牛筋草PFK蛋白多克隆抗體的制備及其在草甘膦抗性鑒定上的應用

摘要抗草甘膦牛筋草中磷酸果糖激酶（PFK）與靶標酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的含量存在線性關系，是牛筋草對草甘膦產生抗性的指示蛋白之一。為實現抗草甘膦牛筋草的快速鑒定，本研究克隆了牛筋草PFK全長基因，構建原核表達載體，并免疫大兔最終獲得多克隆抗體，進一步對抗體的特異性和靈敏性進行了檢測，并用該抗體對抗性牛筋草進行了檢測鑒定。結果發現，PFK基因全長1 656 bp，編碼551個氨基酸，該基因的原核表達載體pGEX-4T-1-PFK經誘導后表達的蛋白大小為45 kD，蛋白純化后濃度為3.5 mg/mL。制備的多克隆抗體能特異地識別牛筋草PFK蛋白，稀釋512 000倍后仍可檢測到抗原，并能夠準確鑒定PFK不同表達量的抗性牛筋草。結果表明：本研究制備的PFK多克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的特點，可鑒定EPSPS過表達的抗草甘膦牛筋草，這為牛筋草對草甘膦抗藥性的快速鑒定提供了實用工具。

關鍵詞磷酸果糖激酶;牛筋草;多克隆抗體;草甘膦;抗藥性

中圖分類號：S 451.1文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023453Preparation of polyclonal antibody against PFK protein and application

in identification of glyphosate resistance in Eleusine indicaCHEN Jingchao LI Zhiling CUI Hailan YU Haiyan MA Yufei LI Xiangju（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing100193， China; 2. Jining Normal University， Ulanqab012000， China）AbstractPhosphofructokinase （PFK） is one of8gbtRgdvOn/Morru/hyp2w== the indicator proteins for glyphosate resistance in goosegrass Eleusine indica as the content of PFK is positive correlation with the target 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase （EPSPS）. In this study， the full-length of PFK gene was cloned from E.indica， the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-PFK was constructed and polyclonal antibodies were obtained by immunizing rabbits. Then， the specificity and sensitivity of the antibody were detected. Results showed that the full length of PFK gene is 1 656 bp， encoding 551 amino acids. A 45 kD recombinant protein with the concentration of 3.5 mg/mL was obtained after IPTG induction and purification. The antibody could only specifically recognize the PFK protein of E.indica， and the antigen can still be detected when antibody was diluted by 512 000 times. The antibody could quickly identify the PFK protein and accurately identify the resistant goosegrass with different levels of PFK expression. These results suggested the PFK polyclonal antibody could identify glyphosate-resistant E.indica caused by EPSPS overexpression. This provides a practical tool for rapid identification of resistance to glyphosate for E.indica.

Key wordsphosphofructokinase;Eleusine indica;polyclonal antibody;glyphosate;herbicide resistance

惡性雜草牛筋草Eleusine indica （L.） Gaertn.是一年生禾本科穇屬植物，分布在溫帶和熱帶地區［1］。在我國的果園、棉田、玉米、西甜瓜等作物田危害嚴重，可造成減產20%［2］。草甘膦是一種廣譜、非選擇性的有機磷類除草劑，可有效地防除牛筋草等一年生及多年生雜草，是目前全球用量最大的除草劑之一［3］。由于長期高頻應用，全球已報道了58種雜草對草甘膦產生抗性［4］，在我國廣東、廣西等省（區）牛筋草對草甘膦產生了較高水平的抗性，主要發生在果園、茶園、棉田等作物田［58］。隨著我國生物育種產業化的逐步推進，草甘膦的應用范圍將會明顯擴大［9］。在生長初期快速鑒定抗性植株，對于控草策略的合理制定，阻斷抗性雜草的傳播蔓延都有重要意義。目前，抗草甘膦雜草的檢測方法仍以整株生物測定為主，該方法周期較長;靶標基因突變或過表達分析等分子技術耗時相對較短，但是對儀器和操作技術都有較高的要求。操作簡單、能夠快速辨別抗草甘膦雜草的方法是目前的重要需求之一。酶聯免疫吸附測定法（ELISA）是檢測蛋白含量的簡便方法，耗時短，對儀器操作的技術要求相對較低，而制備穩定性強、靈敏度高的多克隆及單克隆抗體是ELISA檢測試劑盒研發的核心。目前已報道了多種有害生物抗體，如：魔芋花葉病毒（konjac mosaic virus， KoMV）［10］、菊花B病毒（chrysanthemum virus B， CVB）［11］、馬鈴薯卷葉病毒（potato leafroll virus， PLRV）［12］等多克隆抗體，以及不同作物花葉病毒的單克隆抗體［1315］。

5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS，EC2.5.1.19）是草甘膦的靶標酶，草甘膦競爭性抑制該酶的活性，阻斷了植物體內芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的合成而引起植物死亡［3］。研究發現，靶標基因EPSPS過量表達是牛筋草對草甘膦產生抗性的常見抗性機制，抗性牛筋草的EPSPS與磷酸果糖激酶基因（PFK）轉錄水平、拷貝數及蛋白表達量都存在線性關系［16］，因此PFK可以作為牛筋草對草甘膦產生該類抗性的指示蛋白。為開發一種快速鑒定抗草甘膦牛筋草的新方法，本研究克隆了牛筋草PFK基因，構建了原核表達載體以獲取純化PFK蛋白，免疫大兔后獲得多克隆抗體，對抗體的效價和特異性進行了檢測，并成功應用于快速鑒定抗性牛筋草植株。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗草甘膦牛筋草種子采集于浙江省麗水市松陽縣西屏街道（119°30′E，28°28′N），敏感牛筋草種子采集于附近無草甘膦施用歷史的荒地。Escherichia coli Rosetta感受態細胞，限制性內切酶（EcoRⅠ、Not Ⅰ），DNA產物回收試劑盒，Ni柱，完全弗氏佐劑，非完全弗氏佐劑，SuperReal熒光定量預混試劑購于天根生化科技（北京）有限公司;高純度RNA提取試劑盒，All-in-One反轉錄試劑盒購于北京全式金生物技術股份有限公司;植物蛋白質提取試劑盒和BCA蛋白定量分析試劑盒購自北京賽諾博生物技術中心;內參蛋白Actin購于湖北武漢愛博泰克生物科技有限公司;其余試劑均為國產分析純。

1.2PFK基因的克隆及構建原核表達載體

1.2.1PFK基因的克隆

根據NCBI中登錄的PFK序列（KU549087.1），設計2對引物克隆PFK基因全長，A-F：5′-CGCGCAAAGCCCATCCAAA-3′，A-R：5′-TTCCTGAA-GCATCTTTCCCAAT-3′;B-F：5′-CTTGACCCCA-AAATGCGTAAA-3′，B-R：5′-GTGTGAAAAAA-AATCGCCTGC-3′ijMzFU7QNVX5JRU7XCi/DQAlRWGYabK/T2nZRffi70o=，引物合成及PCR產物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，序列驗證后委托北京擎科新業生物科技有限公司人工合成牛筋草PFK基因至載體pUC57，得到PFK基因凍干質粒。

1.2.2構建原核表達載體

利用CFSSP蛋白二級結構在線分析工具、TopPred 1.10蛋白疏水性在線分析工具和Parker Antigenicity Plot蛋白免疫原性在線分析工具對氨基酸序列進行分析。根據軟件分析結果，設計引物克隆目的片段。上游引物5′-ATGGCGCAGCCGCCGGCATGGCGCAGCCGCCGGC-3′，下游引物：5′-

ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCTCATC-TGACTCAAAATAGACCCTT-3′，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。以PFK基因凍干質粒為模板進行PCR擴增，產物經電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒純化回收備用。

將載體pGEX-4T-1用限制性內切酶37℃雙酶切過夜，回收載體片段。將目的基因片段與載體進行連接，16℃水浴過夜。將連接產物轉入E.coli Rosetta感受態細胞，挑取單菌落，重取1 μL進行菌液PCR，反應結束后使用1%瓊脂糖凝膠檢測，選取陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3PFK重組蛋白的誘導表達與純化

將含有原核表達載體pGEX-4T-1-PFK的菌液接種至LB培養液中，37℃培養至OD值達到0.5，加入0.8 mmol/L的IPTG，誘導表達4 h。收集菌體，破碎后離心并取上清進行SDS-PAGE檢測是否有單一條帶。將上清溶液經Ni柱純化后，檢測純化結果。

1.4PFK蛋白多克隆抗體的制備

飼養實驗級日本大耳白兔2只，待兔子長至2 kg左右時，將純化的重組蛋白0.6 mg與完全弗氏佐劑1∶1混合進行第1次皮下注射免疫;間隔14 d后，將0.3 mg抗原與非完全弗氏佐劑1∶1混合進行第2次免疫;第3、4次免疫與前一次間隔14 d，免疫方法一致;第4次免疫12 d后，收集抗血清。使用His-MBP重組蛋白抗原偶聯NHS活化的瓊脂糖柱，親和純化抗血清，得到高純度的牛筋草PFK蛋白多克隆抗體，保存于-80℃。

1.5PFK蛋白多克隆抗體的檢測

1.5.1PFK蛋白多克隆抗體的特異性檢測

將純化后的PFK抗體作為一抗，PFK重組蛋白作為靶標蛋白，并稀釋至不同的含量（0.5， 1， 5， 10 mg/L）。以植物通用的內參蛋白Actin（武漢愛博泰克生物科技有限公司）為非靶標蛋白，依次稀釋（0.5， 1， 5， 10 mg/L）作為對照蛋白。PFK蛋白和Actin蛋白（10 μL）分別經凝膠電泳分離后，轉至聚偏二氟乙烯膜上，用1∶1 000稀釋的抗體進行Western blot檢測。

1.5.2PFK蛋白多克隆抗體的靈敏性檢測

將PFK蛋白多克隆抗體稀釋后，每孔中加入125 ng PFK重組蛋白作為靶標蛋白。將樣品加入酶標板內，輕晃;37℃溫育30 min;棄液體，甩干，加洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次;每孔加入50 μL酶標試劑;再次溫育洗滌后加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37℃避光15 min;每孔加50 μL終止液終止反應;450 nm波長下測量各孔的吸光度。根據吸光值以及微孔的液體顏色可分析抗體的靈敏性。

1.6PFK蛋白多克隆抗體的應用

種植敏感型和抗性牛筋草，置于溫室培養至5～6葉期，每個種群選取20株植株，剪取新鮮的葉片迅速置于液氮中，保存于-80℃。使用高純度RNA提取試劑盒提取RNA，并定量至1 000 ng/μL后，使用All-in-One反轉錄試劑盒獲得cDNA。使用SuperReal熒光定量試劑盒檢測PFK基因表達量。根據牛筋草PFK基因序列，設計特異性引物，上游引物為5′-GCCAAAGGGTCTATTTTGAGTC-3′;下游引物5′-AAGCCTCTATACCCACCCTGA-3′。選取ALS基因作為內參基因，上游引物5′-GCAAT-TTCCCCAGTGACGACC-3′，下游引物5′-GCAAA-AGCCTCTATCTTCCCTGT-3′［17］，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PFK基因的相對表達量根據2-△△Ct公式得出［18］。

根據qPCR篩選PFK相對低表達、中表達及高表達的抗性牛筋草及敏感植株，使用植物蛋白質提取試劑盒提取總蛋白。具體步驟為：取牛筋草葉片組織約100 mg，加入抽提試劑0.5 mL，勻漿處理;冰上孵育20 min后，4℃離心20 min;收集上清中的可溶性蛋白，并經BCA蛋白定量分析試劑盒進行蛋白定量，最后將可溶性蛋白放置在4℃備用。提取蛋白質經SDS-PAGE電泳后，經半干轉膜儀，轉移至硝酸纖維素膜上，以5％的脫脂奶粉（TBST緩沖液溶解）在4℃條件下，封閉2 h;加入純化的多克隆抗體（1∶1 000），4℃下，反應12 h;加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體（1∶2 000），在37℃條件下，反應1 h;采用化學發光顯色，根據條帶亮度判斷抗草甘膦牛筋草植株。

2結果與分析

2.1PFK原核表達載體的構建

經PCR擴增、產物測序及序列比對，得到PFK基因全長，該基因含有1 656個堿基，共編碼551個氨基酸。設計引物進行克隆、擴增后獲得大小為450 bp的基因片段，回收、純化后構建到載體pGEX-4T-1上，載體構建完成后進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到清晰、單一與預期大小一致的特定條帶（圖1），條帶在500 bp左右。陽性菌株送至北京擎科公司進行測序，測序結果表明序列與預期結果一致，證明原核表達載體pGEX-4T-1-PFK構建成功。

2.2PFK重組蛋白的誘導表達與純化

含有pGEX-4T-1-PFK載體的菌液經誘導處理后，取上清進行SDS-PAGE，檢測到一條明顯的蛋白條帶（圖2a），在45 kD左右，與預期結果一致。將上清溶液通過Ni柱純化后，再次SDS-PAGE檢測，與純化前相比，雜帶數目明顯減少，目標蛋白條帶清晰明顯（圖2b）。

2.3PFK蛋白多克隆抗體的制備

將純化的PFK重組蛋白作為抗原，按照免疫計劃多次免疫日本大耳白兔，血液處理后，將含有多克隆抗體的血清使用瓊脂糖柱純化，得到高純度的牛筋草PFK蛋白多克隆抗體。抗體的濃度可達到3.5 mg/mL。

2.4PFK蛋白多克隆抗體的檢測結果

2.4.1PFK蛋白多克隆抗體的特異性

Western blot方法分別檢測牛筋草PFK蛋白和植物Actin蛋白與PFK多克隆抗體的反應，結果如圖3所示，抗體與牛筋草PFK蛋白發生特異性結合，低濃度下仍可呈現微弱的條帶，條帶大小與圖2一致。而不同濃度的Actin蛋白沒有任何條帶。表明本試驗制備的多克隆抗體具有較高的特異性，可以用于檢測牛筋草體內的PFK蛋白。

2.4.2PFK蛋白多克隆抗體的靈敏性

將多克隆抗體按1∶1 000至1∶512 000進行倍比稀釋，包被于酶標板中，加入PFK重組蛋白后經過孵育、洗板、顯色等處理后在450 nm波長下，抗體所在微孔的吸光度如表1結果顯示。當抗體在稀釋512 000倍之后，仍能檢測到抗原，證明本試驗制備的多克隆抗體靈敏性高。

2.5利用PFK蛋白多克隆抗體鑒定抗草甘膦的牛筋草通過qPCR檢測牛筋草PFK基因的表達量，敏感與抗性牛筋草的表達量存在明顯差異。挑選PFK基因低、中、高表達量的牛筋草提取蛋白用于檢測多克隆抗體的靈敏性。敏感和抗性牛筋草的蛋白與純化的多克隆抗體反應后，可見雜交條帶（圖4），抗性植株的條帶信號明顯高于敏感植株。在抗性種群中，PFK表達量高的植株條帶粗且深，表達量低的條帶清晰，且信號明顯亮于敏感植株。可見牛筋草的PFK基因表達量越高，雜交條帶越粗，PFK多克隆抗體能夠特異性快速識別牛筋草體內的PFK蛋白，可用于鑒定抗草甘膦牛筋草。

3結論與討論

本實驗室在前期對牛筋草轉錄組結果分析及后續驗證中發現，抗性牛筋草的EPSPS和PFK基因表達量較敏感植株都發生了上調，其中PFK基因表達量是敏感型的7.1～19.9倍，EPSPS表達量是敏感型的5.7～12.9倍，兩基因的表達在不同植株中存在線性關系［16］。該現象在不同區域的抗草甘膦牛筋草中都有發現，基因組測序發現，EPSPS與PFK基因在染色體組的亞端粒部位上存在連鎖擴增的現象［19］。該結果進一步驗證了兩基因表達存在線性關系的現象。本研究發現PFK基因編碼序列全長1 656 bp，編碼551個氨基酸，獲得的PFK多克隆抗體純化后濃度達到3.5 mg/mL。經檢測，該抗體稀釋512 000倍后仍可檢測到抗原，且只與牛筋草PFK蛋白有特異性反應，反應條帶信號的強弱可用于判斷牛筋草PFK蛋白的含量。因此，通過比對疑似抗性與敏感植株PFK蛋白與抗體反應的條帶差異，可鑒定抗草甘膦牛筋草植株。PFK基因與黍稷Panicum miliaceum、柳枝稷P.virgatum、高粱Sorghum bicolor、玉米Zea mays的PFK基因序列相似性高達88%，其蛋白的氨基酸則有95%以上的相似性，推測本試驗制備的抗體也可同時識別其他物種的PFK蛋白。本研究制備的牛筋草PFK多克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的特點，可快速檢測鑒定EPSPS過表達的抗草甘膦牛筋草。但是，多克隆抗體的田間應用還需要大量工作，需建立相關的定性標準以減少誤差。

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（責任編輯：田喆）