‘44號’抗蟲黑楊基于根段組培再生和遺傳轉化體系的建立

摘要：[目的]以美洲黑楊和轉BtCry1Ac歐洲黑楊的雜交子代‘44號’抗蟲黑楊作為試驗材料，采用無菌苗根基部為外植體，建立高效穩定的組培再生體系和黑楊遺傳轉化體系。[方法]以‘44號’抗蟲黑楊無菌苗0.5-1.0 cm的根基部為試驗材料，研究不同激素配比對根系不定芽的誘導和生根的影響，探索根系對草銨膦的臨界耐受濃度，以農桿菌介導法進行遺傳轉化，并通過B-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因染色實時監控和鑒定陽性植株。[結果]篩選出‘44號’抗蟲黑楊根系誘導不定芽最優培養基為：WPM+20 g·L-1蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+0.25 mg·1-1 6-BA+ 0.05 mg·L-1 NAA，分化率為86.67%；不定芽生根的最優培養基為：WPM+ 0.075 mg·L-1NAA+7g·L-1瓊脂+0.1 g·L-1 AC，生根率為75.00%。通過根系草銨膦抗性篩選梯度試驗，確定根系對草銨膦篩選最適遺傳轉化篩選濃度為0.8 mg·L-1。采用農桿菌介導法將外源基因轉入到根中，經不定芽誘導和生根兩個階段獲得再生植株苗，經特異引物進行PCR鑒定，31個外植體中陽性植株為9株，轉化效率為29.0%。[結論]建立了‘44號’抗蟲黑楊根系的再生和遺傳轉化體系，為黑楊派楊樹的高效基因轉化提供了途徑的同時，也為以‘44號’抗蟲黑楊為基礎，通過轉基因技術聚合更多的優良性狀，提供了重要的技術支撐。

關鍵詞：‘44號’抗蟲黑楊（P. deltoides cl．‘Danhong'x P．nigra）；美洲黑楊；歐洲黑楊；根系侵染；遺傳轉化；組培再生；GUS染色

中圖分類號：S722;S792.11 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0074-11

楊樹（Populus）是中緯度平原地區木材產量最高、種植面積最大的速生用材樹種之一，具有生長快、成材早和產量高等特點。人工林是我國木材供應的主要來源，從2007年開始，我國楊樹人工林總面已經達到700萬hm，其中美洲黑楊（Populus deltoides Marsh.）占據主導地位。隨著楊樹人工林規模的不斷擴大和集中種植，以舞毒蛾（Lymantria dispar）、楊尺蠖（Malacosomaneustria）和天牛（Coleoptera）等為主的多種森林病蟲害開始蔓延肆虐，對林業經濟和生態系統造成重大損失。我國非常重視楊樹病蟲害研究，1989年獲得首例轉BtCry1Ac（Bt）基因歐洲黑楊（P．nigra），田間試驗證明其對楊尺蠖等具有很好的抗性，同時也具有生長快速的特性。由中國林業科學研究院林業研究所培育的轉Bt基因歐洲黑楊目前已進入產業化應用階段，能夠有效抵抗食葉害蟲的危害。此外，美洲黑楊速生良種丹紅楊（P．deltoides c1．‘Danhong，）與轉Bt歐洲黑楊的雜交子代被報道能夠顯著抵抗舞毒蛾的蟲害，同時具有生長快速的特性。在這些雜交子代中，‘44號，抗蟲黑楊（P．deltoides c1．‘Danhong，xP．nigra L．）表現尤為突出，成為集速生、耐水濕和抗蟲等多種優良性狀的優良楊樹品種，在推廣種植方面具有優勢。

隨著我國楊樹人工林不斷向困難立地擴展，并面臨木材市場的多元化需求，楊樹良種需要不斷更新，如選育抗逆性強、經營成本低、木材密度提高或纖維含量增加等楊樹新品種。常規育種效率低、周期長，而通過基因工程手段實現林木優良性狀聚合育種已成為林木育種的重要技術途徑，也是楊樹新品種創制的新趨勢?；蚬こ逃N的關鍵在于遺傳轉化體系的建立。如前所述，‘44號’抗蟲黑楊集合了速生、耐水濕和抗蟲等多種優良特性，選擇‘44號，抗蟲黑楊作為遺傳轉化受體，通過基因工程手段，進一步聚合優質、抗逆等其它優良性狀，有望創制突破性楊樹新品種。因此，‘44號’抗蟲黑楊遺傳轉化體系的建立對于優良性狀聚合育種具有重要意義。

目前比較成熟的楊樹遺傳轉化體系多為以84K楊等白楊派物種為遺傳轉化受體，采用的轉化方法多是葉盤法，轉化效率可以達到35.0%左右。此外，直接侵染愈傷組織的遺傳轉化方法也有報道。歐美楊107具有與‘44號，抗蟲黑楊相似的黑楊派遺傳背景，它的遺傳轉化方法主要是通過葉盤法將組培苗的葉片、莖段和葉柄作為試驗材料進行侵染來實現。然而其優化后的遺傳轉化體系的轉化效率僅有10.0%?；蚓庉嫾夹g在林木育種應用方面，需要獲得等位基因都發生編輯的“純合體”，由于遺傳轉化效率低下的原因，所以需要獲得更多的轉基因植株來進行篩選，確保篩選到理想的“純合體”。因此，‘44號，抗蟲黑楊遺傳轉化體系的建立需要嘗試新的遺傳轉化方法，以大幅提高轉化效率。

前期利用葉盤法和愈傷組織轉化的方法對‘44號，抗蟲黑楊進行遺傳轉化均未成功，誘導出不定芽很困難，但在轉化過程中發現利用‘44號’抗蟲黑楊根系進行不定芽和愈傷組織誘導效率較高。此前有報道表明，對草本植物橡膠草（Ficus elasticaRoxb.）和小冠花（Passiflora foetida L．）、塊莖植物甘薯（lpomoea batatas L.）、木本植物臭椿（Ailanthus altissima （Mill．） Swingle）等的外植體根系進行侵染，可以獲得陽性轉基因植株。因此，本研究試圖通過根系再生途徑，對‘44號’抗蟲黑楊進行轉化，以建立高效的遺傳轉化技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本研究以1月齡的‘44號，抗蟲黑楊組培苗的根系和剪去根尖的根基部為材料，根系剪切成1.0 cm長的小段、根基部保留0.5～1.0 cm進行試驗。試驗所需農桿菌菌株采用EHA105；載體為pCAMBIA3300-GUS，攜帶GUS蛋白和潮霉素篩選標記；WPM固體培養基（L449）；AC（活性炭）；KT、NAA用1 mol·L-1 KOH溶解加無菌水分別配制成2 mg·mL-1母液并4℃保存；6-BA、TDZ用1 mol·L-1 KOH溶解加無菌水配制成1 mg·mL-1母液并4℃保存；IBA、2，4-D用無水乙醇分別配制成1 mg·mL-1、2 mg·mL-1母液并4℃保存；潮霉素（H370）為Phytotech的50 mg·mL-1濃度的溶液，并-20℃保存；卡那霉素用無菌水配制50 mg·mL-1母液并-20℃保存，特美汀用無菌水配制200 mg·mL-1母液并-20℃保存；乙酰丁香酮和利福平直接用二甲基亞砜溶解分別配制成100 mmol·L-1、50 mg·mL-1母液并-20℃保存。所有培養基pH調至5.9～6.0，除6-BA、2，4-D、KT、NAA激素外，其余激素和抗生素均過濾除菌。

1.2 '44號’抗蟲黑楊根系再生

1.2.1 外源激素對‘44號，抗蟲黑楊生根的影響

將1月齡‘44號’抗蟲黑楊的幼苗取帶頂芽的1.5～2.0 cm莖段接種到含有不同NAA（0.025～0.1 mg·L-1）、IBA（0，0.05 mg·L-1）配比的生根培養基（WPM+10 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.1 g·L-1 AC，pH 5.9）上，在2 100～2 300 lx光照條件下培養1個月，統計接種材料的生根情況，每個組合9個帶頂芽莖段，共進行3次實驗重復。生根率計算如下：生根率公式：Rs=（R/N）×100%，式中：Rs為生根率，R為生根的不定芽數，N為接種的不定芽數。

1.2.2 外源激素對‘44號，抗蟲黑楊根系不定芽誘導的影響

選取剪切成長度2 cm左右無菌苗頂芽或莖段，扦插在生根培養基上生長1個月大小的‘44號，抗蟲黑楊的根系，剪切成1.0 cm的小段，放置到含有不同6-BA（0.25～0.75 mg·L-1）、TDZ（0，0.05 mg·L-1）配比的分化培養基（WPM+20 g·L-1蔗糖，pH 5.9）上，在2 100～2 300 lx光照條件下培養1個月，統計芽的再生效率，共進行3次實驗重復。出芽率計算如下：γ＝（n/M）×100%，式中：y為出芽率，n為出芽的外植體數，M為共放置培養的外植體數。

1.3 '44號，抗蟲黑楊除草劑濃度的選擇

選取健康、生長狀態一致的‘44號，抗蟲黑楊無菌組培苗根系剪切成0.5～1.0 cm長度大小的根段，分別接種到含有不同濃度草銨膦（0、0.4、0.8、1.2和1.6 mg·L-1）的分化培養基上，觀察根段的生長狀態和誘導出不定芽的情況。每個處理接種18個根段，30 d后觀察根段生長狀況，統計不同濃度草銨膦培養基上根段發芽數量和褐化情況，確定草銨膦最適抑制濃度，共進行3次實驗重復。褐化率計算如下：RB=（B/T）×100%，式中：RB表示褐化率，B為褐化的外植體數，丁為共放置培養的外植體數。

1.4 農桿菌介導‘44號，抗蟲黑楊的遺傳轉化

1.4.1 農桿菌菌液的制備

將攜帶GUS報告基因的pCAMBIA3300表達載體轉入農桿菌菌株EHA105中，涂板2d后挑單菌落于1 mL液體LB培養基（卡那霉素50 mg·L-1、利福平50 mg·L-1）中，28℃下210 r.min-1條件下震蕩過夜培養，取200 μL接種到50 mL液體LB培養基（卡那霉素50 mg·L-1、利福平50 mg·L-1）中繼續培養10～12 h，至菌液OD600為0.6左右。4 000 r·min-1離心10 min，用重懸液（WPM+20 g·L-1蔗糖+1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1 KT，pH 5.6）懸浮農桿菌00600至0.3～0.5左右。

1.4.2 侵染與共培養

選取生長30 d左右，狀態健康的‘44號，抗蟲黑楊無菌組培苗，對無菌組培苗進行剪切，保留根莖連接處向上莖部分2.0 cm左右即可，莖上如有小芽可保留，去除植株下部的根系尖端，剪去根下部后剩余根基部0.5～1.0 cm的部分作為侵染的外植體，將外植體直接放到LB菌液或重懸液中，侵染10～15 min，用無菌濾紙吸去多余菌液，放到到共培養培養基（WPM+20g·L-i蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+1 mg·L-12，4-D+0.1 mg·L-1KT+100μmol·L-1 AS，

pH 5.9）中，24-27℃暗培養48 h。

1.4.3 抗性根系誘導

共培養結束后，用無菌濾紙吸取根系上過多的菌液，隨后將莖根基外植體移至生根培養基（WPM+10 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+1 mg·L-1草銨膦+ 800 mg·L-1特美汀，pH5.9）中，2 100～2 300 lx光照條件下進行培養，培養10～20 d左右，直至新的抗性根系生長到3.0～5.0 cm左右。

1.4.4 抗性根系不定芽誘導

將由根基部和根系剪切傷口處生長到3.0～5.0 cm左右的抗性根系剪切成約1.0 cm左右的3段，并將抗性根系小段移至分化培養基（WPM +20 g·L-1蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+0.6 mg·L-1 6-BA+0.06 mg·L-1 NAA+0.8 mg·L-1草銨膦+ 800 mg·L-1特美汀，pH 5.9）上進行不定芽的誘導，2 100～2 300 lx光照條件下進行培養，培養1-2個月左右，直至新的抗性不定芽生長到0.5～1.0 cm左右。

1.4.5 抗性不定芽的生根

切取1個或相距較遠的2個不定芽誘導生根，以保證每一個芽都來自一個獨立轉化事件?？剐圆欢ㄑ拷臃N到生根培養基（WPM+10g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.025 mg·L-1、NAA+ 0.05 mg·L-1 IBA+ 0.1 g·L-1 AC+ 0.8 mg·L-1草銨膦+ 800 mg·L-1特美汀，pH 5.9）上，2 100～2 300 lx光照條件下進行培養，根基部和根系剪切傷口處產生的同一條根誘導產生的不定芽分別取1和2株進行接種生根。

1.5 轉基因植株的檢測

1.5.1 GUS染色鑒定

GUS染液的配制：首先，配制20 mmol·L-1的Na3PO4（pH 7.2）：6.2 mL的0.2 mol·L-1的Na2HPO4和3.8 mL的0.2 mol·L-1的NaH2PO4混合，并加入88 mL的純水，混合后，充分溶解；然后，1 mmol·L-1的5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷（X-Gluc）的配制為：100 mg的X-Gluc用1.92 mL的DMF進行溶解；最后，進行混合配置總量為100.2 mL的使用染液：取20mmol·L-1的Na3PO4 （pH 7.2） 97 mL;1 mmol·L-1的K3Fe（CN）6 1 mL;1 mmol·L-1的K4Fe（CN）61 mL;曲拉通X-100 （Triton X-100） 0.2 mL;1 mmol·L-1 X-Gluc 1 mL。

取完整的抗性植株和野生型植株組培苗放入不同的50 mL離心管進行GUS染色鑒定，加入配制好的GUS染液（完全覆蓋材料），用鋁箔紙覆蓋包住，37℃過夜染色。將染色好的材料轉入90%酒精中脫色2次，再轉入75%酒精中脫色1次，直至葉綠素完全溶解到酒精中。GUS染色實時監控和追蹤觀察的染色方法也是此方法。

1.5.2 PCR鑒定

提取在抗性生根培養基上生長了1個月左右的抗性幼苗，同時取野生型植株和抗性植株1.0～2.0 cm2大小的葉片，用CTAB法提取DNA，并設計抗除草劑基因的特異性引物進行PCR鑒定，擴增片段長度為242 bp（bar-F： AGTCGACCGTGTACGTCTCC;bar-R：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC）。轉化效率的計算如下：η=（W/Q）×100%，式中，η為轉化效率，W為獲得陽性植株數，Q為接種外植體數。

1.6 數據分析

使用Excel 2013軟件進行數據統計，使用IBMSPSS Statistics 27軟件進行不同處理間的差異顯著性分析（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 外源激素對‘44號，抗蟲黑楊的組培再生體系的影響

2.1.1 外源激素對‘44號’抗蟲黑楊生根的影響

將生長1個月左右的‘44號’抗蟲黑楊的幼苗取帶頂芽的1.5～2.0 cm莖段接種到含有不同NAA、IBA配比的生根培養基上進行培養。結果顯示，在培養基中只添加NAA的生根效率總體高于同時添加IBA和NAA，并且當NAA濃度大于或等于0.05 mg·L-1時，生根率隨著NAA濃度的升高而提高；當NAA濃度小于或等于0.05 mg·L-1時，生根率隨著NAA濃度的升高而下降（表1）。但是對于不同組合的生根率存在明顯差異，其中在NAA 0.025 mg·L-1與IBA 0.05 mg·L-1（組合1）濃度下，生根率和平均側根數在8個組合中均是最佳效率和數量，因此，處理1（NAA 0.025 mg·L-1，IBA 0.05 mg·L-1）是最適宜‘44號，抗蟲黑楊生根的生長素濃度。同時，根據主根和側根的生長情況，發現，當NAA濃度小于0.075 mg·L-1時，側根數量隨著NAA濃度的升高而升高（表1）。在處理1條件下，側根數量達到最多，同時生根率也達到最高，達到75.00%（表1）。在處理7條件下，主根數量達到最多，并且側根數量也相對較高（表1）。以上結果表明，最優的生根培養基為WPM+10g·L-1蔗糖+ 0.025 mg·L-1 NAA+0.05 mg·L-1IBA+0.1 g·L-1 AC和WPM+10 g·L-1蔗糖+0.075 mg·L-1 NAA+0.1 g·L-1 AC，pH二5.9（表1）。

2.1.2 外源激素對‘44號’黑楊根段誘導不定芽分化的影響

選取剪切成長度2 cm左右無菌苗頂芽或莖段，扦插在生根培養基上生長1個月大小的‘44號’抗蟲黑楊的根系，剪切成1.0 cm大小的小段，放置到含有不同6-BA、NAA、TDZ配比的分化培養基上進行培養。試驗顯示：在不同激素配比的培養基上，不定芽出芽效率最高的是4號配比（6-BA為0.25 mg·L-1，TDZ為0 mg·L-1，NAA為0.05 mg·L-1），其出芽率達到了86.67%；其次是5號，其出芽率為73.33%（表2）。同時通過實驗發現不添加TDZ更有利于‘44號，抗蟲黑楊根系的不定芽誘導，TDZ的添加并沒有出現出芽率提升的結果，并且出芽率降低，并且隨著6-BA的升高出芽率不斷降低，可能是由于根系細胞已經具有很強的生長和分裂活性，不需要外源添加細胞分裂素來促進根系的不定芽的誘導。綜合以上結果，‘44號’抗蟲黑楊最佳不定芽誘導培養基為WPM+20 g·L-1蔗糖+ 7.8 g·L-1瓊脂+ 0.25 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA，pH=5.9.

2.2 除草劑草銨膦濃度的選擇

在含有0.4、0.8、1.2和1.6 mg·L-1草銨膦的分化培養基上培養30 d以篩選不定芽誘導的最適草銨膦濃度。結果顯示：在不定芽誘導階段，當草銨膦濃度在0.8 mg·L-1以下時，根段會發生膨大，可以正常誘導出不定芽（圖1a、f）；當草銨膦為0.8 mg·L-1時，根段膨大被明顯抑制（圖1c、g），同時不定芽誘導也受到明顯抑制，不能誘導出芽（圖1b-e）；而當草銨膦濃度大于0.8 mg·L-1時，外植體根段幾乎不膨大，無法正常誘導出不定芽，并開始出現褐化的情況（圖1c～e）。以上研究結果表明，不定芽誘導過程中草銨膦最適篩選濃度為0.8 mg.L-1左右（表3）。

2.3 農桿菌介導的‘44號，抗蟲黑楊遺傳轉化及轉基因植株分子檢測

如圖2所示選取生長至1個月左右的‘44號’抗蟲黑楊，剪掉根系尖端，留0.5～1.0 cm的根基部進行農桿菌侵染；侵染10～15 min后，無菌濾紙吸干凈材料上殘留的菌液；共培養基上暗培養48 h后，外植體邊緣長出農桿菌，用無菌濾紙吸除多余的農桿菌后放到到0.8 mg·L-1的草銨膦生根培養基中再生抗性根；培養10～20 d后，抗性根系長度達到3.0～5.0 cm; GUS染色實時監控和追蹤觀察能夠快速的判斷轉化情況，如在完成侵染后的染色或共培養結束后的染色或侵染完成后進行再生根后新生根系的染色等，新生的根系為陽性時，整個根系表現為陽性，快速確定侵染條件優劣（圖3）；抗性根系剪切成1.0 cm左右大小的根段，轉移到0.8 mg·L-1的草銨膦分化培養基中，1-2個月后產生不定芽；0.5～1.0 cm左右大小的不定芽轉移至0.8 mg·L-1的草銨膦生根培養基，1周左右生根。從農桿菌侵染根基部至產生抗性不定芽需要約2-3個月時間。

采用GUS染色檢測了陽性轉化植株，如圖4所示，GUS染色后，轉基因植株可以觀測到明顯的GUS信號，與之相反，未轉基因植株沒有檢測到GUS信號（圖4a、b）。隨后，利用特異性引物通過PCR擴增草銨膦抗性基因的片段，進一步鑒定轉基因陽性植株。共檢測了31個外植體獲得的再生植株，其中，能夠GUS染色和擴增出草銨膦抗性基因片段的植株為9株，可確認為轉化成功植株。每次接種的根段數為16個，根據所獲得的陽性植株的株數來計算轉化效率，轉化效率為29.0%（圖4c）。

3 討論

3.1 高效穩定的‘44號’抗蟲黑楊組培再生體系

分子育種經過多年的發展，已經在品種改良和優良性狀聚合方面展現出良好的發展勢頭，如水稻淀粉品質的改良，林木抗病、抗蟲、耐干旱和木材性質改良，抗食葉害蟲轉基因楊樹品種進入環境釋放及商業化應用階段等等。黑楊作為我國楊樹人工林主要造林樹種，具有多種優良性狀。但是黑楊的遺傳轉化困難、效率低下、周期長，限制了黑楊基因工程育種的發展。本研究以‘44號’抗蟲黑楊根為外植體，先誘導不定根再誘導不定芽，建立了高效的遺傳轉化體系，為后期通過基因工程技術將外源基因整合到已經具有多種優良性狀的‘44號’抗蟲黑楊中，實現多種優良性狀聚合奠定了基礎。

在植物組織培養中，植物激素發揮重要作用，如NAA能夠有效誘導生根，KT、ZT、IBA、IAA等對不定芽的誘導有一定作用，6-BA，NAA和GA則對珠心、胚珠培養物的生根有良好的作用，相反，2，4-D對芽和根的誘導有抑制作用。同時，還有一些不常用的激素，如乙烯和脫落酸（ABA）可以控制生根過程，乙烯和ABA可以抑制植物細胞的伸長。在本研究中，通過設置不同激素配比的培養基來探索適合‘44號，抗蟲黑楊根系不定芽誘導和轉基因苗生根的培養基。TDZ是一種人工合成的多功能植物激素，被廣泛應用于木本植物，認為能夠促進不定芽的增殖和愈傷組織的形成。在不定芽的誘導過程中，保持0.05 mg·L-1NAA的比例不變，通過是否添加0.05 mg·L-1 TDZ搭配0.25、0.5、0.75 mg·L-1 6-BA的濃度梯度篩選最佳的不定芽誘導培養基。本研究發現添加0.05 mg·L-1 TDZ不僅不能促進不定芽的誘導反而有抑制作用，推測原因可能是培養基中添加的6-BA和NAA，或者根中內源激素水平，已經可以滿足根段不定芽誘導的需求，再添加TDZ后致使激素濃度過高，打破不定芽誘導的激素需求平衡，過多的細胞分裂素導致細胞增值反而不利于芽的分化。在不添加TDZ的情況下，出芽率隨著6-BA濃度的提高而降低，且0.25 mg·L-1的6-BA可以有效促進不定芽的產生，效率可高達86.7%。不定芽生根是完整植株的最后一步，該過程中細胞分裂素與生長素具有相反的作用，前者抑制而后者促進，兩者之間比例關系的變化會產生不同的作用。如在礬根扦插生根過程中，單一的IBA就能夠很好的促進生根，而半夏組培苗的生根則是IBA和NAA按照一定比例才能夠達到最理想的生根效果H2l。本研究通過是否添加0.05 mg·L-1IBA配合0.025、0.05、0.075、0.1 mg·L-1 NAA的濃度梯度來篩選最佳的誘導不定芽生根培養基。發現不管是否添加IBA，不定芽生根均隨NAA含量的增加先降低后升高。但在IBA存在時，0.025 mg·L-1 NAA就能有效促進生根，而當IBA不存在時，0.1 mg·L-1 NAA才能促進不定芽高效生根，反映出IBA的存在能夠促進‘44號’抗蟲黑楊根系NAA誘導的不定芽生根。值得一提的是，優化后‘44號，抗蟲黑楊根系不定芽的生根率可提高到75.0%。

3.2 ‘44號’抗蟲黑楊遺傳轉化體系的建立

植物的遺傳轉化要高效獲得轉基因陽性植株，抗性篩選壓的確定至關重要，抗性篩選試劑濃度過高不利于不定芽的誘導及芽的正常生長，過低不能有效篩選出抗性植株。草銨膦是一種在世界范圍內廣泛使用的內吸型除草劑，具有廣譜、高效和低毒的特點，利用草銨膦進行抗性篩選已經在油菜、蓖麻和楊樹等多種植物上進行，不同植物對草銨膦的抗性存在較大差異，如在84k楊中篩選壓濃度范圍在2～8 mg·L-1，相較于黑楊濃度0.8 mg·L-1偏高。本研究中所用載體攜帶的BAR基因是一種抗草銨膦的基因，來自于土壤細菌吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus），可以使植物體內的草銨膦自由氨基乙酰化從而降低草銨膦毒性。本研究發現草銨膦對根段不定芽的誘導具有顯著的抑制作用，在濃度0.8 mg·L-1時，添加了草銨膦的根段均未出芽。表明草銨膦對根段不定芽的誘導具有很強的抑制作用，這與已報道的草銨膦對84K楊葉片不定芽誘導的影響具有相似性，但不像對根段抑制的這么強烈，當濃度升到2 mg·L-1時才會出現完全抑制的情況。

本研究成功建立了抗蟲‘44號’黑楊根段侵染的遺傳轉化方法。楊樹中常用的葉盤法和愈傷組織轉化方法，在葉和愈傷組織獲取階段就需要1-2個月時間，而根段侵染遺傳轉化方法所用的根系材料豐富，僅需莖誘導7～10 d。根段還具有較強的補充損傷或干細胞再生的潛力，細胞全能性的特性突出，可以作為較好的受體材料。另外，在侵染完成后，根段不定芽產生較快，在分化培養基上僅需1-2個月就可產生不定芽，整個遺傳轉化周期可控制在3個月左右，且較之前報道的黑楊遺傳轉化方法平均陽性率提升接近30.0%。黑楊通常被認為難以進行遺傳轉化、轉化效率低下，本研究建立的遺傳轉化方法克服了這一難題，可以為后續其他黑楊品種以及難轉化的木本植物遺傳轉化體系的建立和優化提供思路。值得一提的是，根系侵染具有不受外植體材料生長環境限制、轉化后生長快、鑒定和檢測方便以及不定芽產生快等優勢。

本研究中使用GUS基因作為轉化材料的指示，能夠穩定高效表達，且不需要借助特定的設備。表達蛋白的表達載體以方便在遺傳轉化的前期和后期對轉基因材料進行鑒定，快速獲取轉化的根用于芽的誘導，即在遺傳轉化的早期，就可采用GUS染色對侵染后的根系進行鑒定，不僅可以對轉化效率進行隨時判斷，而且可以取一部分侵染根段GUS染色進行初篩，選擇陽性的根開展后續的不定芽誘導及植株再生，有效減少了轉基因植株的假陽性。因此，在‘44號’黑楊遺傳轉化體系建立中GUS報告基因的應用不僅保證了轉化的效率，而且為陽性鑒定提供了快速、方便的方法。

4 結論

本研究建立了‘44號，抗蟲黑楊基于根段的組培再生體系，誘導莖段生根率達到75.00%，根段出芽率達到86.67%，為黑楊和其他難以進行組織培養的木本植物提供新的外植體選取思路和有效的技術支撐。同時，建立了農桿菌介導的‘44號’抗蟲黑楊遺傳轉化體系，確定了最適的草銨膦篩選濃度，轉化效率達到29.0%，為黑楊的基因功能研究、基因聚合育種提供了關鍵技術體系，也為其他木本植物在克服遺傳轉化瓶頸的關鍵環節提供了參考。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家重點研發計劃“林木多性狀高效聚合育種技術”（2021YFD2200205）國家級；浙江省“十四五”育種專項林木協作組 課題（2021C02070-1）省市級