4種方法脫除太子參BBWV和TuMV病毒的效果比較

摘要以太子參‘柘參1號’品種為試驗材料，比較微莖尖培養、低溫處理（2～4℃）結合微莖尖培養、超低溫（-196℃）培養、種胚培養等4種方法對蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV）和蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）的脫除效果，結果顯示采用低溫處理結合微莖尖培養，太子參成活率為64.7%，BBWV和TuMV的脫毒率分別為63.6%和31.8%;采用種胚培養的成活率為56.7%，對BBWV和TuMV的脫毒率均可達100%。病毒TuMV相較BBWV更難脫除。

關鍵詞太子參;花葉病毒;脫病毒方法;病毒檢測

中圖分類號：S 435.675文獻標識碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023562Comparision of effect of four methods for the virus-free of BBWV and

TuMV viruses in Pseudostellaria heterophyllaBU Hongsong WANG Ding ZHANG Xinyue ZHOU Dan ZHENG Shengwen KUANG Yunbo YE Zuyun（1. College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou350002， China; 2. The Engineering

Technology Research Center of Characteristic Medicinal Plants of Fujian，College of Life Sciences，Ningde Normal

University， Ningde352100， China; 3. Fujian Zheshen Biotechnology Research Co.， Ltd.， Ningde355300， China）AbstractThe effects of four methods， including microstem tip culture， low temperature （2-4℃） treatment combined with microstem tip culture， ultra-low temperature （-196℃） culture and embryo culture， on the virus-free of broad bean wilt virus （BBWV） and turnip mosaic virus （TuMV） from Pseudostellaria heterophylla ‘Zheshen No.1’ were compared. The results showed that the survival rate of P.heterophylla was 64.7%， and the virus-free rates of BBWV and TuMV were 63.6% and 31.8%， respectively， using low temperature treatment combined with micro-stem tip culture. The survival rate of embryo culture was 56.7%， and the virus-free rate of BBWV and TuMV was 100%. P.heterophylla mosaic virus TuMV is more difficult to remove than BBWV.

Key wordsPseudostellaria heterophylla;mosaic virus;virus-free method;virus detection

太子參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax為石竹科孩兒參屬多年生草本藥用植物，以塊根入藥，富含多糖、皂苷、氨基酸、環肽等活性成分，具有益氣健脾，生津潤肺之功效［1］。太子參主要栽培產區在福建、貴州、安徽等地［2］，是福建省道地藥材。太子參多以塊根進行無性繁殖，其種根容易受到病毒的侵染，使葉片出現褪綠斑、黃化斑，呈現葉片卷縮、植株矮小、塊根小等癥狀，導致產量低、品質差，通常造成減產15%～50%［34］，嚴重者可達到90%。感染病毒的太子參植株弱小，抗病性下降，易發生真菌類病害，種植戶噴施農藥防治，使農藥殘留和重金屬超標的可能性增加。因此，培育太子參脫病毒的健康種苗，是太子參藥材產業可持續發展的關鍵。

已報道的侵染太子參的病毒有4種，分別為蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV），蠶豆萎蔫病毒（broad bean wilt virus，BBWV），黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）［5］。在太子參道地產區福建柘榮縣，侵染太子參的病毒主要是BBWV和TuMV，也是對太子參影響最大的兩種病毒，染病率高達100%［67］，只有極少部分的植株感染CMV，未檢測出TMV［6］。

目前，已報道的太子參脫病毒的方法有微莖尖培養和超低溫培養［89］，存在脫毒率和成活率較低、操作繁瑣等問題。因此，探尋更高效、便捷的太子參脫病毒方法，是解決太子參產業發展之所急。本課題組在多年研究太子參脫病毒培養與應用的基礎上，創制出低溫處理結合微莖尖培養和種胚培養2種脫病毒方法。本研究針對柘榮地區太子參感染的2種主要病毒，比較4種不同的脫病毒方法對TuMV和BBWV的脫毒效果，旨在篩選最適宜的太子參脫病毒方法。

1材料與方法

1.1供試材料

以太子參栽培品種‘柘參1號’的種子及組培苗為材料。種子從寧德市柘榮縣際頭村太子參農場（北緯27.2°N，東經119.9°E，海拔664 m）栽培的‘柘參1號’收集獲得，用于太子參的種胚培養。太子參組培苗是以該農場栽培的‘柘參1號’植株幼嫩莖頂端為材料，經常規組培獲得，作為太子參微莖尖培養、低溫處理結合微莖尖培養和超低溫培養3種脫病毒方法的試驗材料。

儀器：數碼體視顯微鏡（LEICA EZ4，德國徠卡顯微系統有限公司）、高速冷凍離心機（3-18K，德國SIGMA）、PCR儀（ProFlex 3，美國ABI公司）、微量核酸濃度檢測儀（NanoDrop，美國熱電）、凝膠成像儀（JS-780，上海培清科技有限公司）等。

試劑和藥品：Trizol Universal總RNA提取試劑［天根生化科技（北京）有限公司］。

1.2試驗方法

1.2.1供試材料的病毒檢測與培養

取6份太子參組培苗材料，使用Trizol Universal總RNA提取試劑提取其總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用微量核酸濃度檢測儀進行定量分析，通過A260/A280和A260/A230檢測RNA質量，將合格的RNA反轉錄成cDNA，采用雙重RT-PCR分子檢測技術［10］進行病毒檢測，確認病毒種類，將有病毒的組培苗進行擴繁，作為對照樣本，同時也作為脫病毒培養的材料。

1.2.2脫病毒培養

供試材料經病毒檢測確定所攜帶病毒種類后分別采用微莖尖培養、低溫處理結合微莖尖培養、超低溫培養以及種胚培養。太子參誘導分化培養基為MS培養基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA［11］。

1.2.2.1微莖尖培養

以培養室內的常規太子參組培苗為試驗材料，于超凈工作臺上，剝取直徑為0.2 mm左右的組培苗頂端微小莖尖（圖2a），接入太子參誘導分化培養基，做好標記，進行暗培養，培養溫度（20±2）℃，15 d后轉入弱光培養，光照強度為18 μmol/（m2·s），30 d后轉入常規光照培養，光照強度56 μmol/（m2·s），統計其成活率、染菌率及脫毒率。

1.2.2.2低溫處理結合微莖尖培養

太子參組培苗在培養瓶內誘導形成微塊根［12］后，將培養瓶放入冰箱（2～4℃）低溫保存60～90 d，待微塊根的芽長至279ac1422040e6246e7be14e8f7f93fbea9e7e9785662de6b1b5df4e5a6f5a364～5 cm左右時，于超凈工作臺上剪取芽，剝取直徑為0.2 mm左右的芽頂端微小莖尖進行誘導培養（圖2b），使用的培養基、培養條件及觀測方法同1.2.2.1。

1.2.2.3超低溫培養

參照“一種利用微莖尖與超低溫脫除太子參蠶豆萎蔫病毒的方法”［9］，并進行改良： 無菌剝取培養室常規組培苗幼芽1～2 mm，將其放在培養基上暗培養3 d，培養基為MS培養基+140 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，培養溫度為4℃;隨后進行加載、玻璃化及超低溫（-196℃）處理，將處理后的幼芽接入太子參誘導分化培養基，0℃下暗培養5～7 d，使用的培養基、培養條件及觀測方法同1.2.2.1。

1.2.2.4種胚培養

選取飽滿的太子參種子，洗凈后用水浸泡12 h，隨后移至超凈工作臺上，使用75%乙醇消毒30 s，然后用0.1%升汞溶液消毒15 min，再用無菌水蕩洗4～5次，每次蕩洗2 min左右，剝取太子參種子內完整的胚（圖2c）進行培養，使用的培養基、培養條件及觀測方法同1.2.2.1。

1.2.3脫毒組培苗的病毒檢測

經過4種脫病毒方法培養，對成活的太子參脫毒組培苗（圖2d）進行病毒檢測，檢測方法同1.a73ce848d2d2f9344935de593ce081fc8c4ef8d36b8ea469df5304a2f132009f2.1供體材料的病毒檢測方法。

1.3數據處理

觀察記錄各項試驗數據，采用Excel 2019進行統計分析。

2結果與分析

2.1供試材料的病毒檢測

6份太子參組培苗樣品總RNA濃度檢測結果：各樣品的A260/A280比值在1.933～2.095之間，A260/A230比值在1.786～2.284之間，提取的太子參總RNA電泳圖譜均呈現兩條清晰明亮的條帶（28S、18S），滿足后續反轉錄的要求。6份樣品的病毒檢測結果見圖1，每份樣品均含有TuMV（774 bp）和BBWV（ 1 345 bp）。

2.24種脫病毒方法的培養效果

太子參脫病毒材料培養30 d后，成活及染菌情況統計結果見表1。低溫處理結合微莖尖培養及種胚培養成活率較高，分別為64.7%和56.7%，微莖尖培養成活率為33.3%，超低溫培養成活率最低，為16.2%;種胚培養染菌率為6.7%，微莖尖培養、低溫處理結合微莖尖培養和超低溫培養均未染菌。

2.34種脫毒方法的脫毒效果

2.3.1雙重RT-PCR病毒檢測

采用雙重RT-PCR分子檢測技術對太子參脫毒培養的組培苗進行病毒檢測（圖3～圖6）。結果顯示，種胚培養獲得的組培苗均未檢測出病毒，脫毒率為100%，其他3種脫病毒方法培養的組培苗脫毒率為14.3%～63.6%，具體結果見表2。

3結論與討論

植物莖尖脫病毒培養時，通常剝取的莖尖大小與成活率成正比，與脫毒率成反比。為了獲得較高的脫毒率，本研究中剝取的太子參微莖尖直徑均為0.2 mm左右，常規微莖尖培養和低溫處理結合微莖尖培養的成活率分別為33.3%和64.7%， BBWV的脫毒率分別為28.6%和63.6%，TuMV的脫毒率分別為14.3%和31.8%，低溫處理結合微莖尖培養的成活率和脫毒率均大幅度提高。太子參微塊根具有低溫萌芽的特性［11］，經低溫誘導后，解除休眠，微塊根的芽頂端分生組織生理特性增強，細胞的分裂、生長速度快且較一致，形成體積較大的頂端生長點（圖2b），微莖尖較容易剝取，培養成活率較高，脫毒效果明顯，操作方法簡便，能保持品種的優良特性。因此，低溫處理結合微莖尖培養是太子參脫病毒的首選方法。種胚培養成活率主要取決于剝取的種胚是否完整，種子由外種皮、內種皮、外胚乳和胚構成，其中種皮兩層：外種皮呈革質，較厚;內種皮呈膜質，很薄；外胚乳與內種皮粘連較緊，位于彎曲種胚的中間及兩側，易與種胚分離。種胚側向彎曲呈圓弧形，由胚根、胚芽、下胚軸和子葉構成。通過有性過程形成的種子一般無病毒或僅種子表面有病毒，研究表明太子參種子繁殖不傳播病毒，通過常規消毒能去除種子表面的病毒，而內部無病毒，但太子參成熟種子具有休眠特性，難以用于無病毒種苗的規模化生產，因此本試驗采用種胚培養脫除病毒，成活率高且易于操作。外胚乳對種子的萌發有抑制作用，外胚乳剝除不徹底或剝取的胚不完整，都會影響種胚培養的成活率。對BBWV、TuMV這2種病毒，太子參種胚培養的脫毒率均為100%。如果不考慮太子參種子變異問題，種胚培養是太子參脫病毒的最優方法。

超低溫培養對兩種病毒都有一定的脫毒效果，但其成活率低，且要用到液氮及其他各種藥品，操作比較繁瑣且成本高。 此外有報道采用熱處理結合莖尖培養的方法進行太子參的脫病毒，最終脫毒率僅為5.2%［5］。由于太子參不耐高溫，課題組在開展預試驗時發現，培養溫度超過30℃，植株生長停滯，出現休眠;超過35℃，植株開始枯萎發黃，出現死亡。因此，我們認為高溫培養結合微莖尖的脫毒方法不適用于太子參。有研究表明，TuMV是病毒家族中已知寄主范圍最廣的病毒，具有極強的侵染能力［1315］。本研究發現，太子參微莖尖培養相關的2種脫病毒方法中，剝取的微莖尖大小相同的情況下，TuMV的脫毒率只有BBWV的脫毒率的50%左右，說明太子參TuMV相較BBWV更難脫除，可能是由于TuMV侵染力較強，在植株生長點近處也有分布。

植物生產中使用脫毒苗，產量可以提高20%～270%［1617］。目前脫毒苗已廣泛應用于各種經濟作物的生產，部分藥用植物如懷地黃、半夏等在生產上也初步進行了脫毒苗的應用研究［1819］。花葉病毒引起的太子參種質退化、病害嚴重、產量和品質下降是太子參產業發展的瓶頸問題。課題組利用太子參脫病毒培養技術，對柘榮太子參主栽品種‘柘參1號’和‘柘參2號’都進行了脫病毒培養，工廠化繁育其脫毒苗，通過溫室大棚水肥一體化無土栽培擴繁，提供品種優良、純正、整齊的無病毒優質種根給種植戶，通過規范化栽培，太子參產量可提高30%以上，已進行了大面積推廣應用。

參考文獻

［1］國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部） ［S］. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 69.

［2］康傳志， 周濤， 郭蘭萍， 等. 全國栽培太子參生態適宜性區劃分析［J］. 生態學報， 2016， 36（10）： 29342944.

［3］陳菁瑛， 黃穎楨， 劉保財，auyPFY7LGSOY5GS6xcN83O3Jg1vMs7s7EmydIEx28mM= 等.福建太子參常見病害與綠色防控技術［J］.安徽農業科學， 2021， 49（12）： 152155.

［4］徐宏輝. 閩東山區太子參兩大病害發生特點及其綠色防控技術［J］.中國植保導刊， 2015， 35（1）： 3942.

［5］宋榮浩， 濮祖芹. 太子參病毒病的防治途徑［J］. 上海農業學報， 1995（3）： 5962.

［6］王蓉， 李勇， 魏若凡， 等. 我國太子參主產區病毒病發生情況調查［J］.植物保護， 2022， 48（1）： 204210.

［7］朱艷， 周小華， 秦民堅. 太子參病毒病及其脫病毒研究進展［J］.中國野生植物資源， 2005， 24（2）： 3132.

［8］吳朝峰， 馬雪梅， 林艷銓. 太子參莖尖脫毒培養及增產效果［J］.福建農林大學學報（自然科學版）， 2006（2）： 129133.

［9］趙云青， 黃穎楨， 陳菁瑛， 等. 一種利用微莖尖與超低溫脫除太子參蠶豆萎蔫病毒的方法： CN109845644A ［P］. 20190607.

［10］匡云波， 陳滿足， 陸伊榮， 等.太子參蕪菁花葉病毒和蠶豆萎蔫病毒的雙重RT-PCR檢測［J］.園藝學報， 2017， 44（4）： 784791.

［11］葉祖云， 阮少江， 高文， 等. 太子參種子特性及種胚離體誘導培養技術研究［J］.種子， 2010， 29（11）： 68.

［12］葉祖云， 王雅英， 田惠橋.太子參試管微塊根形成及其應用初探［J］.植物生理學通訊， 2009， 45（3）： 263266.

［13］LOMBARDI E M， PETERS J， JACOB L， et al. Wild and weedy Hesperis matronalis hosts turnip mosaic virus across heterogeneous landscapes in upstate New York ［J/OL］. Virus Research， 2023， 323： 199011. DOI：/10.1016/j.virusres.2022.199011.

［14］劉勇， 李凡， 李月月， 等. 侵染我國主要蔬菜作物的病毒種類、分布與發生趨勢［J］.中國農業科學， 2019， 52（2）： 239261.

［15］TAVOOSI M， MORADI Z， MEHRVAR M. First report of turnip mosaic virus infecting saffron in Iran ［J］. Virus Disease， 2022， 33（4）： 489491.

［16］MALIK A I， SOPHEARITH S， DELAQUIS E， et al. Susceptibility of cassava varieties to disease caused by Sri Lankan cassava mosaic virus and impacts on yield by use of asymptomatic and virus-free planting material ［J/OL］. Agronomy， 2022， 12（7）： 1658.DOI：10.3390/AGRONOMY12071658.

［17］YANG Chuanbao， YAN Keru， MA Changnian， et al. Insight into the root growth， soil quality， and assembly of the root-associated microbiome in the virus-free Chrysanthemum morifolium ［J/OL］. Industrial Crops and Products， 2022， 176： 114362. DOI： 10.1016/j.indcrop.2021.114362.

［18］張曉麗， 李萍， 周彩云， 等. 懷地黃脫毒種苗大田生長性狀及產量品質［J］. 植物學報， 2017， 52（4）： 474479.

［19］肖穎， 商天奕. 息半夏脫毒技術研究及應用［J］. 信陽農林學院學報， 2019， 29（3）： 8284.

（責任編輯：田喆）