時，其增強侵襲性及促進腫瘤生長的作用使腫瘤具有較高的有絲分裂率和較大的細胞密度致使內部結構不均勻，導致了超聲波比周圍組織更大的衰減有關，另一方面，也與乳腺癌質地硬，腫瘤間質內排列紊亂的膠原纖維成分增多有關［24］。此外，TGF-β1可能通過旁分泌物質增加轉移，抑制局部免疫反應或增加血管生成［25］，血管生成是乳腺癌的重要特征，也是癌細胞異常增殖和侵襲的病理基礎，它是腫瘤生長、侵襲和轉移不可或缺的條件，與多種實體腫瘤的進展密切相關［26， 27］。乳腺癌腫塊內部的血供越豐富，就越容易造成對腋窩淋巴系統的侵襲，從而滿足腫瘤細胞的高代謝的需要，豐富的滋養血管則成為乳腺癌的腫瘤細胞浸入到皮下淋巴系統的有利因素，新生的腫瘤血管還可以在病灶的周圍形成分布廣泛而又紊亂的吻合支，為乳腺癌腫塊的轉移創造了有利條件［28， 29］。而在本研究中，B7-H4的表達高低與二維超聲特征中IDC病灶大小、邊界是否清晰、腫塊內部是否有微鈣化、血流信號分級等方面的差異無統計學意義，一方面說明病灶無論B7-H4高表達或低表達，病灶內部均可能會出現微小鈣化及血流較豐富等較典型乳腺癌惡性特征，另一方面也可能因為B7-H4的作用受到多種因素影響，包括腫瘤的異質性、個體差異以及其他免疫調節因子的參與等［16， 30］，導致上述超聲特征可能無法間接預測B7-H4的表達情況。

本研究中B7-H4呈高表達時，IDC造影特征更易出現增強后病灶內部出現充盈缺損及增強后周邊匯聚征。IDC超聲造影中出現充盈缺損是由于腫瘤新生血管的形成使得其血流灌注快且豐富，癌組織生長過快導致代謝所需的能量及氧的供應相對不足，造成部分腫瘤組織壞死，從而出現充盈缺損［31， 32］，增強后周邊匯聚征的出現往往代表新生腫瘤血管及新生血管數目，B7-H4的高表達促進腫瘤血管生成、生長和侵襲，導致周圍放射性分布的新生血管凸顯出來而形成匯聚征，是腫瘤侵襲的表現［33］，也進一步說明了乳腺癌腫塊B7-H4高表達時腫瘤更具有侵襲性以及生長較迅速，而本研究中IDC腫塊超聲造影增強幅度、增強模式、增強后范圍是否擴大、增強后邊界是否清晰、造影劑進入病灶順序以及造影劑分布是否均勻與B7-H4高低表達差異無統計學意義，說明雖然B7-H4高表達時可能腫瘤更具有侵襲性，但無論腫瘤如何表達B7-H4，乳腺癌腫塊超聲造影都可能會表現出富血供高增強，快進快退或慢退，增強后范圍擴大等特征，這些特征能否作為乳腺癌腫塊B7-H4表達的預測依據可能有待未來進一步擴大樣本含量進一步進行研究。

綜上，在IDC中B7-H4的高表達比較常見，且當其出現高表達時，IDC往往更具有惡性程度高、轉移性高、侵襲性強等特征，IDC的部分超聲及超聲造影特征與B7-H4的表達之間具有相關性，這些特征可預測B7-H4的表達情況，從而為乳腺癌可能的B7-H4靶向治療效果評估提供可靠的影像學參考依據。

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（編輯：熊一凡）