4種微生物殺蟲劑對點尾尺蛾幼蟲的時間劑量死亡率模型分析

摘要為篩選適用于防治點尾尺蛾Ourapteryx nigrociliaris的微生物殺蟲劑，發展粗榧Cephalotaxus sinensis等藥用植物害蟲的生物防治，采用浸漬法測定了甘藍夜蛾核型多角體病毒Mamestra brassicae nuclear polyhedrosis virus、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis、球孢白僵菌Beauveria bassiana、金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421對點尾尺蛾幼蟲的致死效應，并使用時間劑量死亡率（TDM）模型進行模擬。結果表明，TDM模型均通過Hosmer-Lemoshow擬合異質性檢驗，4種微生物殺蟲劑處理10 d的幼蟲校正死亡率最高分別達到79.31%、86.21%、93.10%和72.41%，半致死濃度LC50分別為1.81×106 PIB/mL、2.71×103 IU/mL、9.40×106孢子/mL以及9.86×106孢子/mL。綜合考慮藥劑致死率和致死速度，球孢白僵菌、蘇云金芽胞桿菌和甘藍夜蛾核型多角體病毒的殺蟲效果優于金龜子綠僵菌CQMa421，更具應用潛力。本研究為點尾尺蛾的生物防治提供了參考依據。

關鍵詞點尾尺蛾;粗榧;微生物殺蟲劑;時間劑量死亡率模型;毒力測定

中圖分類號：S 763.7文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023492Time-dose-mortality model of four microbial insecticides on

Ourapteryx nigrociliaris LeechWANG Shujie LIU Ziye SUN Bin LU Xiaojun WEN Junbao（1. State Key Laboratory of Efficient Production of Forest Resources， Beijing Key Laboratory for Forest

Pest Control， Beijing Forestry University， Beijing100083， China;Gko+gINjMhJGs4ReDW9ZLc//Zpio+PwqLN0IED/NBOs= 2. Dongcha Forest Farm of Xiaolong

Mountain Forest Conservation Center， Gansu Province， Tianshui741035， China）AbstractTo identify microbial pesticides suitable for controlling Ourapteryx nigrociliaris and develop biocontrol strategies for pests damaging Cephalotaxus sinensis and other medicinal plants， the laboratory toxicities of Mamestra brassicae nuclear polyhedrosis virus， Bacillus thuringiensis， Beauveria bassiana， and Metarhizium anisopliae strain CQMa421 against O.nigrociliaris larvae were measured by using the dipping method. A time-dose-mortality model （TDM） was established and validated using the Hosmer-Lemeshow test. The highest corrected mortality rates of the four microbial pesticides reached 79.31%， 86.21%， 93.10%， and 72.41%， respectively. The LC50 values were determine as 1.81×106 PIB/mL， 2.71×103 IU/mL， 9.40×106 spores/mL， and 9.86×106 spores/mL， respectively. Considering both mortality rate and speed of mortality， B.bassiana， B.thuringiensis， and Mamestra brassicae nuclear polyhedrosis virus demonstrated superior insecticidal efficacy compared to M.anisopliae strain CQMa421， demonstrating higher potential for application. This study provides valuable insights for the biocontrol of O.nigrociliaris.

Key wordsOurapteryx nigrociliaris;Cephalotaxus sinensis;microbial insecticide;time-dose-mortality model;

toxicity bioassay粗榧Cephalotaxus sinensis （Rehder & E.H. Wilson） H.L.Li又名中國粗榧、粗榧杉，為三尖杉科Cephalotaxaceae三尖杉屬Cephalotaxus植物，其化學內含物三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿對急性非淋巴細胞性白血病和慢性粒細胞白血病有較好療效，在國內已被開發為臨床使用的抗癌藥物［1］，高三尖杉酯堿也成為了我國首創推薦應用于臨床的抗白血病新藥，收載于1990年版《中國藥典》并被衛生部列入常用47種抗癌藥之一［2］。自1976年以來，江西省九江市［3］、安徽省安慶市［4］、陜西省寶雞市［5］等地的粗榧曾受點尾尺蛾幼蟲Ourapteryx nigrociliaris Leech取食為害，由于缺乏種群動態監測方法和防治經驗，大量枝葉被取食，植株枯死，珍稀的粗榧資源遭到嚴重破壞。

點尾尺蛾又稱粗榧尺蠖、點尾尺蠖，隸屬于鱗翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae灰尺蛾亞科Ennominae尾尺蛾屬Ourapteryx，寄主除粗榧外，還包括紅豆杉Taxus wallichiana var. chinensis （Pilger） Florin［5］和三尖杉Cephalotaxus fortunei Hooker［4］等植物。點尾尺蛾在我國陜西、甘肅、貴州、西藏、湖南、河南、江西、安徽、福建、四川、臺灣等地均有分布［37］。幼蟲期長，1～2齡幼蟲聚集取食寄主新梢的嫩葉上表皮，導致嫩葉受太陽暴曬后呈焦灼狀;隨著齡期增加，幼蟲為害加重，3齡及以上幼蟲嚙食嫩葉、老葉以及新萌發的枝梢樹皮，導致木質部暴露、枝條枯死，嚴重影響樹勢以及新梢萌發［5］。

目前對點尾尺蛾的防治以噴施滅幼脲、高效氯氰菊酯、敵敵畏、樂果等化學藥劑為主，兼有人工捕殺、清理雜槎等措施［5］，缺乏生物防治的相關研究。近年來我國生防微生物及新型微生物農藥種類逐漸增加，應用于林業害蟲的防治案例逐步增多。已有學者篩選出一批對尺蛾科害蟲致死率較高的微生物，病毒（灰茶尺蠖核型多角體病毒、油桐尺蠖核型多角體病毒、甘藍夜蛾核型多角體病毒等）、細菌（短隱桿菌、蘇云金芽胞桿菌等）和真菌（球孢白僵菌、金龜子綠僵菌等）等微生物殺蟲劑具有對環境影響小、對人畜毒性低等優點［89］，對茶尺蠖Ectropis obliqua Prout［1011］、灰茶尺蠖E.grisescens Warren［11］、油桐尺蠖Buzura suppressaria Guenée［1213］、橙帶藍尺蛾Milionia basalis Druce［14］、小蜻蜓尺蛾Cystidia couaggaria （Guenée）［15］等害蟲有良好防效，尚無應用于點尾尺蛾防治的相關報道。

為了篩選適用于防治點尾尺蛾的微生物殺蟲劑，發展粗榧等藥用植物蟲害的無害化防治技術，本研究選取已實現大規模生產的甘藍夜蛾核型多角體病毒Mamestra brassicae nuclear polyhedrosis virus、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis、球孢白僵菌Beauveria bassiana、金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421，研究它們對點尾尺蛾幼蟲的室內毒力，運用時間劑量死亡率（TDM）模型分析4種藥劑的劑量效應及時間效應，計算并比較各藥劑的半致死時間LT50和半致死濃度LC50，旨在為點尾尺蛾的防治提供參考。

1材料和方法

1.1供試材料

點尾尺蛾6齡幼蟲于2023年6月采自甘肅省小隴山林業保護中心東岔林場（34°08′N-34°15′N，106°16′E -106°26′E），之后將幼蟲轉移至帶孔的一次性圓形帶蓋塑料餐盒（容量1 000 mL）中，飼以清水沖洗過的新鮮粗榧枝葉，每日更換。飼養和試驗均在人工氣候培養箱（PRX-250A，寧波賽福實驗儀器有限公司）內進行，條件為溫度（23±3）℃，相對濕度（75±5）%，光周期L∥D=14 h∥10 h。

4種微生物殺蟲劑包括：20億PIB/mL甘藍夜蛾核型多角體病毒懸浮劑（江西新龍生物科技股份有限公司）、8 000 IU/μL蘇云金芽胞桿菌懸浮劑（山東魯抗生物農藥有限責任公司）、100億孢子/mL球孢白僵菌可分散油懸浮劑（重慶聚立信生物工程有限公司）、80億孢子/mL金龜子綠僵菌CQMa421可分散油懸浮劑（重慶聚立信生物工程有限公司）。使用無菌水作為對照（CK）。預試驗于2022年7月-8月在西北農林科技大學火地塘試驗林場完成，參考預試驗結果，每種殺蟲劑設置5種濃度梯度（表1）。

1.2室內毒力測定

采集新鮮健康的粗榧枝葉，稱重后分成重量相等的多份備用，每份（55±1） g。每個處理濃度均配制500 mL藥液。將單份粗榧枝葉置于藥液中浸泡1 min后取出，晾干至無液滴滴落后放入均勻打孔的一次性圓形帶蓋塑料盒（1 000 mL）中（盒底部放置1張直徑9 cm的濾紙，加入2 mL無菌水保濕），用潔凈玻璃棒挑入10頭饑餓處理12 h的6齡幼蟲，蓋好盒蓋。帶藥葉片飼喂24 h后，每隔24 h更換清水沖洗并晾干的新鮮粗榧枝葉，并檢查和記錄幼蟲死亡情況。用直頭鑷輕觸并移動蟲體，無躲避或扭動則判定為死亡。空白對照中，粗榧枝葉的浸漬使用無菌水，其余處理同前述。每種殺蟲劑設置5個濃度，每濃度處理重復3次。

1.3數據處理與分析

根據Abbott氏校正公式，使用Excel計算處理組的校正死亡率。

校正死亡率=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100%

采用時間劑量死亡率（TDM）模型分析4種微生物殺蟲劑不同濃度藥液對點尾尺蛾幼蟲的毒力測定數據。參考馮明光［1617］的方法，將劑量效應和時間效應統一到一個模型中并考察互作關系，體現所測數據的完整性和客觀性。對于一個包含I個變量、觀察J次的生物測定，任意劑量di （i=1， 2， 3， …，I ） 在任意時間tj （j=1， 2， 3， …，J ）導致的試蟲累計死亡概率（cumulative mortality probability） pij公式為：

p_ij=1-exp｛-exp［τ_j+βlg（d_i）］｝

上式中待估參數β為描述劑量效應的斜率，是描述假設存在的每個關鍵生物受體接受到的活性或毒性分子的平均數目;實際對應于時間tj的參數為τj，指對應于時間區間［t_j-1， t_j］的未知參數。由于累計死亡概率是包含連續性時間變量的非獨立性變量，因而不能直接模擬p_ij。若時間區間［t_j-1， t_j］足夠短，且各區間相互獨立，則di使試蟲在區間［t_j-1， t_j］內可能發生的死亡概率就是獨立變量，即條件死亡概率（conditional mortality probability），指區間結束時死亡數與區間起始時的存活數之比，表示為：

q_ij=1-exp｛-exp［γ_j+βlg（d_i）］｝

q_ij式中待估參數β意義同pij計算公式，γ_j為描述區間［t_j-1， t_j］內的待估時間效應參數。條件概率的計算依賴于完全相互獨立的時間區間［18］，模型中參數γ_j和β的最大似然估計可通過二項式分布變量的最大似然函數逼近法求得，進而估計出所有參數。

本研究采用DPS數據處理系統（v 9.01）進行TDM模型擬合以及相關參數的估計，并通過Hosmer-Lemeshow法檢驗模型的擬合優度，再使用擬合的時間效應和劑量效應參數估計隨時間變化的致死中時、致死中濃度及95%置信區間。

2結果與分析

2.1不同處理中點尾尺蛾幼蟲的死亡率變化

不同濃度的甘藍夜蛾核型多角體病毒、蘇云金芽胞桿菌、球孢白僵菌和金龜子綠僵菌CQMa421對點尾尺蛾幼蟲處理不同時間內累計校正死亡率見圖1，各處理的校正死亡率隨處理后時間的延長而遞增，隨濃度的降低而遞減。部分處理組在藥后1 d出現少量死亡，與對照組相比，處理組存活的幼蟲取食量均有減少，行為和反應相對遲緩。最高濃度的4種藥劑對幼蟲的校正死亡率在處理2～4 d后迅速增加，至藥后10 d，上述濃度藥劑的校正死亡率分別達到79.31%、86.21%、93.10%和72.41%。

2.2時間劑量死亡率（TDM）模型輸出結果和分析使用各處理組的校正死亡率進行 TDM 模型分析和參數估計，結果見表2。經Hosmer-Lemeshow 擬合度測試，χ²_MbNPV=4.738 8（df=8， P=0.785 09），χ²_Bt=3.335 1（df=8， P=0.911 60），χ²_Bb=1.323 9（df=8， P=0.995 26），χ²_CQMa421=4.357 8（df=8， P=0.823 49），均小于相同自由度的χ²_0.05，表明4種微生物殺蟲劑的數據均通過了Hosmer-Lemeshow擬合度測試，擬合模型的異質性不顯著，模型有效。

甘藍夜蛾核型多角體病毒、蘇云金芽胞桿菌、球孢白僵菌和金龜子綠僵菌CQMa421各濃度處理與時間效應參數的t值均達到極顯著水平（P＜0.01），表明各參數估計的標準誤（SE）相對于參數估計值極小，模型擬合良好，各藥劑都對點尾尺蛾幼蟲有極顯著的劑量效應和時間效應。4種微生物殺蟲劑對點尾尺蛾劑量效應的斜率β分別為1.021 6、1.354、1.554 3和1.210 7，時間效應參數γ分別在處理后第10天、第5天、第10天和第8天達到最大（表2）。

2.3致死濃度及致死時間

隨著處理后時間的增加，LC50和LC90對數值降低，表明藥劑達到LC50和LC90所需的濃度下降（圖2）。各組試蟲在處理1～3 d內死亡數較少，因此1～3 d的LC50偏大;處理后4～10 d，甘藍夜蛾核型多角體病毒LC50由2.33×107 PIB/mL降至1.81×106 PIB/mL，蘇云金芽胞桿菌LC50由1.71×104 IU/mL降至2.7wtjnqH08rRJmxUdNvRuDcZTaI36YSOzloYjV+WUUCZY=1×103IU/mL，球孢白僵菌LC50由8.22×107孢子/mL降至9.40×106孢子/mL，金龜子綠僵菌CQMa421的LC50由1.22×108孢子/mL 降至9.86×106孢子/mL。整個試驗中僅球孢白僵菌1.00×108孢子/mL處理組的校正死亡率超過90%，因此模型中各藥劑的LC90整體偏大。

另外，4種微生物殺蟲劑對點尾尺蛾的半致死時間（LT₅₀）隨著處理劑量的增加而遞減，其中1.00×10⁸ 孢子/mL球孢白僵菌和20 000 IU/mL蘇云金芽胞桿菌的致死速度較快，LT₅₀分別為3.60 d和3.86 d，而2.00×10⁷ PIB/mL甘藍夜蛾核型多角體病毒及5.00×10⁷孢子/mL金龜子綠僵菌CQMa421致死速度稍慢，LT50分別為4.33 d和5.15 d（表3）。部分劑量處理中試蟲最終的校正死亡率低于50%，無法計算對應的LT50。此外，僅1.0×10⁸孢子/mL球孢白僵菌處理的點尾尺蛾校正死亡率超過90%，該濃度藥劑的LT90為8.07 d，其余處理組均無LT90的。

3討論

本研究結果表明，4種微生物殺蟲劑對點尾尺蛾6齡幼蟲均有較好的殺蟲活性。室內條件下，球孢白僵菌和蘇云金芽胞桿菌的最高濃度處理組達到半數致死量用時分別為3.60 d和3.86 d，甘藍夜蛾核型多角體病毒及金龜子綠僵菌CQMa421也分別在處理后4.33 d和5.15 d達到半數致死量，尤其是1.0×10⁸孢子/mL球孢白僵菌處理10 d后校正死亡率達到了93.10%。綜合考慮致死率和致死速度，可以進一步探究甘藍夜蛾核型多角體病毒、蘇云金芽胞桿菌和球孢白僵菌3種藥劑在野外的防效。

甘藍夜蛾核型多角體病毒于1979年在甘藍夜蛾死亡幼蟲中成功分離［19］，對甘藍夜蛾Mamestra brassicae （Linnaeus）、棉鈴蟲Helicoverpa armigera （Hübner）［20］、茶尺蠖［21］等多種鱗翅目食葉害蟲防效良好。本研究通過測定甘藍夜蛾核型多角體病毒對點尾尺蛾6齡幼蟲的室內毒力，發現幼蟲死亡率較高、達到半數致死量的時間較短，證明該藥劑具有一定的防治應用潛力。蘇云金芽胞桿菌的致死作用可能與溫度有關，金銀花尺蠖Heterolocha jinyinhuaphaga Chu的老熟幼蟲（5齡）感染該菌后，在15～31℃范圍內幼蟲死亡率隨溫度升高而上升，35℃時幼蟲校正死亡率開始下降［22］;幼蟲密度也可能影響蘇云金芽胞桿菌的藥效，例如黏蟲Mythimna separata （Walker）接種蘇云金芽胞桿菌后，隨著幼蟲密度的增加，幼蟲存活率上升，存活時間延長［23］。這些因素可作為日后田間防治點尾尺蛾的施藥參考。球孢白僵菌對灰茶尺蠖也有較強致病力，且隨著球孢白僵菌濃度的增大，幼蟲死亡率升高［24］。另外，球孢白僵菌分生孢子在相對濕度>85%的環境中萌發和生長狀況良好，毒力較高［25］，在相對濕度>90%且接近100%的環境中，孢子萌發和侵染效果最佳［2627］。本研究設置的濕度接近小隴山林區自然環境下的濕度，雖未達到最適生長條件，但經球孢白僵菌處理后的點尾尺蛾幼蟲校正死亡率較高，便于后續進行野外防治試驗。根據殺蟲真菌具有殺蟲速度慢、接觸侵染的特點，彭國雄等［28］強調，應利用金龜子綠僵菌CQMa421提前防治低齡幼蟲（1～2齡），應盡量避免在幼蟲老熟期施藥，而本研究的試蟲齡期較大，這有可能是CQMa421處理組幼蟲校正死亡率偏低的原因。

本研究采用時間劑量死亡率（TDM）模型分析了4種微生物殺蟲劑對點尾尺蛾幼蟲的毒力，發現隨著時間延長，半致死濃度LC50的估計值減小;隨著劑量的增加，半致死時間LT50的估計值減小。時間效應和劑量效應是評價活性物質生物活性的重要指標，二者相互關聯［16］，而傳統的幾率值分析中，劑量和時間效應指標由相互獨立的經驗關系式確定，無法體現兩種效應的相關關系［17］。TDM模型一定程度上彌補了幾率值分析法使劑量和時間效應關系相互獨立的缺陷，在一個模型中同時分析時間、劑量及兩者互作的效應，直接明確藥劑致死動態規律、致死高峰期、致死劑量等評價指標，更能充分體現生物測定數據的完整性和客觀性［2930］。

本研究測定了4種微生物殺蟲劑的室內毒力，結果可能與實際應用情況有差異，還需進一步測定在野外應用的防效，明確適合在野外防治點尾尺蛾幼蟲的微生物殺蟲劑種類、劑型、濃度和施藥方式，探究其對環境中其他生物的影響。此外，還需要探究添加農藥助劑［31］以及與化學農藥復配混用［32］等方式對上述微生物殺蟲劑速效性和持效性的影響，從而更大限度地發掘微生物殺蟲劑的應用潛力。

4結論

甘藍夜蛾核型多角體病毒、蘇云金芽胞桿菌、球孢白僵菌和金龜子綠僵菌CQMa421對點尾尺蛾6齡幼蟲均有較好的殺蟲活性，綜合考慮藥劑致死率和致死速度，球孢白僵菌、蘇云金芽胞桿菌和甘藍夜蛾核型多角體病毒的殺蟲效果優于金龜子綠僵菌CQMa421，可用于下一步的野外防治試驗。

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（責任編輯：楊明麗）