菌蟲復合技術在梨火疫病疫木生物轉化中的應用

關鍵詞：梨火疫病菌；庫爾勒香梨；疫木枝條；白星花金龜；腐解菌；資源化利用

中圖分類號：S436.612.1 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）10-2393-08 doi：10.11654/jaes.2024-0454

梨在我國是僅次于柑橘與蘋果的第三大栽培水果[1]，庫爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）是新疆地區的特色林果作物，多年來產業發展較快，為當地經濟發展和農民增收發揮了重要作用[2]。2023年庫爾勒市香梨種植面積為2.75萬hm2，產量達30萬t。然而，近年來梨火疫病[3]已成為制約庫爾勒香梨產業安全生產和可持續發展的突出問題。梨火疫病是重大檢疫性病害，由全球十大植物病原細菌之一的解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）侵染導致，其侵染過程較為復雜[4]，傳播迅速且寄主廣泛[5]，造成梨樹枝條變黑枯萎，嚴重感染造成整個樹體死亡。同時，染疫死樹及修剪的病枝是重要的病菌攜帶者和傳染源，造成疫病的進一步傳播。目前，國內外梨火疫病防治一般采用春雷霉素、噻霉酮、春雷·噻唑鋅等防治，或對疫木枝條進行集中燒毀處理[6]。長時間使用化學農藥存在產生抗性菌株的風險；疫木枝干焚燒會污染大氣環境，近年來受到生態環境部門的管控。因此，尋找更加環保、有效的疫木廢棄物處理方式迫在眉睫[7]。

近年來，通過昆蟲的生物轉化將農林廢棄物進行無害化處理和資源化利用，為解決上述難題提供了新的技術路徑。白星花金龜（Protaetia brevitarsis）在自然界中主要取食腐敗的秸稈、雜草以及畜禽排泄物等物質[8]，多年來關于白星花金龜的研究重點圍繞其生物學特征、蟲害發生規律及防治等方面[9-11]，因為對生態環境保護的要求及白星花金龜特殊的生物學特性，白星花金龜逐漸應用于農業廢棄物生物轉化。多項研究證實，在微生物腐解后，白星花金龜幼蟲能將富含纖維的秸稈類物料高效地轉化成高蛋白的昆蟲蟲體及富含腐殖質與養分的蟲砂[12-15]；Zhang等[16]的研究指出，白星花金龜可以有效轉化發酵后的棉稈和棉纖維等有機物料；楊誠等[17]的研究表明，玉米秸稈發酵處理25 d 后，白星花金龜幼蟲對其轉化率可達63.82%±30.90%，利用率為17.51%±8.50%。

目前，有關白星花金龜生物轉化梨火疫病疫木的研究尚未見報道。因此，本試驗通過篩選高效腐解菌酵化香梨疫木枝條廢棄物，探析微生物與白星花金龜幼蟲聯合對香梨疫木枝條轉化的影響，以期在有效控制梨火疫病傳播源的同時高效利用香梨疫木枝條，破解香梨疫木枝條無害化處理的難題，為實現林果疫木無害化處理及資源化利用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香梨疫木枝條采自新疆維吾爾自治區巴音郭楞蒙古自治州農業科學研究院，供試牛糞取自巴音郭楞蒙古自治州農業科學研究院研究基地周邊養殖戶，供試腐解菌劑經篩選后，試驗所用菌劑如表1所示。

1.2 試驗處理

1.2.1 腐解菌發酵試驗

將香梨疫木枝條粉碎。采用三因素五水平正交試驗設計，3個因素為腐解菌劑種類、牛糞添加比例、酵化時間，每個因素設置5個水平。腐解菌劑種類設置LK、LL、RW、VT、EM 5個水平，牛糞添加比例設置10%、20%、30%、40%、50% 5 個水平，酵化時間設置10、15、20、25 d 和30 d 5 個水平，將其按正交表L₂₅（5⁶）安排設計（表2）；不添加腐解菌劑和牛糞，酵化時間分別為0、10、15、20、25、30 d作為對照處理。

各處理物料干質量總量為120 kg，將物料含水量調節至65%±5%，按照表1中的量添加腐解菌劑；用鐵鍬進行翻堆、充分攪拌均勻后，裝入塑料袋包裹后扎滿孔，好氧發酵（堆體高度70 cm），發酵過程中每天測量堆體溫度，測量位置為堆體表面中心垂直下方30 cm處；發酵過程中每5 d翻堆一次，翻堆至第25天后靜置，在第30 天采用5點取樣法取垂直堆體表面下方20～30 cm處濕樣3 kg備用。

1.2.2 白星花金龜轉化發酵產物效率評價試驗

以白星花金龜3齡幼蟲（3齡期15日齡）作為供試蟲源，塑料盒（38 cm×50 cm×14 cm）作為養殖盒，每個養殖盒放20頭3齡幼蟲，測定幼蟲質量，每個處理取鮮物料500 g，開展連續12 d的轉化試驗，各處理均重復5次，每隔3 d觀察每個處理的物料狀態并拍照。在第13 天將香梨枝條上層混合物取出，隨后將下層的物料過分離篩（38 cm×50 cm×13.5 cm，底孔徑1.0cm×0.8 cm，側孔徑0.8 cm×0.8 cm），篩出蟲砂和渣土；然后將取出的上層枝條放入分離篩上的剩余混合殘留物中，活的幼蟲蟲體自行鉆入剩余混合殘留物中；隨后取出香梨枝條混合物，用分離篩篩出剩余混合物中的幼蟲，測定幼蟲數量及蟲體質量；用烘箱烘干混合物及蟲砂后進行人工篩分，測定各個處理的香梨枝條質量、蟲砂量、渣土量，計算蟲體取食量、蟲體質量增量、蟲體轉化率、蟲砂轉化率、蟲砂收獲系數、有機物料量（質量均以干質量計，g），并檢測幼蟲腸道、體表及蟲砂是否帶有梨火疫病菌，通過綜合比較幼蟲轉化力數據篩選最優技術參數。

蟲體質量增量=取食后蟲體質量-初始蟲體質量

取食量=取食前總干質量-香梨枝條質量-殘渣質量

蟲體轉化率=蟲體質量增量（/ 取食量-蟲砂質量）×100%

蟲砂收獲系數=蟲砂質量/總干質量

飼料利用率=（總飼料量-剩余飼料量）/總飼料量×100%

蟲砂轉化率=蟲砂量（/ 取食量-蟲體質量增量）×100%

1.3 梨火疫病菌RPA-LFD檢測

腐解菌發酵試驗后，采用安普未來生物科技有限公司的DNA 恒溫快速擴增試劑盒進行梨火疫病菌RPA-LFD檢測，主要步驟如下：

（1）樣品準備

取各處理樣品200～300 mg放入裝有500 μL無菌去離子水的滅菌離心管中，利用無菌玻棒搗碎，然后靜置3～5 min備用；以未發病的香梨枝條為陰性對照，以梨火疫病菌懸浮液（OD600約為0.02）作為陽性對照。

（2）RPA擴增

將儲存于冷藏盒內的試劑盒所需組分振蕩3～5下，放置在離心管板架上。依次向每個干粉反應管中加入不同發酵時間對照的試劑A buffer、上游引物（10 μmol·L^-1）、下游引物（10 μmol·L^-1）、探針（10μmol·L^-1）和ddH₂O。分別將上述各樣品浸出液2 μL加入反應管。向每個反應管的蓋子內側加入2.5 μLB buffer，上下顛倒甩動反應管8～10次，充分混勻。將混勻后的反應液快速離心至反應管底部，立即放入金屬浴39 ℃孵育15 min，將反應后的擴增產物于冰上靜置3 min。以梨火疫病菌的基因組DNA 為陽性對照，以無菌去離子水作為陰性對照。梨火疫病菌RPA反應體系如表3所示。

（3）LFD檢測

取10 μL擴增產物加入到190 μL無菌去離子水中，混勻后插入側流層析試紙條（沃伯博生物有限公司），浸泡3 min。

（4）Zeller培養基平板計數

將檢測為陽性的樣品取含香梨枝條10 g，用玻璃珠鋪滿500 mL錐形瓶的底部，加入100 mL 0.1%吐溫80無菌水振蕩30 min，每個處理分別稀釋至10⁴倍，每個梯度4個重復，取各樣品100 μL在Zeller改良培養基[18]上涂板，放置于28 ℃恒溫培養箱中培養2 d，菌落計數，計算帶菌量。

每克樣品中菌落形成單位=同一稀釋度3次重復的平均數×10n×10，n 為稀釋倍數。

1.4 數據分析

運用SPSS 23.0軟件對正交結果進行有重復觀察值無交互作用的三因素五水平方差分析。對CK組和3個因素分別進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并利用Tukey 多重比較分析法（Plt;0.05）評估不同處理之間的差異。采用Microsoft Excel 2013 軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 腐解菌添加對發酵過程中堆體溫度的影響

整體來看，試驗過程中添加腐解菌劑和不同比例牛糞可以提高物料發酵溫度，各處理溫度均呈現先急速上升、后隨著翻堆呈現波動性下降的趨勢，各處理堆體溫度均高于同一天的平均氣溫，均超過55 ℃并維持3 d以上（表4）。

1 d后，添加RW菌劑和VT菌劑的物料發酵溫度顯著低于添加EM菌劑的物料發酵溫度。以每隔5 d為一個發酵周期，腐解菌劑對物料發酵溫度的影響并未達到顯著差異的水平，整體趨勢比較平緩。前15 d以EM腐解菌劑溫度最高。LK腐解菌劑前期溫度較低，15 d 以后溫度逐漸升高，20～30 d 時均為最高。RW腐解菌劑持續保持最低溫度狀態。CK組前期溫度較高，后期溫度逐漸降低。對于牛糞添加比例，前10 d溫度最高的牛糞配比為20%，溫度較低的牛糞配比為50%，15 d以后所見趨勢相反。

2.2 發酵對梨火疫病菌的影響

采用RPA-LFD方法對梨火疫病菌進行檢測，發酵前香梨疫木枝條平均帶菌量為5.2×10⁶ cfu·g^-1，經過發酵后，在各處理中均未檢測出梨火疫病菌。在發酵過程中，各發酵堆的溫度均達到55 ℃且能維持3d，持續高溫可將香梨疫木枝條中所攜帶的梨火疫病病菌殺死，這與前人測定的梨火疫病病菌在45 ℃下處理10 min可使其完全致死的結果一致。同時，白星花金龜幼蟲轉化后其腸道、體表及蟲砂中也均未檢測出梨火疫病菌。可見，攜帶梨火疫病菌的香梨枝條發酵后再經過白星花金龜3齡幼蟲過腹轉化后進行還田已無傳播梨火疫病病菌的風險。該方法有利于解決新疆地區庫爾勒香梨疫木枝條傳播病菌、處理困難的問題，為香梨疫木枝條的綠色資源化回收利用提供了可行性方案。

2.3 白星花金龜轉化香梨枝條混合物物料形態變化

香梨疫木枝條生物轉化過程見圖1。將堆放到田間的疫木枝條粉碎后添加不同比例的牛糞、不同種類的腐解菌劑，在不同發酵時間發酵后，經白星花金龜幼蟲過腹轉化，可產生富含豐富養分的蟲砂及高蛋白的蟲體。在物料轉化第3天時，各處理物料均呈現初始混合態，且各個處理間尚未出現明顯差異。轉化到第6天時，香梨枝條已呈現被進食痕跡，下方已出現少量蟲砂。轉化試驗至第9 天時，大量雜質浮上物料頂部，形成明顯的分層現象。第12天取食結束時，蟲砂呈現出高純度狀態，下層蟲砂與上層雜質之間出現明顯分層。從整體物料形態觀察可見，菌蟲復合技術對香梨枝條轉化具有直觀影響。

2.4 三因素對白星花金龜轉化香梨枝條的影響

由表5可知，在腐解菌劑對白星花金龜3齡幼蟲轉化影響方面，LK菌劑處理白星花金龜幼蟲的取食量、質量增量、蟲砂量和蟲砂轉化率、物料利用率及蟲體轉化率均顯著高于其他菌劑；LL菌劑表現良好，除LK 菌劑外，LL菌劑處理白星花金龜幼蟲質量增量、蟲體轉化率均顯著高于其他菌劑。在牛糞添加比例對白星花金龜3齡幼蟲轉化影響方面，牛糞添加比例為40%時，幼蟲取食量、質量增量、蟲砂量、蟲砂轉化率、物料利用率、蟲體轉化率均顯著高于牛糞其他添加比例；牛糞添加比例介于30%～50%時，蟲砂量、取食量、物料利用率顯著增加。在酵化時間對白星花金龜3齡幼蟲轉化率影響方面，酵化25 d時幼蟲質量增量、蟲體轉化率、蟲砂轉化率和蟲砂量均顯著增加；取食量、物料利用率為酵化30 d最佳，但與酵化25 d時差異不顯著；綜合比較各項指標，酵化時間以25 d為最佳。

在不同篩選指標下，明確菌劑、牛糞添加比例和酵化時間的最優組合。以取食量為篩選指標，LK菌劑、牛糞添加配比40%和酵化30 d為最優組合；以蟲砂量為篩選指標，LK菌劑、牛糞添加配比40%和酵化25 d為最優組合；以質量增量為篩選指標，LK菌劑、牛糞添加配比40% 和酵化25 d為最優組合；以蟲砂轉化率為篩選指標，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化25 d為最優組合；以蟲體轉化率為篩選指標，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化25 d為最優組合；以物料利用率為篩選指標，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化30 d為最優組合。綜合各項指標分析，同時考慮盡可能減少牛糞添加比例、酵化時間及物料處理成本，LK菌劑、牛糞添加比例40%和酵化25 d為三因素最佳組合。

由表6可知，白星花金龜3齡幼蟲對不同發酵時間下香梨枝條的轉化率差異顯著。酵化25 d后，幼蟲在取食量、蟲砂量、質量增量、飼料利用率及蟲體轉化率等指標上均顯著高于其他處理，蟲砂轉化率在發酵25 d和30 d時差異并不顯著，綜合對比各項指標，發酵25 d為香梨枝條最佳發酵時間。

3 討論

根據《糞便無害化衛生要求》（GB 7959—2012），連續3 d最高堆肥堆溫達到55 ℃以上，可殺死堆體內大部分病原體。本試驗采用腐解菌+牛糞+白星花金龜幼蟲聯合生物轉化香梨枝條廢棄物，酵化后各處理均未檢測出梨火疫病菌，符合無害化要求。添加一定量外源菌劑在堆肥中，可加快堆體溫度升高，促進有機物分解，延長高溫持續時間[19]。喬如陸等[20]發現，在堆肥中添加外源菌劑可加速堆肥升溫速度。何宙陽等[21]的研究也證實，添加復合菌劑能夠有效提高堆肥溫度、縮短堆肥周期、提高腐熟度。在本試驗的酵化香梨枝條+混合物試驗過程中，添加5種腐解菌劑的處理均表現為3 d發酵溫度超過55 ℃，這一結果證實了前人的研究結論。發酵溫度高低可以反映出腐解菌等微生物活動的強弱，在本試驗從酵化第25天開始，物料發酵溫度開始逐漸下降，酵化活動減少，物料發酵隨著時間的推移基本完成。Bernal 等[22]的研究也證實，微生物代謝活動隨著堆體中可降解物質的消耗而逐漸減弱，同時發酵堆溫度也逐漸下降。

將農業廢物轉化為可食用蛋白質的人工飼養昆蟲已被部分學者認可[23]，白星花金龜幼蟲的蛋白質含量高、脂肪含量低，是優質的新型可持續蛋白質[24]。田小燕等[25]對玉米秸稈進行轉化處理，在酵化預處理下，白星花金龜幼蟲可以將有機物料高效轉化為高價值的昆蟲蟲體。楊誠等[17]的研究表明，白星花金龜的幼蟲能夠較好地轉化玉米秸稈，經過25 d的發酵后，白星花金龜對玉米秸稈的轉化效率達63.82%，飼料利用率為17.51%，將牛糞添加到秸稈中能夠明顯提升白星花金龜幼蟲的取食效率。白星花金龜具有繁殖力強、易飼養及幼蟲食腐性等特征，在轉化農業有機廢棄物方面發揮了重要作用。本試驗通過物理方法將香梨疫木枝條粉碎后，通過添加菌劑和一定比例的牛糞，顯著改善了白星花金龜幼蟲取食效果。其中，以添加LK菌劑、牛糞添加40%、發酵25 d為最佳蟲菌復合生物轉化梨火疫病疫木參數，且各處理蟲砂中均未檢測到梨火疫病菌，該方法不僅高效轉化了梨樹疫木枝條，而且阻斷了病菌的進一步傳播擴散。張廣杰[12]的研究也證實，對棉花黃萎病帶菌棉稈和根茬飼料進行酵化5 d以上，經過白星花金龜轉化后蟲砂中未檢測出棉花黃萎病微菌核，酵化棉稈對白星花金龜幼蟲的質量累計增加量影響顯著；酵化25 d后，白星花金龜幼蟲每取食飼料100 g可轉化3齡蟲體3.06g，產生蟲糞70.92 g。同時，白星花金龜3齡幼蟲干物質中蛋白質、脂肪和氨基酸總量分別為49.90%、15.42%和38.90%，可作為高蛋白源用于畜禽以及特種經濟動物飼喂[26]。

4 結論

（1）在牛糞香梨枝條和菌劑混合物料發酵過程中，各處理發酵溫度均高于同天平均氣溫，其中EM菌劑腐解效果最好，LK菌劑次之。各處理中均未檢測到梨火疫病菌，表明酵化過程中的高溫有助于去除梨火疫病菌。

（2）在白星花金龜取食試驗中，白星花金龜3齡幼蟲在發酵物料中均能正常生長，經白星花金龜過腹轉化12 d 后，幼蟲質量增量最高可達8.38 g，蟲砂量最高可達83.55 g，蟲砂轉化率最高可達94.26%。綜合考慮減少牛糞添加比例、酵化時間及物料處理成本，白星花金龜幼蟲最佳取食組合方案為LK菌劑、添加40%的牛糞及酵化25 d，且白星花金龜轉化產物蟲體和蟲砂中均未檢測出梨火疫病菌。

（3）蟲菌復合技術在實現香梨疫木枝條資源化利用的同時，從根源上阻斷了疫木枝條傳播梨火疫病菌的途徑，達到了綠色環保、生態循環的效果。